CN103898215A - 一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的方法和检测试剂盒 - Google Patents

一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的方法和检测试剂盒 Download PDF

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Abstract

本发明公开了一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的方法和检测试剂盒。本发明方法针对结核分枝杆菌的GyrB基因设计了5条引物，TP由退火序列和一段能够与目标序列互补的核苷酸序列构成，FP带有一个茎环结构，可分别从两端与互补的2条DNA单链退火，向对侧延伸。OP1和OP2的退火位点分别位于TP和FP外侧，向中间退火延伸的同时将TP和FP延伸得到的双链剥离。带有TP或FP的单链被置换下来后又可作为模板，继续上述过程，如此可形成2种关键的单链中间产物，这2种中间产物继而分别以TP和FP的特殊结构为起点，进行自身引导的DNA合成。这样循环往复，在DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，实现目标序列的大量扩增。

Description

一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的方法和检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的方法和检测试剂盒。
背景技术
分枝杆菌（Mycobacterium）包括140多个种属，总体上被分为三大类，结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex ，MTBC)，麻风杆菌（M.leprae）以及非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacterial, NTM）。MTBC包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌，致病性强，是引起动物结核病的主要病原，但种类相对较少。与其相比NTM数量多（多达百余种）、分布广，部分为致病菌或条件致病，因NTM的形态于MTB近似，具有抗酸染色阳性的特点，且NTM与MTB在菌体成分和抗原性上多具共性，因此NTM与MTB在形态上和免疫学检测上具有较大难度。以细菌培养为基础的传统生化鉴定方法，费力耗时、结果提供不及时,有时结果不准确。随着分子生物学的发展，出现了众多以分子生物学技术为基础的鉴定方法，如PCR-SSCP、PCR-RFLP、DNA探针、DNA芯片、DNA直接测序等，以其高效、特异等优点而受到青睐，但对检测人员技术水平要求高、仪器昂贵、检测周期长，为满足快速鉴别分类的需求，为科学研究提供快速方便的方法，缩短结核分枝杆菌复合群鉴别时间，降低鉴别技术难度和费用，本发明以恒温扩增技术为依托，开发一种可快速鉴别结核分枝杆菌复合群的方法和检测试剂盒，该试剂盒摆脱常见核酸检测技术对温控的精准要求，检测仪器低廉，检测时间短，试剂费用低，技术要求低等优点，同时就该方法可适用于其他菌群的快速鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的方法和检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种结核分枝杆菌复合群的快速检测方法，包括以下步骤：
1）根据结核分枝杆菌的GyrB基因设计5条SmartAmp恒温扩增引物；
2）加入待检样品DNA，在上述引物及DNA 聚合酶的作用下进行恒温扩增反应；
3）根据扩增结果判断待检样品是否为结核分枝杆菌复合群。
步骤1）所述SmartAmp恒温扩增引物的序列如下所示：
TP：GCCTTCCCGGATATCGTCACGGTGAACAAGTACGCCAA；
FP：TTTATATATATATAAACGATTTGACCTCGGTGTT；
BP：GCCAGACCAAGACCAAGTT；
OP1：CTTCGCCAACACCATCAA；
OP2： GCTGTTCGTTACAGACCTT。
步骤2）所述恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8 μmol/L、OP1和OP2引物各0.5 μmol/L、dNTP 0.5 mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、（NH4）2SO4 10 mmol/L、MgCl2 2.5 mmol/L、KCl 10 mmol/L、MgSO4 2 mmol/L、STYO-9 5 μmol/L、pH为8.8的Tris-HCl 20 mmol/L、0.1% Triton X-100、6U Bst DNA酶，1μg Tap Muts、1μL DNA 模板。
步骤2）所述的恒温扩增反应的程序为：60～65℃反应20～40 min。
一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒，其含有根据结核分枝杆菌的GyrB基因设计的5条SmartAmp恒温扩增引物。
所述SmartAmp恒温扩增引物的序列如下所示：
TP：GCCTTCCCGGATATCGTCACGGTGAACAAGTACGCCAA；
FP：TTTATATATATATAAACGATTTGACCTCGGTGTT；
BP：GCCAGACCAAGACCAAGTT；
OP1：CTTCGCCAACACCATCAA；
OP2： GCTGTTCGTTACAGACCTT。
所述试剂盒中还包括恒温扩增反应液、SYTO-9、Tris-HCl、Triton X-100、Bst DNA聚合酶， 错配结合蛋白Tap Muts。
所述扩增反应液中含有：dNTP、甜菜碱、（NH4）2SO4、MgCl2、KCl 和MgSO4 。
一组用于结核分枝杆菌复合群的快速检测的SmartAmp恒温扩增引物，其序列如下所示：
