CN109402272A - 基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

一种基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒和方法。检测引物组包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、Bst DNA聚合酶、错配结合蛋白、显色剂和对照。其检测方法是通过提取待检DNA，利用具有链置换活性的DNA聚合酶活性，采用四条特异性引物及一种错配结合蛋白，在60～65℃对样品DNA模板进行扩增，可检测到DNA的pg级，其鉴定方式是采用在反应体系中加入

Description

基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的引物组、 试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是食品安全部门重点监管对象之，其对肉、奶、蛋、水产品及蔬菜等均有不同程度污染，以肉及肉制品污染最严重。故建立肉中单增李斯特菌快速、准确、定量、可靠的检测方法尤为重要。目前肉制品中常见致病菌检测方法操作繁琐、费时费力、灵敏度较低、特异性较差、易产生假阳性，无法不能满足快速鉴定单增李斯特菌发展需求。随着分子生物学的发展，出现了众多以分子生物学技术为基础的鉴定方法，如PCR-SSCP、PCR-RFLP、DNA探针、DNA芯片、DNA直接测序等，以其高效、特异等优点而受到青睐，但对检测人员技术水平要求高、仪器昂贵、检测周期长，为满足快速鉴别分类的需求，为科学研究提供快速方便的方法，缩短单核增生李斯特氏菌鉴别时间，降低鉴别技术难度和费用一直是相关研究的热点。所以，在食品检测和科学研究实践中均需要一种降低操作技术和费用、快速简便、容易普及、安全可靠的检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的引物组。
本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的试剂盒。
本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一方面，本发明公开了一种基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示:
FP引物：TTTATATATATATAAATCTCAGGTCATGTAGG
TP引物：TAGGACTGAACAATTACGGCTTTGAAGGAA
BP引物：ATATCATCAAAAAT
OP1引物：GGCGTACGCGGGAAATCT
OP2引物：CTTTTGCGGAGCCACCGT。
优选地，扩增反应时，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。
另一方面，本发明还公开了一种基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的试剂盒，该检测试剂盒中含有上述方案中所列的智能恒温扩增引物组。
优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)错配结合蛋白；(3)智能恒温扩增反应液；(4)荧光显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。
优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒中，其引物中TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。
优选地，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述错配结合蛋白为Tap Muts错配结合蛋白。
优选地，所述智能恒温扩增反应液含有：28mM dNTPs、10％DMSO、40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4，0.2％20。
优选地，阳性对照为含有单核增生单核增生李斯特氏菌hlyA基因片段的T载体克隆，阴性对照为不含单核增生李斯特氏菌hlyA基因片段的水或其他溶剂。更优地，阴性对照为去离子水。
优选地，所述显色剂为1/50000原液稀释的Green I。
再有，本发明还公开了一种基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的方法，包括如下步骤：
(1)待检样品DNA的提取；
(2)智能恒温扩增反应：将步骤(1)中提取的待检样品DNA加入智能恒温扩增反应体系中，混匀后离心，并于63℃反应40min；该智能恒温扩增反应体系中含有上述方案中所述的智能恒温扩增引物组；
(3)结果判断：通过观察ESE-tubescanner扩增仪的扩增曲线判断扩增结果。
