CN101736078A - 一种核酸等温扩增检测结核分枝杆菌活菌的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种核酸等温扩增检测结核分枝杆菌活菌的方法及其试剂盒，检测步骤依次包括：结核分枝杆菌mRNA模板在60～70℃下解链后降温；加入逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶，在引物的引导下于37～42℃进行等温扩增，获得RNA扩增子；然后利用纳米金探针和捕获探针检测扩增子，通过层析杂交显色反应获得检测结果。杂交膜出现显色条带为mRNA阳性(有活菌存在)，无条带为阴性。采用本方法的试剂盒可检测结核分枝杆菌活菌，具有准确灵敏、简便快速等优点，能克服已有方法鉴定时间长、操作复杂、特异性低等不足，可作为结核病诊断和预防、治疗疗效观察、抗结核药物筛选和敏感性实验等相关研究的辅助实验手段。

Description

一种核酸等温扩增检测结核分枝杆菌活菌的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及结核分枝杆菌活菌核酸扩增检测技术。

背景技术

自1882年Koch发现结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是结核病的病原菌以来的100余年，人类对结核分枝杆菌的生物学特性、致病机制、耐药机制、诊断方法、抗结核药物的研制等方面都取得了巨大的成就。而如今，结核病仍然是影响人类健康流行性最广、病死率最高的感染性疾病之一。寻求快速、准确的诊断方法一直是结核病学首要研究的领域。

近10年来，随着分子生物学的发展，对结核分枝杆菌DNA的检测研究颇多，和培养方法比较，DNA检测的高敏感、高特异和快速性给结核病的诊断带来新的期望。但DNA作为半衰期较长的稳定核酸分子，据研究报道，在接受标准有效治疗的肺结核患者痰标本中，培养转阴后180天仍有25％的标本DNA检测阳性。可能的原因解释是标本中有死菌和DNA降解的延滞、L型培养以及持留菌和休眠菌的存在等。可见，以DNA为基础的检测，存在平台效应，不能用于结核分枝杆菌的活菌诊断。

核糖体RNA(rRNA)是生物细胞核糖体内的遗传物质，在原核生物中有多个拷贝存在，每个结核分枝杆菌的rRNA有近5000个拷贝。有学者在观察分枝杆菌体内外死亡降解的过程时发现，核糖体是第一个伴随细菌活力消失而降解的超微结构，因而认为rRNA可作为结核分枝杆菌的活菌标志。Van derVliet等通过体外扩增16S rRNA进行分枝杆菌活菌检测和药敏试验时发现，该方法能在3～7天内获得药敏试验结果，可计算出各种药物的药效学参数。但Hellyer等(J Clin Microbiol，37(2)：290-295，1999)的研究结果显示结核分枝杆菌的rRNA水平在含药培养基中72h内无明显变化。Moore等(J ClinMicrobiol，34(7)：1745-1749，1996)通过临床观察发现，rRNA也显示平台效应。所以，rRNA在用于结核分枝杆菌药敏试验和化疗监测时仍存在很大的局限性，也不能用于结核分枝杆菌的活菌诊断。

原核生物的mRNA分子，半衰期很短(仅有3～5min)，仅存在于活的、有代谢活性的菌体中，一般认为mRNA是一活性增殖细胞的很好的分子标记物。所以，以mRNA为靶标的检测只能是活菌，是监测药物敏感性和化疗反应的很好的分子指标。结核分枝杆菌的85-B mRNA编码的蛋白85-B，是结核分枝杆菌的主要分泌性蛋白抗原复合物85的组成之一，该抗原复合物作为结核分枝杆菌的特异性分泌蛋白，在液体培养基和巨噬细胞系统中表达非常丰富，所以活菌细胞内存在丰富的85-B mRNA分子。Desjardin等(Am J RespirCrit Care Med，160：203-210，1999)研究了经药物治疗肺结核患者痰液样本中提取的结核分枝杆菌85-B mRNA、16S rRNA以及IS110DNA含量和涂片染色、培养结果的关系，显示涂片培养测得的活菌数量与85-B mRNA含量相关性最好。因此，选择85-B mRNA为靶标可准确检测结核分枝杆菌的活菌。

