CN107419031A - 基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107419031A
CN107419031A CN201710852973.1A CN201710852973A CN107419031A CN 107419031 A CN107419031 A CN 107419031A CN 201710852973 A CN201710852973 A CN 201710852973A CN 107419031 A CN107419031 A CN 107419031A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primers
intelligent constant
temperature
salmonella
temperature amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710852973.1A
Other languages
English (en)
Inventor
叶蕾
石磊
闫鹤
陈洵
常彦磊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan University
Original Assignee
Jinan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan University filed Critical Jinan University
Priority to CN201710852973.1A priority Critical patent/CN107419031A/zh
Publication of CN107419031A publication Critical patent/CN107419031A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、检测试剂盒和方法。引物组包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物；试剂盒包括引物液、反应液、Bst DNA聚合酶、错配结合蛋白、显色剂和对照。检测方法是通过提取待检DNA，利用具有链置换活性的DNA聚合酶活性，采用四条特异性引物及一种错配结合蛋白，在63℃对样品DNA模板进行扩增，可检测到DNA的pg级，其鉴定方式是采用在反应体系中加入

Description

基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及 方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
沙门氏菌是一种常见、重要的人兽共患病原菌，在公共卫生学上具有重要意义。沙门氏菌是主要的肠道致病菌，易引起食物中毒。在我国，以沙门氏菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的首位。目前对食品中的沙门氏菌检测手段仍采用常规生物学培养鉴定法辅以抗原和抗体的免疫学检测技术，病原微生物分离培养、生理生化鉴定、血清分型和免疫酶等表型特征检测方法，常规方法繁琐、耗时耗力，不能满足日益发展的需要。因此，为有效地预防和控制疾病发生，建立快速、敏感而又特异的检测沙门氏菌的方法是非常必要的。但这些检测技术对检测人员技术水平要求高，并且这些技术需要的检测仪器昂贵、检测周期长，难以实现快速检测推广的目的。所以，在食品检测和科学研究实践中均需要一种降低操作技术和费用、快速简便、容易普及、安全可靠的检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组。
本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒。
本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一方面，本发明公开了一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示:
FP引物：TTTATATATATATAAAGTTATTGGCGATAGCC
TP引物：AGCCTGGCGGTTGGACCACGGTGACAATAG
BP引物：GGTTTTGTTGTCTT
OP1引物：CGCCACGTTCGGGCAATT
OP2引物：TTTGGTAATAACGATAAA。
优选地，扩增反应时，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。
另一方面，本发明还公开了一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒，该检测试剂盒中含有上述方案中所列的智能恒温扩增引物组。
优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)错配结合蛋白；(3)智能恒温扩增反应液；(4)荧光显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。
优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒中，其引物中TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。
优选地，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述错配结合蛋白为Tap Muts错配结合蛋白。
优选地，所述智能恒温扩增反应液含有：28mM dNTPs、10％DMSO、40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4，0.2％20。