TP：GCCTTCCCGGATATCGTCACGGTGAACAAGTACGCCAA；
FP：TTTATATATATATAAACGATTTGACCTCGGTGTT；
BP：GCCAGACCAAGACCAAGTT；
OP1：CTTCGCCAACACCATCAA；
OP2： GCTGTTCGTTACAGACCTT。
本发明的有益效果是：
本发明所设计的5条引物中，TP由退火序列和一段能够与目标序列互补的核苷酸序列构成，FP带有一个茎环结构，他们的退火位点分别位于目标序列的两端，可分别从两端与互补的2条DNA单链退火，向对侧延伸。OP1和OP2的退火位点分别位于TP和FP外侧，向中间退火延伸的同时将TP和FP延伸得到的双链剥离。带有TP或FP的单链被置换下来后又可作为模板，继续上述过程，如此可形成2种关键的单链中间产物，这2种中间产物继而分别以TP和FP的特殊结构为起点，进行自身引导的DNA合成。这样循环往复，在DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，实现目标序列的大量扩增。
    和其他检测方法相比，本发明技术具有快速、精确、灵敏、特异、背景低、成本低等优点，本发明方法运用于结核分枝杆菌复合群的快速检测中，具有以下优点： 
（1）检测时间短：在20-40 min内实现可实现将对靶标的检测；
（2）恒温检测，常见的耐药检测技术需要变温扩增过程，本技术只需在恒温条件下借助特殊的酶即可实现恒温检测；
（3）特异性强：SmartAmp技术具有独特的错配抑制技术，能够识别单个核苷酸的差异。首先，反应使用了5 条不对称引物，当DNA 链与任何一条引物不匹配时，就会阻止后续的扩增反应，外反应体系中还加入了错配结合蛋白Taq MutS，如果引物出现单个碱基的错配，Taq MutS 即结合到错配区域，使扩增反应停止。
附图说明
图1为结核分枝杆菌复合群试剂盒灵敏度实验结果图；
图2为结核分枝杆菌复合群试剂盒特异性实验结果图；
图3为实际样品检测常见呼吸道微生物实验结果图；
图4为实际样品检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例一、引物设计
根据结核分枝杆菌的GyrB基因设计5条SmartAmp恒温扩增引物，序列分别如下所示：
TP：GCCTTCCCGGATATCGTCACGGTGAACAAGTACGCCAA（SEQ ID NO:1）
FP：TTTATATATATATAAACGATTTGACCTCGGTGTT（SEQ ID NO:2）
BP：GCCAGACCAAGACCAAGTT（SEQ ID NO:3）
OP1：CTTCGCCAACACCATCAA（SEQ ID NO:4）
OP2：GCTGTTCGTTACAGACCTT （SEQ ID NO:5）
实施例二、一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒的建立
所述试剂盒中包括：SEQ ID NO:1～5所示的5条SmartAmp恒温扩增引物、恒温扩增反应液、SYTO-9、Tris-HCl、Triton X-100、Bst DNA聚合酶， 错配结合蛋白Tap Muts。
所述扩增反应液中含有：dNTP、甜菜碱、（NH4）2SO4、MgCl2、KCl 和MgSO4。
实施例三、一种基于恒温技术快速检测结核分枝杆菌复合群的方法的建立
反应体系：25μL反应体系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8 μmol/L、OP1和OP2引物各0.5 μmol/L、dNTP 0.5 mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、（NH4）2SO4 10 mmol/L、MgCl2 2.5 mmol/L、KCl 10 mmol/L、MgSO4 2 mmol/L、5 μmol/L的SYTO-9、pH为8.8的Tris-HCl 20 mmol/L、0.1% Triton X-100、6U Bst DNA酶，1μg Tap Muts、1μL DNA 模板。
反应的程序为：60～65℃反应20～40 min。
实施例四、灵敏度实验
将灭活后的结核分枝杆菌菌液分别用生理盐水进行10倍梯度稀释，得到1×100、1×101、1×102、1×103个菌/ml的菌液。利用实施例二的试剂盒和实施例三的方法进行检测，检测结果见图1。实验结果表明，本发明方法对结核分枝杆菌复合群的最低可检浓度为1×101个菌/ml。
实施例五、特异性实验
利用实施例二的试剂盒和实施例三的方法对结核分枝杆菌阳性样品和15种非特异性菌株（鸟分枝杆菌、土地分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、偶然分枝杆菌、草分枝杆菌、北京棒杆菌、巴西诺卡氏菌、嗜肺军团菌、施氏分枝杆菌、戈登分枝杆菌、肺炎球菌和百日咳博德特氏菌）进行恒温扩增。扩增结果表明（见图2），本发明方法仅对结核分枝杆菌复合群（人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌）样品有扩增，而其它的非结核分枝杆菌则无扩增，表明该方法特异性好。
实施例六、样品检测
利用实施例二的试剂盒和实施例三的方法对对呼吸道常见的非结核分枝杆菌（鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌和嗜麦芽窄食单胞菌）进行恒温扩增。扩增结果表明（见图3），本发明方法仅对结核分枝杆菌复合群阳性样品有扩增，对呼吸道常见的非结核分枝杆菌没有扩增，特异性好。
利用实施例二的试剂盒和实施例三对已知的样品进行检测，扩增结果表明（见图4），本发明方法仅对结核分枝杆菌复合群人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌有扩增，对常见的非结核分枝杆菌（膽分枝杆菌、龟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、土分枝杆菌、戈登分枝杆菌、胞内分枝杆菌）及麻风杆菌没有扩增，检测符合率100%。
<110>  广州迪澳生物科技有限公司
 