在核酸检测过程中，多数情况下样本中的核酸含量较低，为了使检测达到一定的灵敏度和准确度，需要对样本中的待测核酸片段进行有效扩增，目前聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)和进一步发展的实时荧光PCR技术已经成为核酸扩增检测的主流技术手段，用于核酸模板的扩增及定性定量检测。虽然实时荧光PCR技术检测具有灵敏、快速的优点，但检测时需昂贵的循环变温设备、操作严格分区等因素而限制了其在基层医院的推广使用。目前，采用实时荧光PCR技术检测结核分枝杆菌，扩增的是样本中的总DNA，不能剔除样本中的死菌，因此不能用于结核分枝杆菌的活菌检测。

1991年Compton提出了基于核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid SequenceBased Amplification，NASBA)(Nature，350(6313)：91～92，1991)，为基因扩增技术提出了新的概念。该技术是以RNA分子的逆转录-转录为技术主线，通过单向恒温扩增，短时间内形成相当于原RNA拷贝数近百万倍的RNA扩增子，最后扩增产物通过电化学发光仪器检测。1997年，Gen-Probe公司也开发了与NASBA原理类似的转录介导扩增技术(Transcription MediatedAmplification，TMA)(Journal of Clinical Microbiology，35(3)：676-678，1997)，其与NASBA的核酸扩增方法原理相同，而TMA的扩增结果是通过杂交保护测定(Hybridization Protection Assay，HPA)技术进行定性检测。NASBA和TMA等核酸恒温扩增检测技术无需进行类似于PCR过程的温度循环，因此扩增不需要复杂昂贵的荧光PCR仪器；同时由于扩增模板是RNA，即使在有DNA污染或存在的情况下，同样具有较高的特异性和灵敏度。

纳米金探针检测技术是一种新型的核酸检测方法，它利用纳米金颗粒标记的寡核苷酸探针与核酸靶序列杂交，形成伸展的纳米金颗粒一多核苷酸的多聚网络结构，由此引发纳米金粒子光学性质的变化，产生杂交信号以杂交液/板/试纸颜色变化显示，存在相互作用的杂交液/板/试纸显示为蓝色或蓝紫色，没有作用的显示为红色，微量核酸通过杂交信号的放大从而被检测。如果纳米金探针检测技术结合NASBA或TMA等类似RNA等温扩增技术，微量模板可通过扩增的模板拷贝数和纳米金探针检测的显色信号两级放大而得到检测。基于这种RNA核酸等温转录扩增和纳米金探针检测方法(Nucleic AcidIsothermal and Transcriptional Amplification with Gold Nano-particle Probes，NITAG)，扩增检测结核分枝杆菌的85-B mRNA模板，就能实现结核分枝杆菌的活菌检测，该技术具有无需特殊昂贵设备、检测灵敏快速、结果直观可见等优点，适合于基层医疗机构的推广应用，目前NITAG技术在活菌检测中应用尚无报道。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于NATAG技术的结核分枝杆菌活菌检测方法和试剂盒，为结核分枝杆菌活菌的检测、治疗药物疗效观察、抗结核药物筛选和药敏实验等研究的提供辅助实验手段。结核分枝杆菌的药物敏感性试验，特别是治疗疗效的评价对活菌的存在有严格的依赖性，因此，结核分枝杆菌活菌的检测具有重要的临床意义及广泛的应用价值。

技术方案

本发明提供一种基于NITAG技术扩增结核分枝杆菌活菌靶基因85-BmRNA的寡聚核苷酸引物对和探针，其中引物对具有SEQ ID NO：1和SEQID NO：2的序列(SEQ ID NO：25’端含有能被T7RNA聚合酶识别的启动子序列)；检测探针具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列(前者5’端和后者3’端分别经过己烷巯基化处理)，捕获探针具有SEQ ID NO：5的序列(5’端生物素Biotin标记)。

SEQ ID NO 1：5’-ggCTgCCAgACTTACAAgTg-3’