优选地，所用智能恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8μmol/L、OP1和OP2引物各0.5μmol/L、dNTP 0.5mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、(NH4)2SO4mmol/L、MgCl2 2.5mmol/L、KCl 10mmol/L、MgSO4 2mmol/L、Green I0.5μL、pH为8.8的Tris-HCl 20mmol/L、0.2％20、6U Bst DNA聚合酶、1μg TapMuts、1μL步骤(1)中提取的待检样品DNA，用去离子水补齐到25μL。
本发明的基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的方法可以通过本发明方案中的所公开的智能恒温扩增检测试剂盒得以实施，也可以采用基于本发明的原理和设计思路采用其他类似智能恒温扩增检测试剂盒得以实现。
从原理上讲，本发明以智能恒温扩增技术为依托，开发一种可快速鉴别单核增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒和方法。智能恒温扩增技术的基本原理，即获取目标序列后在等温条件下对其反复进行扩增，并通过荧光实时监测，以检测目标序列的存在。该试剂盒摆脱常见核酸检测技术对温控的精准要求，检测仪器低廉，检测时间短，试剂费用低，技术要求低等优点，同时就该方法可适用于其他菌群的快速鉴定。
因此，结合上述原理及本发明实施例中的技术效果可知，本发明至少包含如下有益效果：
本发明根据目标序列保守区域设计turnbaek primer(TP)、forward primer(FP)、boost primer(BP)、outer primer 1(OP1)、outer primer2(OP2)共5条引物，TP由退火序列和一段能够与目标序列互补的核苷酸序列构成，FP带有一个茎环结构，它们的退火位点分别位于目标序列的两端，可分别从两端与互补的2条DNA单链退火，向对侧延伸。OP1和OP2的退火位点分别位于TP和FP外侧，向中间退火延伸的同时将TP和FP延伸得到的双链剥离。带有TP或FP的单链被置换下来后又可作为模板，继续上述过程，如此可形成2种关键的单链中间产物，这2种中间产物继而分别以TP和FP的特殊结构为起点，进行自身引导的DNA合成。这样循环往复，在聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，实现目标序列的大量扩增。在此过程中，其中一条引物上结合一种杂交敏感的荧光引物，一旦与互补序列退火杂交，即可发出一定强度的荧光，由实时荧光定量PCR仪监测。随着扩增反应的进行，荧光强度增大，当超过检测最低I值时即可确定扩增反应的实现，也即目标序列的存在。整个过程在60～65℃的恒温条件下20-40min即可完成。智能恒温扩增技术具有独特的错配抑制技术，能够识别单个核苷酸的差异，成为单核苷酸多态性检测的有力方法。这也是与其他等温扩增技术，如环介导恒温扩增、链置换扩增、核酸序列扩增、转录酶扩增、滚环扩增、解链酶扩增等相比，智能恒温扩增最为明显的优点，这些传统的恒温扩增无法识别DNA片段中的突变点而难以实现基因多态性的检测，而阻碍了恒温扩增技术在基因多态性检测领域的推广。另外，智能恒温扩增技术与传统的检测基因多态性的方法，如DNA芯片、限制性片段长度多态性PCR、等位基因特异性多PCR，DNA测序，TaqMan探针、Invader等相比，其主要优势在于恒温反应这一特性决定了智能恒温扩增法无需昂贵操作仪器，具有简单、快速、成本低、灵敏度高等明显优势。相比于其他检测技术，本发明技术具有快速、精确、灵敏、特异、背景低、成本低等优点，并摆脱常见核酸检测技术对温控的精准要求束缚，具有检测仪器价格低廉，检测时间短，试剂费用低，技术要求低等优点。具体而言：
(1)检测时间短：在20-40min内可实现将对基因多态性位点的检测；
(2)恒温检测，常见的突变检测技术需要变温扩增过程，因此需要较为昂贵的含有变温模块的检测仪；本技术只需在恒温条件下借助特殊的酶即可实现恒温检测，无需昂贵仪器，成本低廉；
(3)特异性强：智能恒温扩增技术具有独特的错配抑制技术，能够识别单个核苷酸的差异。首先，反应使用了5条不对称引物，当DNA链与任何一条引物不匹配时，就会阻止后续的扩增反应，外反应体系中还加入了错配结合蛋白Taq MutS，如果引物出现单个碱基的错配，Taq MutS即结合到错配区域，使扩增反应停止。因此，此技术可克服传统恒温扩增法无法进行基因多态性检测的局限，可准确地检测基因多态性，特异性强。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1单核增生李斯特氏菌智能恒温扩增检测试剂盒的建立
单核增生李斯特氏菌的智能恒温扩增检测试剂盒，包括智能恒温扩增引物组、智能恒温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、错配结合蛋白Tap Muts、阳性对照和阴性对照、荧光显色剂。
(1)智能恒温扩增引物设计：以单核增生李斯特氏菌hlyA基因为靶基因进行引物的设计。引物序列见表1。
表1引物序列表
引物名称 引物序列(5’-3’)
FP TTTATATATATATAAATCTCAGGTCATGTAGG(SEQ ID NO：1)