<120>  一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的方法和检测试剂盒
<130> 
<160>  5    
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  38
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
gccttcccgg atatcgtcac ggtgaacaag tacgccaa                               38
 
 
<210>  2
<211>  34
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
tttatatata tataaacgat ttgacctcgg tgtt                                   34
 
 
<210>  3
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  3
gccagaccaa gaccaagtt                                                    19
 
 
<210>  4
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  4
cttcgccaac accatcaa                                                     18
 
 
<210>  5
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  5
gctgttcgtt acagacctt                                                    19

Claims (9)

1.一种结核分枝杆菌复合群的快速检测方法，包括以下步骤：
1）根据结核分枝杆菌的GyrB基因设计5条SmartAmp恒温扩增引物；
2）加入待检样品DNA，在上述引物及DNA 聚合酶的作用下进行恒温扩增反应；
3）根据扩增结果判断待检样品是否为结核分枝杆菌复合群。
2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，步骤1）所述SmartAmp恒温扩增引物的序列如下所示：
TP：GCCTTCCCGGATATCGTCACGGTGAACAAGTACGCCAA；
FP：TTTATATATATATAAACGATTTGACCTCGGTGTT；
BP：GCCAGACCAAGACCAAGTT；
OP1：CTTCGCCAACACCATCAA；
OP2： GCTGTTCGTTACAGACCTT。
3.根据权利要求1或2所述的快速检测方法，其特征在于，步骤2）所述恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8 μmol/L、OP1和OP2引物各0.5 μmol/L、dNTP 0.5 mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、（NH4）2SO4 10 mmol/L、MgCl2 2.5 mmol/L、KCl 10 mmol/L、MgSO4 2 mmol/L、STYO-9 5 μmol/L、pH为8.8的Tris-HCl 20 mmol/L、0.1% Triton X-100、6U Bst DNA酶，1μg Tap Muts、1μL DNA 模板。
4.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，步骤2）所述的恒温扩增反应的程序为：60～65℃反应20～40 min。
5.一种基于恒温技术检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒，其含有根据结核分枝杆菌的GyrB基因设计的5条SmartAmp恒温扩增引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述SmartAmp恒温扩增引物的序列如下所示：
TP：GCCTTCCCGGATATCGTCACGGTGAACAAGTACGCCAA；
FP：TTTATATATATATAAACGATTTGACCTCGGTGTT；
BP：GCCAGACCAAGACCAAGTT；
OP1：CTTCGCCAACACCATCAA；
OP2： GCTGTTCGTTACAGACCTT。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括恒温扩增反应液、SYTO-9、Tris-HCl、Triton X-100、Bst DNA聚合酶， 错配结合蛋白Tap Muts。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液中含有：dNTP、甜菜碱、（NH4）2SO4、MgCl2、KCl 和MgSO4 。
9.一组用于结核分枝杆菌复合群的快速检测的SmartAmp恒温扩增引物，其序列如下所示：
TP：GCCTTCCCGGATATCGTCACGGTGAACAAGTACGCCAA；
FP：TTTATATATATATAAACGATTTGACCTCGGTGTT；
BP：GCCAGACCAAGACCAAGTT；
OP1：CTTCGCCAACACCATCAA；
OP2：GCTGTTCGTTACAGACCTT。
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