SEQ ID NO2：5’AATTCTAATACgACTCACTATAggg gTAggCggCCAAgATCATTg-3’

SEQ ID NO3：5’HS-(CH₂)₆-[TTgTCCgCCAACAgggCC]

SEQ ID NO4：5’[CgCTgCAATCggCTTgTCg]-(CH₂)₆-SH3’

SEQ ID NO5：5’BIOTIN-CCTTCCTgACCAgCgAgCTg-3’

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

在实施方案中，本发明提供一种基于NITAG技术的85-B基因扩增的检测样本中结核分枝杆菌的方法和试剂盒，所述方法包括步骤：

(1)mRNA模板在60～70℃下解链后降温；

(2)加入逆转录酶、RNase H和RNA聚合酶，在引物的引导下于37～42℃进行等温扩增，获得RNA扩增子；

(3)利用纳米金颗粒标记的寡核苷酸检测探针和生物素标记的寡核苷酸捕获探针检测RNA扩增子，通过在层析膜的显色反应获得检测结果，显色条带的存在是样品中结核分枝杆菌的指示。

本发明提供一种利用上述检测方法进行MTB mRNA等温扩增的检测试剂盒，其组成为：NITAG反应缓冲液、纳米金颗粒标记的寡核苷酸检测探针、生物素(或地高辛)标记的寡核苷酸捕获探针、以及固定有亲和素(或抗地高辛抗体)标记的层析膜。组装形成的试剂盒在-20℃下保存。

具体而言，本发明是通过以下方式实现的：

本发明的结核分枝杆菌mRNA NITAG检测技术包括样本处理、mRNA等温扩增以及纳米金探针检测三个步骤。样本处理步骤是从痰液、活检组织等样本或结核分枝杆菌培养物等待检样品中提取mRNA模板的过程，扩增检测对象是从样本中提取获得的mRNA模板。利用提取获得的结核分枝杆菌mRNA模板经过逆转录酶、核糖核酸酶H(RNase H)、RNA聚合酶(RNA Pol)等温扩增出的大量RNA扩增子，并结合烷巯基化寡核苷酸标记的纳米金探针检测，通过层析膜显色反应实现对RNA模板的检测。

本发明的等温扩增体系包括RNA模板、引物及缓冲液等组成，检测体系包括纳米金探针、捕获探针及缓冲液等组成，其具体操作为：将待测标本提取的RNA置入反应缓冲液，在60～70(最优选65)℃和37～42(最优选41)℃下先后处理5min，加入混合酶，在37～42(最优选41)℃下反应90～120min；然后再将RNA扩增产物与纳米金检测探针以及生物素标记捕获探针缓冲液混合检测，在37～65℃处理5min冷却后在膜上层析显色。

本发明的等温扩增反应缓冲液各组分的终浓度为：20～60mM Tris-HCl(pH8.0～9.0)、30～90mM KCl、10～20mM MgCl₂、0.5～5mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、1～10mM核糖核苷三磷酸(NTPs)、4～20mM二硫苏糖醇(DTT)、10～20％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)；所说的两种引物(包括带有RNA聚合酶启动子识别序列的引物I和第二链cDNA合成引物II)终浓度各为：0.1～1μmol/L；所说的混合酶液各组分在20μL反应体系中的量为：4～75U逆转录酶、8～3000U RNA聚合酶(识别特异启动子序列的T3RNA聚合酶或T7RNA聚合酶)、0.05～0.3U RNase H酶、10～50U RNA酶抑制剂(RNasin Inhibitor)和0.05～5μg小牛血清白蛋白(BSA)。所说的检测反应缓冲液各组分的终浓度为：0.3mol/L NaCl，10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，5μmol/L纳米金探针、1μmol/L生物素标记捕获探针。层析膜为固定有亲和素的硝酸纤维膜或尼龙膜(保存于干燥环境)。