优选地，阳性对照为含有沙门氏菌invA基因片段的T载体克隆，阴性对照为不含沙门氏菌invA基因片段的水或其他溶剂。更优地，阴性对照为去离子水。
优选地，所述显色剂为1/50000原液稀释的Green I。
再有，本发明还公开了一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的方法，包括如下步骤：
(1)待检样品DNA的提取；
(2)智能恒温扩增反应：将步骤(1)中提取的待检样品DNA加入智能恒温扩增反应体系中，混匀后离心，并于63℃反应20-40min；该智能恒温扩增反应体系中含有上述方案中所述的智能恒温扩增引物组；
(3)结果判断：通过观察ESE-tubescanner扩增仪的扩增曲线判断扩增结果。
优选地，所用智能恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8μmol/L、OP1和OP2引物各0.5μmol/L、dNTP 0.5mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、(NH4)2SO4mmol/L、MgCl2 2.5mmol/L、KCl 10mmol/L、MgSO4 2mmol/L、Green I0.5μL、pH为8.8的Tris-HCl 20mmol/L、0.2％20、6U Bst DNA聚合酶、1μg TapMuts、1μL步骤(1)中提取的待检样品DNA，用去离子水补齐到25μL。
本发明的基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的方法可以通过本发明方案中的所公开的智能恒温扩增检测试剂盒得以实施，也可以采用基于本发明的原理和设计思路采用其他类似智能恒温扩增检测试剂盒得以实现。
从原理上讲，本发明以智能恒温扩增技术为依托，开发一种可快速鉴别沙门氏菌的引物组、试剂盒和方法。智能恒温扩增技术的基本原理，即获取目标序列后在等温条件下对其反复进行扩增，并通过荧光实时监测，以检测目标序列的存在。该试剂盒摆脱常见核酸检测技术对温控的精准要求，检测仪器低廉，检测时间短，试剂费用低，技术要求低等优点，同时就该方法可适用于其他菌群的快速鉴定。
因此，结合上述原理及本发明实施例中的技术效果可知，本发明至少包含如下有益效果：
本发明根据目标序列保守区域设计turnbaek primer(TP)、forward primer(FP)、boost primer(BP)、outer primer 1(OP1)、outer primer2(OP2)共5条引物，TP由退火序列和一段能够与目标序列互补的核苷酸序列构成，FP带有一个茎环结构，它们的退火位点分别位于目标序列的两端，可分别从两端与互补的2条DNA单链退火，向对侧延伸。OP1和OP2的退火位点分别位于TP和FP外侧，向中间退火延伸的同时将TP和FP延伸得到的双链剥离。带有TP或FP的单链被置换下来后又可作为模板，继续上述过程，如此可形成2种关键的单链中间产物，这2种中间产物继而分别以TP和FP的特殊结构为起点，进行自身引导的DNA合成。这样循环往复，在聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，实现目标序列的大量扩增。在此过程中，其中一条引物上结合一种杂交敏感的荧光引物，一旦与互补序列退火杂交，即可发出一定强度的荧光，由实时荧光定量PCR仪监测。随着扩增反应的进行，荧光强度增大，当超过检测最低I值时即可确定扩增反应的实现，也即目标序列的存在。整个过程在63℃恒温条件下30-40min即可完成。智能恒温扩增技术具有独特的错配抑制技术，能够识别单个核苷酸的差异，成为单核苷酸多态性检测的有力方法。这也是与其他等温扩增技术，如环介导恒温扩增、链置换扩增、核酸序列扩增、转录酶扩增、滚环扩增、解链酶扩增等相比，智能恒温扩增最为明显的优点，这些传统的恒温扩增无法识别DNA片段中的突变点而难以实现基因多态性的检测，而阻碍了恒温扩增技术在基因多态性检测领域的推广。另外，智能恒温扩增技术与传统的检测基因多态性的方法，如DNA芯片、限制性片段长度多态性PCR、等位基因特异性多PCR，DNA测序，TaqMan探针、Invader等相比，其主要优势在于恒温反应这一特性决定了智能恒温扩增法无需昂贵操作仪器，具有简单、快速、成本低、灵敏度高等明显优势。相比于其他检测技术，本发明技术具有快速、精确、灵敏、特异、背景低、成本低等优点，并摆脱常见核酸检测技术对温控的精准要求束缚，具有检测仪器价格低廉，检测时间短，试剂费用低，技术要求低等优点。具体而言：
(1)检测时间短：在20-40min内可实现将对基因多态性位点的检测；
(2)恒温检测，常见的突变检测技术需要变温扩增过程，因此需要较为昂贵的含有变温模块的检测仪；本技术只需在恒温条件下借助特殊的酶即可实现恒温检测，无需昂贵仪器，成本低廉；
(3)特异性强：智能恒温扩增技术具有独特的错配抑制技术，能够识别单个核苷酸的差异。首先，反应使用了5条不对称引物，当DNA链与任何一条引物不匹配时，就会阻止后续的扩增反应，外反应体系中还加入了错配结合蛋白Taq MutS，如果引物出现单个碱基的错配，Taq MutS即结合到错配区域，使扩增反应停止。因此，此技术可克服传统恒温扩增法无法进行基因多态性检测的局限，可准确地检测基因多态性，特异性强。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1沙门氏菌智能恒温扩增检测试剂盒的建立
沙门氏菌的智能恒温扩增检测试剂盒，包括智能恒温扩增引物组、智能恒温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、错配结合蛋白Tap Muts、阳性对照和阴性对照、荧光显色剂。
(1)智能恒温扩增引物设计：以沙门氏菌invA基因为靶基因进行引物的设计。引物序列见表1。
表1引物序列表
引物名称 引物序列(5’-3’)
