CN104498487A

CN104498487A - 一组核苷酸序列及在伊氏李斯特菌鉴定中的应用

Info

Publication number: CN104498487A
Application number: CN201410725837.2A
Authority: CN
Inventors: 王毅; 叶长芸; 王艳
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2014-12-03
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2034-12-03
Also published as: CN104498487B

Abstract

本发明公开了一种核苷酸序列组合，由SEQ ID NO:1-6组成。所述组合中的核苷酸序列分别作为环介导恒温扩增技术中的外引物、内引物和环引物用于伊氏李斯特菌的鉴定方法。与普通PCR和Real-time PCR检测方法相比，本发明的方法具有优异的灵敏性、特异性、快速性和简便性，适合检测条件较差的应急检测和基层检测。

Description

一组核苷酸序列及在伊氏李斯特菌鉴定中的应用

技术领域

本发明涉及环介导恒温扩增技术在细菌检测中的应用，特别是在伊氏李斯特菌鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。

背景技术

伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii，Liv)，又称为绵羊李斯特菌，是广泛存在于环境中的革兰氏阳性、有运动能力、兼性胞内寄生短杆菌，是重要的人兽共患病病原菌。该病原体主要引起反刍动物致病，导致李斯特菌病的暴发和散发，约占动物李斯特菌病的15％。由伊氏李斯特菌所致的动物李斯特菌病，其临床表现为发热、胃肠炎、新生儿败血症以及流产，但不能穿过血脑屏障，侵入神经中枢系统。伊氏李斯特菌也能引起人类李斯特菌病。该李斯特菌病的易感人群主要为免疫力低下人群和免疫缺陷人群，前者包括老年人、新生儿和孕妇；后者为肿瘤患者、艾滋病患者和器官移植受体等。人类伊氏李斯特菌病主要临床症状为败血症、孕妇流产、死产以及发热性胃肠炎等。此外，与其他李斯特菌种比较，该病原体在环境、食品中的分布更为广泛。许多研究表明，伊氏李斯特菌所引起的李斯特菌病被低估。为了给予临床病人或感染动物准确快速的治疗、以及伊氏李斯特菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的伊氏李斯特菌检测方法成为必要。

目前对于伊氏李斯特菌分离鉴定主要依赖于传统的分离、培养和生化鉴定，该方法耗时大约5到7天，包括二次增菌，选择培养及后续的生化鉴定，耗时耗力，而且生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于伊氏李斯特菌的快速诊断，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些条件有限的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技术诊断伊氏李斯特菌的PCR方法和Real-time PCR方法，所选择的目的基因(如iap，Liv22-228)特异性差，极易出现假阳性扩增。此外这些检测技术的灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。

环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由Notomi等发明的一种新型核酸特异性扩增技术。该技术具有灵敏度高、操作简单、产物易检测等优点，已被广泛用于分子生物研究和诊断领域。LAMP针对靶核苷酸序列的6个区域设计4条核心引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下(60～65℃)实现扩增。

LAMP的4条核心引物，包括2条内引物，即FIP(Forward inner primer，FIP)和BIP(Backward inner primer，BIP)，2条外引物(F3和B3)。FIP包含Flc(F1区域的互补序列)和F2，即5′-Flc-F2；BIP包含B1c(B1区域的互补序列)和B2，即5′-Blc-B2。此外，两条环引物(Loop primes,LF和LB)被增加到反应体系，能够加速LAMP扩增反应。

LAMP扩增反应包括两个过程，即哑铃状模板合成阶段和循环扩增阶段。在既定的反应温度下，双链DNA在处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。在Bst DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区段的3′末端为起点，与对应的DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补，以3′末端为起点，通过链置换活性DNA聚合酶的作用，首先置换出FIP引物合成的DNA链，同时合成自身DNA。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。然后由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链，该单链通过5′末端的F1c区段和F1区段互补，发生自我碱基配对，形成茎环状结构。同时，BIP引物同该单链杂交结合，以BIP引物的3′端为起点，合成互补链，在此过程中茎环结构被打开。接着，B3引物BIP引物外侧的互补区域B3c配对结合，以3′端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互补链。通过上述2个过程，形成双链DNA。被置换的单链DNA依据两端存在的互补区域，发生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条被置换出来的DNA在两端呈现哑铃状结构，该结构作为LAMP反应扩增循环的起始结构。LAMP反应扩增循环阶段：首先在哑铃状结构中，以3′末端的Fl区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应，解离由F1区段合成的双链核酸。同样，在解离出的单链核酸上也会形成茎环结构。在茎环结构上存在单链形式B2c，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增，经过相同的过程，又形成茎环结构。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。LAMP反应可以特异、高效、快速的扩增目的DNA，在1小时之内使产物的量达到10⁹个拷贝。