本发明所用的纳米金颗粒大小为1～100nm，按照粒径不同可以采用柠檬酸三钠还原法、白磷还原法或者抗坏血酸还原法。

本发明所述纳米金寡核苷酸检测探针的制备过程为：

(1)纳米金颗粒的制备：在煮沸搅拌HAuCl₄溶液(1mM，500mL)回流的情况下，迅速加入50mL 38.8mM柠檬酸三钠溶液，溶液的颜色将由灰黄变为深红，继续回流15min，然后冷却至室温，最后用0.45μM的膜进行过滤，即得到约13nm粒径的金颗粒。这种纳米金溶液具有518～520nm处的特征表面等离子体吸收峰。纳米金颗粒上的寡核苷酸探针长度为10～100bp，连接前需要先经过巯基化或烷巯基化处理并纯化。

(2)3’或5’烷巯基标记的寡核苷酸在纳米金颗粒上的修饰：取纳米金溶液5mL(约17nm)2.5OD烷基寡核苷酸探针(由上海生工合成，稀释终浓度3.61μmol/L)混合并孵育16小时左右，然后将混合溶液置于0.1mol/L NaCl，10mM磷酸盐缓冲液中并保持40小时，接下来在1400r/min至少离心25min以除去未反应的试剂。除去上清液，剩余的红色油状沉淀再用缓冲液清洗，离心后保存在0.3mol/L NaCl，10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，探针终浓度为10μmol/L。通过红外光谱的测定证明，每个金颗粒表面被修饰了许多探针，因此才有可能在多核苷酸检测过程中形成聚合网络结构。

(3)层析膜的制备：将2mg/ml亲和素以2μl/cm的量加到纤维膜或尼龙膜上，在湿度40％、温度40℃的环境内自然干燥3小时；然后将膜贴于撕去不干胶的硬纸板上，上端用滤纸覆盖层析膜、压紧贴上不干胶固定，最后用割膜机切割成4mm宽的试纸条状备用(保存于干燥环境)。

本发明检测过程中的层析膜显色反应为溶液杂交后层析显色过程。溶液杂交显色法即将等温扩增产物10μL(约10pmol)加入至含有20μL纳米金-烷巯基化寡核苷酸检测探针、10μL生物素化捕获探针的1.5mL离心管中，室温孵育15min，然后将混合溶液置于恒温水浴槽中并将其加热到65℃，将混合物平衡5min，最后放入层析膜试纸条、经过5～10min后进行观察，如果纳米金探针与扩增产物靶序列杂交，会在膜上形成蓝紫色的条带，从而显示结核分枝杆菌的存在，否则将不会出现条带。

有益效果

本发明建立了利用NITAG技术检测结核分枝杆菌活菌的方法，从原理上分析，等温扩增和纳米金探针均能放大检测信号，等温扩增放大的是RNA分子的拷贝数，纳米金探针放大的是显色信号，加上层析步骤使显色的杂交复合物聚集为一个窄小条带，结果观察更为简便和直观，所以比NASBA、TMA技术更灵敏，使实际应用于微量RNA检测成为可能；由于扩增过程中没有大量性质稳定的双链DNA产生，因此比PCR检测能更好地排除扩增片断的污染所带来的假阳性对检测结果的影响。

采用本发明技术，结核分枝杆菌活菌的mRNA扩增效率、检测灵敏度和特异性大大的提高，并降低了PCR扩增检测的假阳性率。本发明的技术方案设计合理，样本实验能在分子水平上证明结核分枝杆菌活菌的存在，表明该方法切实可行。基于NATAG技术的结核分枝杆菌活菌检测方法和试剂盒，可以作为结核分枝杆菌活菌检测、治疗药物疗效观察、抗结核药物筛选和药敏实验等研究的提供辅助实验手段，具有重要的临床意义及广泛的应用价值。

附图说明

图1为NITAG扩增检测结核分枝杆菌mRNA技术原理示意图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，Trizol试剂购自Invitrogen公司，限制性内切酶购自上海申能博彩生物公司，逆转录AMV酶、T7RNA聚合酶、RNase H、RNase Inhibitor和BSA均购自美国Promega公司，引物和探针均由上海生工公司合成。