TP TAGGACTGAACAATTACGGCTTTGAAGGAA(SEQ ID NO：2)
BP ATATCATCAAAAAT(SEQ ID NO：3)
OP1 GGCGTACGCGGGAAATCT(SEQ ID NO：4)
OP2 CTTTTGCGGAGCCACCGT(SEQ ID NO：5)
(2)智能恒温扩增反应液含有：28mM dNTPs、10％DMSO、40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4，0.2％20。
(3)阳性对照为含有单核增生李斯特氏菌hlyA基因片段的T载体克隆，其制备方法为：以分离鉴定的单核增生李斯特氏菌DNA为模板，利用表1中的OP1和OP2引物(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)对单核增生李斯特氏菌DNA进行PCR扩增反应，得到含靶基因序列的DNA，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。
(4)阴性对照为去离子水。
实施例2建立单核增生李斯特氏菌检测方法：
利用实施例1的试剂盒检测单核增生李斯特氏菌的方法，包括如下步骤：
(1)待检样品DNA的提取：采用细菌DNA提取试剂盒提取样品DNA；
(2)恒温基因扩增反应：25μL反应体系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8μmol/L、OP1和OP2引物各0.5μmol/L、dNTP 0.5mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、(NH4)2SO4mmol/L、MgCl2 2.5mmol/L、KCl 10mmol/L、MgSO42mmol/L、Green I 0.5μL、pH为8.8的Tris-HCl 20mmol/L、0.2％20、6U Bst DNA聚合酶、1μg Tap Muts、1μL DNA模板，用去离子水补齐到25μL；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60-65℃反应40min。
(3)结果判断：将反应管放置在核酸扩增仪中进行反应，观察核酸扩增仪扩增曲线判断扩增结果，如果出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
实施例3特异性实验
用实施例2的方法分别对分离纯化的单核增生李斯特氏菌ATCC19115/413，沙门氏菌ATCC14028，金黄色葡萄球菌ATCC6538，大肠杆菌O157ATCC43889，阪崎肠杆菌ATCC29544，绿脓杆菌ATCC9027，大肠杆菌ATCC25922，大肠杆菌CMCC44102，阪崎肠杆菌ATCC12868，副溶血性弧菌ATCC17802，创伤弧菌ATCC27562，金黄色葡萄球菌CMCC26003，鲍氏志贺氏菌CMCC51346，宋内氏志贺氏菌NICP51334，普通变形杆菌NICPB490059，奇异变形杆菌HB7131，克雷伯氏菌CMCC(B)46117，藤黄微球菌CMCC28001的DNA进行检测。
鉴定结果显示：单核增生李斯特氏菌ATCC19115/413DNA正常扩增，其他细菌DNA以及阴性对照没有扩增(表2)。显示出良好的特异性。
实施例5灵敏度实验
将已纯化的单核增生李斯特氏菌DNA作10倍梯度稀释(100～106梯度稀释)，用实施例2的操作方法分别对稀释后的单核增生李斯特氏菌DNA进行智能恒温扩增检测。
鉴定结果显示：100～105倍稀释DNA发生扩增，106倍稀释及阴性对照没有扩增。经DNA含量的测量，得到单核增生李斯特氏菌引物能检测到pg级单核增生李斯特氏菌DNA。
实施例6智能恒温扩增法和LAMP法对野生单核增生李斯特氏菌的检测的对比实验
实验菌株：为34株来源不同的野生单核增生李斯特氏菌(见表2):
表2智能恒温扩增法和LAMP法对野生单增李斯特菌的检测
菌株DNA提取方法：采用细菌DNA提取试剂盒提取样品DNA；
(1)用实施例2的方法分别对分离纯化的34株单核增生李斯特氏菌的DNA进行恒温智能扩增检测。结果显示，恒温智能扩增法对34株单核增生李斯特氏菌DNA的检测均显示阳性扩增(见表2)。
(2)LAMP反应引物：
F3：AGGTCATGTAGGACTGAACA
B3：TGCAACGTATCCTCCAGA
FIP：ACCGTCGATGATTTGAACTTCATTCTTCCTTCAAAGCCGTAA
BIP：ACCTCGGAGACTTACGAGATATGTTTGTTGTATAGGCAATGGG
FLP：TTGCGGAGCCACCGTAAA
BLP：CGGGAAACACCAGGAGTT LAMP
反应体系见下表：
表3LAMP反应体系
LAMP反应温度为63℃，反应时间为45min。
结果显示，LMAP扩增法对34株单核增生李斯特氏菌检出32株，有2株单核增生李斯特氏菌检测结果为阴性(表2)。由两种方法比较可以看出，本发明的试剂盒对不同食物来源的单核增生李斯特氏菌菌株DNA的检出率高于LAMP方法。本发明的方法及试剂盒能够用于食品安全、公共卫生等领域的大规模、高通量筛查。以上实施例表明，本发明的方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