LAMP扩增之后，其产物可以通过琼脂糖电泳后检测扩增子，阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状。其次，实时浊度检测也被用于检测LAMP扩增。现在更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料(如FD试剂,朗普荧光可视试剂)，阳性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。

本发明针对伊氏李斯特菌的种特异基因smcL(NC_015713.1,Listeriaivanovii，Liv)设计一套环介导恒温扩增引物，旨在建立一种针对该病原的快速、敏感和特异的核酸检测体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一组能够应用细菌检测，特别是环介导恒温扩增技术的核苷酸序列，更进一步提供环介导恒温扩增技术检测伊氏李斯特菌的方法，以及应用于该方法的试剂盒。

基于上述目的，本发明首先提供了一种核苷酸序列组合，所述组合由SEQ ID NO:1-6组成。所述序列是根据伊氏李斯特菌种特异性基因Smcl设计的LAMP反应引物，其中，SEQ ID NO:1和2为外引物，SEQ ID NO:3和4为内引物，SEQ ID NO:5和6为环引物。

其次，本发明还提供了上述的核苷酸组合在伊氏李斯特菌鉴定中的应用。

再次，本发明又提供了一种用于检测伊氏李斯特菌的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将待检测样本、序列如SEQ ID NO:1-2所示的一对外引物、序列如SEQ ID NO:3-4所示的一对内引物、序列如SEQ ID NO:5-6所示的一对环引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgSO₄、甜菜碱以及环介导等温扩增缓冲液加入到反应容器中；

(2)将步骤(1)所得的混合液放置于63℃恒温环境中进行DNA扩增反应；

(3)检测步骤(3)获得的产物。

在一个优选的技术方案中，所述MgSO₄的浓度为4mM，所述甜菜碱的浓度为0.8mM。

在一个优选的技术方案中，步骤(1)中所述待检测样本为DNA提取物。

在一个优选的技术方案中，步骤(2)中所述的DNA扩增反应时间为60分钟。

在一个优选的技术方案中，步骤(3)所述的检测方法可以是目测判读、琼脂糖凝胶电泳判读、或者实时浊度仪判读。

优选地，在检测前在反应体系加入荧光试剂，步骤(3)所述的检测方法为目测判读。

最后，本发明提供了一种检测伊氏李斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包括：序列如SEQ ID NO:1-2所示的一对外引物、序列如SEQ ID NO:3-4所示的一对内引物、序列如SEQ ID NO:5-6所示的一对环引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgSO₄、甜菜碱、环介导等温扩增缓冲液。

本发明提供的组合序列在使用环介导恒温扩增技术检测伊氏李斯特菌的方法中显示了优异的灵敏性、特异性、快速性和简便性。

运用连续稀释好的伊氏李斯特基因组DNA进行环介导恒温扩增反应，结果显示：LAMP扩增反应的灵敏度比普通PCR方法高100倍，比Real-time PCR方法高10倍。

LAMP在模拟粪便中的检测下限为8×10³CFU/g，而Real-time PCR扩增检测在模拟粪便中的检测下限为8×10⁴CFU/g。结果表明，在实际应用中，LAMP检测方法10倍敏感于Real-time PCR检测。

该体系在检测26种其他常见致病菌和机会致病菌共94株时未出现非特异性扩增，说明该检测体系的特异性良好。

使用LAMP技术在模拟粪便中仅需一次增菌培养6小时就能检测出阳性结果。

本发明的LAMP检测方法的结果判读不仅可以使用琼脂糖凝胶电泳判读、或者实时浊度仪判读，还可以在事先加入荧光试剂的情况下直接使用肉眼进行目测判读，具有极高的简便性，适合检测条件较差的应急检测和基层检测。