实施例1

结核分枝杆菌培养物的NITAG检测

以下通过介绍结核分枝杆菌培养物提取的mRNA NITAG检测来举例说明本发明的实施。

细菌培养：结核分枝杆菌H37Rv株(ATCC 27294)用米氏(Middlebrook)7H9肉汤培养7～14天，收获菌体并用4mm玻璃珠振荡5～10min打散，生理盐水稀释使用。

RNA提取：取250μl生理盐水稀释后的结核分枝杆菌培养物，加入500μl Trizol提取试剂，用移液器反复吹打混匀，室温放置5分钟，加入200μl氯仿，用手来回振荡混匀15秒，室温放置5分钟，4℃12,000rpm离心15分钟，将上清移入新的离心管，加入200μl异丙醇，旋涡振荡5秒，冰浴沉淀10分钟，4℃12,000rpm离心10分钟，弃上清，加入500μl预冷的DEPC水配制的75％乙醇洗涤，上下颠倒10次，4℃10,000rpm离心5分钟，吸干上清，沉淀室温干燥10-20分钟，加入10μl DEPC处理的水稀释混匀，立即使用或-70℃保存(使用前可加入10μl DEPC处理的水稀释混匀)。然后加入3μl10×DNase I缓冲液、7μl RNase inhibitor，DNaseI 10μl，37℃温育15分钟后加入1μl 10mM EDTA65℃15分钟灭活DNaseI，短暂离心后直接用于NITAG等温扩增。

NITAG扩增检测：取5μL的提取处理后的RNA模板置入10μL2x等温扩增反应体系缓冲液，在65℃和41℃下先后处理5min，加入5μL混合酶液，在41℃下反应120min；取10μL等温扩增产物加入至含有20μL纳米金-烷巯基化寡核苷酸探针、10μL生物素化捕获探针的1.5mL离心管中，室温孵育15min，然后将混合溶液置于恒温水浴槽中并将其加热到65℃，将混合物平衡5min，最后放入层析膜试纸条、经过5～10min后进行观察，层析膜上形成蓝紫色的条带，说明结核分枝杆菌mRNA检测阳性(即有活菌存在)。

实施例2

临床肺结核患者痰液样本的NITAG检测

前处理方法：在结核病患者清晨深咳痰标本中加入1ml 2.5％的N-乙酰基-L-半胱氨酸(NALC)后，转入含有4mm玻璃珠的试管中振荡，匀浆后的痰液标本于-70℃保存待RNA提取。

RNA提取：取500μl匀浆后的痰液标本，加入1000μl Trizol提取试剂，用移液器反复吹打混匀，室温放置5分钟，加入200μl氯仿，用手来回振荡混匀15秒，室温放置5分钟，4℃12,000rpm离心15分钟，将上清移入新的离心管，加入200μl异丙醇，旋涡振荡5秒，冰浴沉淀10分钟，4℃12,000rpm离心10分钟，弃上清，加入500μl预冷的DEPC水配制的75％乙醇洗涤，上下颠倒10次，4℃10,000rpm离心5分钟，吸干上清，沉淀室温干燥10-20分钟，加入10μl DEPC处理的水稀释混匀。然后加入3μl 10×DNase I缓冲液、7μl RNaseinhibitor，DNaseI 10μl，37℃温育15分钟后加入1μl10mM EDTA 65℃15分钟灭活DNaseI，短暂离心后直接用于NITAG等温扩增。

NITAG扩增检测：取5μL的提取处理后的RNA模板置入10μL 2x等温扩增反应体系缓冲液，在65℃和41℃下先后处理5min，加入5μL混合酶液，在41℃下反应120min；取10μL等温扩增产物加入至含有20μL纳米金-烷巯基化寡核苷酸探针、10μL生物素化捕获探针的1.5mL离心管中，室温孵育15min，然后将混合溶液置于恒温水浴槽中并将其加热到65℃，将混合物平衡5min，最后放入层析膜试纸条、经过5～10min后进行观察，层析膜上形成蓝紫色的条带，说明结核分枝杆菌mRNA检测阳性(即有活菌存在)。