由此可见本发明的方法及试剂盒能够用于食品安全、公共卫生等领域的大规模、高通量筛查。同时，以上实施例还表明，本发明的方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110>暨南大学
<120>基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法
<160> 5
<210> 1
<211> 32
<212> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
TTTATATATATATAAATCTCAGGTCATGTAGG
<210> 2
<211> 30
<212> 人工序列
<400> 2
TAGGACTGAACAATTACGGCTTTGAAGGAA
<210> 3
<211> 14
<212> 人工序列
<400> 3
ATATCATCAAAAAT
<210> 4
<211> 18
<212> 人工序列
<400> 4
GGCGTACGCGGGAAATCT
<210> 5
<211> 18
<212> 人工序列
<400> 5
CTTTTGCGGAGCCACCGT

Claims (10)

1.一种基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示:
FP引物：TTTATATATATATAAATCTCAGGTCATGTAGG
TP引物：TAGGACTGAACAATTACGGCTTTGAAGGAA
BP引物：ATATCATCAAAAAT
OP1引物：GGCGTACGCGGGAAATCT
OP2引物：CTTTTGCGGAGCCACCGT。
2.如权利要求1所述的基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的引物组，其特征在于：扩增反应时，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。
3.一种基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒中含有如权利要求1或2所述的智能恒温扩增引物组。
4.根据权利要求3所述的基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)错配结合蛋白；(3)智能恒温扩增反应液；(4)荧光显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述错配结合蛋白为Tap Muts错配结合蛋白。
6.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于：所述智能恒温扩增反应液含有：28mM dNTPs、10％DMSO、40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4，0.2％20。
7.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于：阳性对照为含有单核增生单核增生李斯特氏菌hlyA基因片段的T载体克隆，阴性对照为不含单核增生李斯特氏菌hlyA基因片段的水或其他溶剂。
8.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于：所述荧光显色剂为1/50000原液稀释的Green I。
9.一种基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的方法，包括如下步骤：
(1)待检样品DNA的提取；
(2)智能恒温扩增反应：将步骤(1)中提取的待检样品DNA加入智能恒温扩增反应体系中，混匀后离心，并于60-65℃反应20-40min；该智能恒温扩增反应体系中含有如权利要求1或2所述的智能恒温扩增引物组；
(3)结果判断：通过观察ESE-tubescanner扩增仪的扩增曲线判断扩增结果。
10.根据权利要求9所述的基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，所用智能恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8μmol/L、OP1和OP2引物各0.5μmol/L、dNTP 0.5mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、(NH4)2SO4mmol/L、MgCl2 2.5mmol/L、KCl 10mmol/L、MgSO4 2mmol/L、Green I 0.5μL、pH为8.8的Tris-HCl 20mmol/L、0.2％20、6U Bst DNA聚合酶、1μg Tap Muts、1μL步骤(1)中提取的待检样品DNA，用去离子水补齐到25μL。
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