综上所述，基于本发明表现出的优异的灵敏性、特异性、快速性和简便性，本发明提供的组合序列及使用环介导恒温扩增技术检测伊氏李斯特菌的方法具有极为广阔的应用前景。

附图说明

图1.LAMP引物设计的位置和方向示意图；

图2A.LAMP反应的目测浊度结果图；

图2B.LAMP反应的琼脂糖凝胶电泳结果图；

图3.使用琼脂糖凝胶电泳评价LAMP灵敏性的结果图；

图4.使用琼脂糖凝胶电泳评价普通PCR灵敏性的结果图；

图5.使用荧光实时检测方法评价Real-time PCR灵敏性的结果图；

图6.使用实时浊度仪评价LAMP灵敏性的结果图；

图7.使用实时浊度仪评价LAMP快速性的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

引物设计

根据伊氏李斯特菌种特异性基因smcL(NC_015713.1,Listeriaivanovii，Liv)设计LAMP反应引物，该基因存在于伊氏李斯特菌所有亚种中，其特异性好，可以将伊氏李斯特菌与其他密切相近的菌种(如单增李斯特菌，希尔李斯特菌，威尔李斯特菌，伊洛克李斯特菌，格氏李斯特菌)和菌属(如芽孢杆菌属)区分开。利用环介导恒温扩增引物设计软件Primerexplorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)和引物设计软件Primer Premier 5.0设计LAMP引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的一套环介导恒温扩增引物。引物设计的位置和方向见图1，序列见表1。

表1.本发明检测所有引物和探针序列一览表

注1：HEX为黄色荧光发光基团，BHQ为荧光淬灭基团

本发明中所使用和涉及的试剂：

DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)购于德国Qiagen公司。Loopamp Kit(Eiken Chemical Co.Ltd.,Tokyo,Japan)购于日本荣研公司。PCR反应体系混合物MIX(Taq DNA聚合酶，dNTP和缓冲液)购于北京康为世纪生物科技有限公司。DL50DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分析纯产品。

本发明实验中使用和涉及的主要仪器：

Loopamp实时浊度仪LA-320C(Eiken Chemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。PCR仪为Sensoquest Labcycler,德国Sensoquest产品；电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；凝胶成像系统为Bio-Rad Gel Dox XR,美国Bio-Rad产品。

检测实施例1.LAMP方法检测伊氏李斯特菌

1.检测步骤

包括：伊氏李斯特菌的基因组DNA的提取；运用提取的DNA作为模板进行LAMP扩增反应；最后选用3种不同的检测手段对结果进行判读。

(1)基因组提取：

细菌基因组的提取使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒(QIAampDNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，伊氏李斯特菌基因组DNA用GE缓冲液进行连续稀释(从25ng，2.5ng，250pg,25pg,2.5pg,250fg,125fg到62.5fg)。各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。

(2)LAMP扩增反应

LAMP的反应体系：总体积为25μl，包含1.6mM内引物FIP和BIP,0.2mM外引物F3和B3,0.8mM环引物LF和BF,20mM Tris-HCl(pH8.8),10mM KCl,4mM MgSO₄,10mM(NH₄)₂SO₄,0.1％Tween 20,0.8M甜菜碱,1.4mM dNTPs,1μl of Bst DNA聚合酶(8U/mL),1μl FD试剂(朗普荧光可视试剂)和1μl DNA模板.

LAMP的反应条件都为恒温63℃，反应时间为60min。

(3)结果判读：目测判读、琼脂糖凝胶电泳凝胶成像系统判读、或者Loopamp实时浊度仪判读。

2.检测结果

(1)环介导恒温扩增反应引物的可用性

如图2A所示，在预先在反应体系加入朗普荧光可视试剂后，LAMP阳性反应管(1)出现明显的颜色变化，从浅灰色变为绿色(黑白图显示浊度较高)，阴性反应管(2)保持颜色保持不变，仍然为浅灰色(黑白图显示较为清澈)。如图2B所示，通过琼脂糖凝胶电泳，阳性反应产物为特异的阶梯状，而阴性反应不出现任何条带。

(2)LAMP体系的检测特异性

以常见的致病菌及条件致病菌DNA(单增李斯特菌，伊洛克李斯特菌，威尔李斯特菌，希尔李斯特菌，格氏李斯特菌，蜡样芽胞杆菌，肠致病性大肠杆菌，肠产毒性大肠杆菌，肠侵袭性大肠杆菌等)为模板评价LAMP扩增反应体系的特异性(见表2)。