核苷酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110>上海复星医药(集团)股份有限公司

     上海复星医学科技发展有限公司

     复旦大学附属华山医院

     吴大治，夏懿，吕元

<120>一种核酸等温扩增检测结核分枝杆菌活菌的方法及试剂盒

<130>MTB viability

<140>CN

<141>2008-10-10

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<400>1

ggctgccaga cttacaagtg                                                    20

<210>2

<211>45

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<400>2

aattctaata cgactcacta taggggtagg cggccaagat cattg                        45

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221>己烷巯基

<222>(1)..(19)

<223>y＝HS-(CH2)6-

<400>3

yttgtccgcc aacagggcc                                                         19

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221>己烷巯基

<222>(1)..(20)

<223>y＝-(CH2)6-SH

<400>4

cgctgcaatc ggcttgtcgy                                                        20

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221>生物素

<222>(1)..(21)

<223>y＝biotin-

<400>5

yccttcctga ccagcgagct g                                                      21

Claims (10)

1.一种结核分枝杆菌核酸等温扩增检测活菌的方法，采用逆转录-转录和纳米金探针检测层析杂交原理，其扩增对象为从痰液、活检组织等样本或结核杆菌培养物中提取获得的RNA模板；其特征在于，RNA模板通过采用逆转录酶、核糖核酸酶H以及RNA聚合酶等温扩增，产生的大量RNA扩增子和纳米金颗粒标记的检测探针、生物素(或地高辛)标记的捕获探针结合形成杂交复合物引起光学性质变化，最后该复合物和固定在层析膜上亲和素(或抗地高辛抗体)结合形成显色检测条带。

2.根据权利要求1所述的检测方法，采用了扩增结核杆菌靶基因85-B mRNA的寡聚核苷酸引物和探针：引物具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列，其中SEQ ID NO：25’端含有RNA聚合酶识别的启动子序列；检测探针具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4序列；捕获探针具有SEQID NO：5序列。这些引物和探针或者是包含有上述序列的向5’端或和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85％的序列；或者上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其步骤依次包括：

(1)RNA模板在60～70℃下解链后降温；

(2)加入逆转录酶、核糖核酸酶H和RNA聚合酶，在引物的引导下于37～42℃进行等温扩增，获得RNA扩增子；

(3)利用纳米金颗粒标记的寡核苷酸探针检测扩增子，并被生物素标记寡核苷酸探针结合捕获，通过层析膜上的条带显色反应获得检测结果。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所说的逆转录酶为鸟成髓细胞瘤病毒逆转录酶或鼠白血病病毒逆转录酶；所说的RNA聚合酶为T3RNA聚合酶或T7RNA聚合酶。

5.根据权利要求1和5所说的检测方法，其特征在于，所说的T3 RNA聚合酶所识别特异性启动子序列为5’AAT TCA ATT AAC CCT CAC TAA AGGG3’；所说的T7RNA聚合酶所识别特异性启动子序列为5’AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG G3’。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所用的纳米金颗粒直径为1～100nm，纳米金颗粒上的寡核苷酸探针SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4长度为10～100bp，且连接前经过巯基化或烷巯基化处理；所用的捕获探针SEQ ID NO：5长度为10～50bp，其5’端可为生物素或地高辛标记。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所用的固定有亲和素或抗地高辛抗体(对应于捕获探针5’端标记生物素或地高辛)的层析膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所说的显色反应为杂交后在层析膜上出现蓝紫色显色条带。

9.一种利用权利要求1所述检测方法组装的试剂盒，其组成为：包含有引物I和II、逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶的反应缓冲液、纳米金颗粒标记的寡核苷酸检测探针、生物素(或地高辛)标记的寡核苷酸捕获探针、带有亲和素(或抗地高辛抗体)标记的层析膜。

10.一种利用权利要求1所述检测方法组装的结核分枝杆菌核酸等温扩增检测试剂盒，可以用于检测痰液、活检组织等样本或结核杆菌培养物中的结核分枝杆菌活菌。

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