FP TTTATATATATATAAAGTTATTGGCGATAGCC(SEQ ID NO：1)
TP AGCCTGGCGGTTGGACCACGGTGACAATAG(SEQ ID NO：2)
BP GGTTTTGTTGTCTT(SEQ ID NO：3)
OP1 CGCCACGTTCGGGCAATT(SEQ ID NO：4)
OP2 TTTGGTAATAACGATAAA(SEQ ID NO：5)
(2)智能恒温扩增反应液含有：28mM dNTPs、10％DMSO、40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4，0.2％20。
(3)阳性对照为含有沙门氏菌invA基因片段的T载体克隆，其制备方法为：以分离鉴定的沙门氏菌DNA为模板，利用表1中的OP1和OP2引物(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)对沙门氏菌DNA进行PCR扩增反应，得到含靶基因序列的DNA，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。
(4)阴性对照为去离子水。
实施例2使用ESE-Quant tube scanner仪建立沙门氏菌检测方法：
利用实施例1的试剂盒检测沙门氏菌的方法，包括如下步骤：
(1)待检样品DNA的提取：采用细菌DNA提取试剂盒提取样品DNA；
(2)恒温基因扩增反应：25μL反应体系中含有TP和FP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8μmol/L、OP1和OP2引物各0.5μmol/L、dNTP 0.5mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、(NH4)2SO4mmol/L、MgCl2 2.5mmol/L、KCl 10mmol/L、MgSO42mmol/L、Green I 0.5μL、pH为8.8的Tris-HCl 20mmol/L、0.2％20、6U Bst DNA聚合酶、1μg Tap Muts、1μL DNA模板，用去离子水补齐到25μL；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63℃反应40min。
(3)结果判断：将反应管放置在ESE-Tube Scanner中进行反应，观察ESE-TubeScanner软件判断扩增结果，如果出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
实施例3特异性实验
用实施例2的方法分别对分离纯化的单核增生李斯特氏菌ATCC19115/413，沙门氏菌ATCC14028，金黄色葡萄球菌ATCC6538，大肠杆菌O157ATCC43889，阪崎肠杆菌ATCC29544，绿脓杆菌ATCC9027，大肠杆菌ATCC25922，大肠杆菌CMCC44102，阪崎肠杆菌ATCC12868，副溶血性弧菌ATCC17802，创伤弧菌ATCC27562，金黄色葡萄球菌CMCC26003，鲍氏志贺氏菌CMCC51346，宋内氏志贺氏菌NICP51334，普通变形杆菌NICPB490059，奇异变形杆菌HB7131，克雷伯氏菌CMCC(B)46117，藤黄微球菌CMCC28001的DNA进行检测。
鉴定结果显示：沙门氏菌ATCC14028正常扩增，其他细菌DNA以及阴性对照没有扩增。显示出良好的特异性。
实施例5灵敏度实验
将已纯化的沙门氏菌DNA作10倍梯度稀释(100～106梯度稀释)，用实施例2的操作方法分别对稀释后的沙门氏菌DNA进行检测。
鉴定结果显示：100～105倍稀释DNA发生扩增，106倍稀释及阴性对照没有扩增。经DNA含量的测量，得到沙门氏菌引物能检测到pg级沙门氏菌DNA。
实施例6智能恒温扩增法与LAMP扩增法检测不同食物来源的沙门氏菌的对比实验。
实验菌株：为42株来源不同和不同血清型的野生沙门氏菌(见表2)；
菌株DNA提取方法：采用细菌DNA提取试剂盒提取样品DNA；
(1)用实施例2的方法分别对分离纯化的42株沙门氏菌的DNA进行恒温智能扩增检测。结果显示，恒温智能扩增法对42株沙门氏菌DNA的检测均显示阳性扩增(见表2)，其检出率达到100％。
(2)LAMP反应引物(针对沙门氏菌特异性基因invA，应用PrimerExplorerV4software(Eiken Chemical；http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)软件设计LAMP引物：
F3：GAAGCGTACTGGAAAGGG
B3：ATCACCAATGGTCAGCATG
FIP：CCGGCAATAGCGTCACCTTAAGCCAGCTTTACGGTTC
BIP：TTGGCGGTATTTCGGTGGGTATAAGTAGACAGGGCGGAG
Loop F：ACTTCATCGCACCGTCA
Loop B：GACTCGCCATGGTATGGAT
LAMP反应体系见下表：
表3 LAMP反应体系
LAMP反应过程在ESE-tube scanner中进行，反应温度为63℃，反应时间为45min。
结果显示，LMAP扩增法对42株沙门氏菌检出40株，有2株沙门氏菌检测结果为阴性(表2)，检出率为95％。
表2智能恒温扩增法与LAMP扩增法检测不同食物来源的沙门氏菌的对比实验
由两种方法比较可以看出，本发明的试剂盒对不同食物来源的沙门氏菌菌株DNA的检出率高于LAMP方法。
上述实验是针对一些随机食物来源的野生沙门氏菌样本实验结果，能够完全准确地检测出沙门氏菌，说明本发明的试剂盒及方法在检出率表现出明显优于LAMP方案的有益效果。另外，通过针对来自公共卫生和食品监督部门的575个样本(疑似标本)的检测实验结果来看，准确率达99.5％,明显优于LAMP方案及其他常见的沙门氏菌的检测试剂盒，能够用于食品安全、公共卫生等领域的大规模、高通量筛查。以上实施例表明，本发明的方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法