表2

ATCC：美国标准生物品收藏中心

NCTC：英联邦菌种保藏中心

ICDC：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

(3)LAMP扩增体系的灵敏度

运用连续稀释好的伊氏李斯特基因组DNA进行环介导恒温扩增反应，结果显示：LAMP的检测范围为25ng～250fg，当反应体系中基因组模板量降低至250fg以下时，LAMP扩增不出现阳性扩增，见图3和图6。图3通过琼脂糖凝胶电泳显示LAMP扩增结果，图中泳道M为DNA分子量Marker DL100；泳道1到8分别是模板量为25ng～62.5fg的伊氏李斯特基因组DNA；图6运用实时浊度仪读取LAMP扩增结果。根据判读的结果，LAMP扩增反应的灵敏度比普通PCR方法高100倍(见对照实施例1)，比Real-time PCR方法高10倍(见对照实施例2)。

对照实施例1：普通RCR方法检测伊氏李斯特菌

1.检测步骤

普通RCR反应体系：

其中，上游引物序列为SEQ ID NO:1，下游引物序列为SEQ ID NO:2

PCR反应条件：

反应结束后，取10μl PCR产物在2.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，并在凝胶成像系统上观察分析结果。

2.普通PCR检测体系的灵敏度

使用连续稀释好的伊氏李斯特基因组DNA进行普通PCR扩增后显示：当反应体系中基因组模板量降低至25pg以下时，普通PCR扩增后电泳图上未出现目的条带，见图4。图中泳道M为DNA分子量MarkerDL100；泳道1到8分别是模板量为25ng～62.5fg的基因组DNA。

对照实施例2：Real-time RCR方法检测伊氏李斯特菌

1.检测步骤

Real-time RCR反应体系：

其中，上游引物序列为SEQ ID NO:7，下游引物序列为SEQ IDNO:9，探针序列为SEQ ID NO:8。

在ABI PRISM实时荧光定量PCR仪上扩增并测定结果：

扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定该反应的Ct(cycle threshold)值。

2.Real-time PCR检测体系的灵敏度

使用连续稀释好的伊氏李斯特基因组DNA进行Real-time PCR扩增后显示：当反应体系中基因组模板量降低至2.5pg以下时，Real-time PCR扩增后,未见阳性曲线产生，见图5(直接观察曲线变化，当曲线的峰值大于阈值(0.05)时，判读为阳性)。图中信号曲线1到5分别是模板量为25ng～2.5pg的基因组DNA。

检测实施例2：LAMP检测体系的实际应用

运用连续稀释好的伊氏李斯特菌(8×10⁰，8×10¹，8×10²，8×10³和8×10⁴CFU/g)人工污染粪便标本，然后提取DNA进行LAMP和Real-timePCR扩增检测。LAMP在模拟粪便中的检测下限为8×10³CFU/g，而Real-time PCR扩增检测在模拟粪便中的检测下限为8×10⁴CFU/g。结果表明，在实际应用中，LAMP检测方法10倍敏感于Real-time PCR检测。

检测实施例3：LAMP检测体系快速诊断的评价

应用低浓度的伊氏李斯特菌(16CFU/g)人工污染粪便标本，然后进行连续培养(2、4、6、8、10、12、14和20h)，然后每个时间点取样提取DNA进行LAMP扩增检测。使用LAMP技术在模拟粪便中仅需一次增菌培养6h就能检测出阳性结果，见图7。

Claims

1.一种核苷酸序列组合，由SEQ ID NO:1-6组成。

2.权利要求1所述的核苷酸组合在伊氏李斯特菌鉴定中的应用。

3.一种用于检测伊氏李斯特菌的方法，所述方法包括如下步骤：

(3)检测步骤(3)获得的产物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述MgSO₄的浓度为4mM，所述甜菜碱的浓度为0.8mM。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述待检测样本为DNA提取物。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的DNA扩增反应时间为60分钟。

7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的检测方法可以是目测判读、琼脂糖凝胶电泳判读、或者实时浊度仪判读。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在检测前在反应体系加入荧光试剂，步骤(3)所述的检测方法为目测判读。

9.一种检测伊氏李斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包括：序列如SEQID NO:1-2所示的一对外引物、序列如SEQ ID NO:3-4所示的一对内引物、序列如SEQ ID NO:5-6所示的一对环引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgSO₄、甜菜碱、环介导等温扩增缓冲液。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述MgSO₄的浓度为4mM，所述甜菜碱的浓度为0.8mM。