<130> 2017
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tttatatata tataaagtta ttggcgatag cc 32
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
agcctggcgg ttggaccacg gtgacaatag 30
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ggttttgttg tctt 14
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cgccacgttc gggcaatt 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tttggtaata acgataaa 18

Claims (10)

1.一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分别如下所示:
FP引物：TTTATATATATATAAAGTTATTGGCGATAGCC
TP引物：AGCCTGGCGGTTGGACCACGGTGACAATAG
BP引物：GGTTTTGTTGTCTT
OP1引物：CGCCACGTTCGGGCAATT
OP2引物：TTTGGTAATAACGATAAA。
2.如权利要求1所述的基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组，其特征在于：扩增反应时，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。
3.一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒中含有如权利要求1或2所述的智能恒温扩增引物组。
4.根据权利要求3所述的基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)错配结合蛋白；(3)智能恒温扩增反应液；(4)荧光显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述错配结合蛋白为Tap Muts错配结合蛋白。
6.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述智能恒温扩增反应液含有：28mM dNTPs、10％DMSO、40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4，0.2％20。
7.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：阳性对照为含有沙门氏菌invA基因片段的T载体克隆，阴性对照为不含沙门氏菌invA基因片段的水或其他溶剂。
8.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述荧光显色剂为1/50000原液稀释的Green I。
9.一种基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的方法，包括如下步骤：
(1)待检样品DNA的提取；
(2)智能恒温扩增反应：将步骤(1)中提取的待检样品DNA加入智能恒温扩增反应体系中，混匀后离心，并于63℃反应20-40min；该智能恒温扩增反应体系中含有如权利要求1或2所述的智能恒温扩增引物组；
(3)结果判断：通过观察ESE-tubescanner扩增仪的扩增曲线判断扩增结果。
10.根据权利要求9所述的基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所用智能恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8μmol/L、OP1和OP2引物各0.5μmol/L、dNTP 0.5mmol/L、甜菜碱0.6mol/L、(NH4)2SO4mmol/L、MgCl2 2.5mmol/L、KCl 10mmol/L、MgSO4 2mmol/L、Green I 0.5μL、pH为8.8的Tris-HCl 20mmol/L、0.2％20、6U Bst DNA聚合酶、1μg Tap Muts、1μL步骤(1)中提取的待检样品DNA，用去离子水补齐到25μL。
CN201710852973.1A 2017-09-20 2017-09-20 基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法 Pending CN107419031A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710852973.1A CN107419031A (zh) 2017-09-20 2017-09-20 基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710852973.1A CN107419031A (zh) 2017-09-20 2017-09-20 基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107419031A true CN107419031A (zh) 2017-12-01

Family

ID=60433712

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710852973.1A Pending CN107419031A (zh) 2017-09-20 2017-09-20 基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107419031A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109402272A (zh) * 2018-08-24 2019-03-01 暨南大学 基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103320434A (zh) * 2013-06-28 2013-09-25 华南理工大学 一种沙门氏菌lamp引物组和试剂盒及检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103320434A (zh) * 2013-06-28 2013-09-25 华南理工大学 一种沙门氏菌lamp引物组和试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOSHI K等: "Detection of Epidermal Growth Factor Receptor Mutations in Lung Cancer by the SMart-Amplification Process", 《CLINICAL CANCER RESEARCH》 *
MITANI Y ,等: "Rapid SNP diagnostics using asymmetric isothermal amplification and a new mismatch-suppression technology", 《NAT METHODS 》 *
王瑾等: "实时荧光环介导等温扩增快速检测鸡肉中沙门氏菌", 《食品科学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109402272A (zh) * 2018-08-24 2019-03-01 暨南大学 基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104962607B (zh) 一种单一或多重目的基因片段恒温扩增的检测方法
CN103320434B (zh) 一种沙门氏菌lamp引物组和试剂盒及检测方法
CN101153342B (zh) 轮状病毒a组g3型检测用引物组、检测试剂盒
CN102605055A (zh) 副溶血性弧菌多重定量pcr检测试剂盒及检测方法
CN110106290A (zh) 一种基于CRISPR/Cas系统用于检测ASFV的现场快速检测方法及试剂盒
CN101899521B (zh) 一组用于广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法中的特异性引物组
CN102367475B (zh) 不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒及检测方法
CN113186313A (zh) 基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒
WO2017050934A1 (en) Improved detection of short homopolymeric repeats
CN104975098A (zh) 一种常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法
CN109097448A (zh) 一种基于解旋酶和切刻酶的等温扩增核酸检测方法及试剂盒
CN101368203B (zh) 单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法
CN109777861A (zh) 错配耐受的环介导等温扩增方法及应用
CN105755134A (zh) 一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用
CN102154487A (zh) 检测土拉弗朗西斯菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测土拉弗朗西斯菌的方法
CN107419031A (zh) 基于智能恒温扩增技术检测沙门氏菌的引物组、试剂盒及方法
CN101348835A (zh) 一种利用环介导等温扩增技术检测创伤弧菌的试剂盒
CN111088377B (zh) 金黄色葡萄球菌的快速恒温检测方法、引物组及应用
CN107663546A (zh) 基于智能恒温扩增检测技术检测金黄色葡萄球菌的引物组、试剂盒及方法
Prithiviraj et al. Rapid detection of microbial DNA by a novel isothermal genome exponential amplification reaction (GEAR) assay
KR102009326B1 (ko) cpa와 cpe 타겟 유전자를 통해 클로스트리디움 퍼프린젠스를 검출할 수 있는 Singleplex Real-Time PCR 키트 개발
CN111712583B (zh) 使用多拷贝基因诊断恙虫病的方法
CN104498487A (zh) 一组核苷酸序列及在伊氏李斯特菌鉴定中的应用
CN109402272A (zh) 基于智能恒温扩增技术检测单核增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法
CN101246126A (zh) 沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20171201

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication