CN110184367B

CN110184367B - 单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌多重pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN110184367B
Application number: CN201910502760.5A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 殷月兰; 冯有为; 孟凡增; 陈思思; 潘志明; 陈祥; 王晶
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2039-06-11
Also published as: CN110184367A

Abstract

本发明提供一种单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌多重PCR检测试剂盒。试剂盒中包括基因lmo0601检测引物以及基因smcl检测引物。本发明建立了利用两对引物快速检测单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的多重PCR方法，具特异性好，有灵敏度高，检测速度快，容易操作，结果判定简单的优点。

Description

单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌多重PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种生物检测方法，特别是涉及一种单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌多重PCR检测试剂盒。

背景技术

李斯特菌是一类分布非常广泛的革兰氏阳性兼性胞内寄生菌。李斯特菌属包含两种致病菌，单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)和伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii,LV)。单核细胞增生李斯特菌是一种重要的食源性人兽共患病原菌，感染人和动物后主要引起脑膜炎、胃肠炎、败血症及流产等，致死率高达20％-30％。伊氏李斯特菌主要感染反刍动物，给畜牧业带来巨大损失。因此，建立针对单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速、有效的检测方法对于两种致病李斯特菌的监测与防控是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌多重PCR检测试剂盒，用于解决现有技术中单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌检测复杂，操作繁琐的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供基因lmo0601和基因smcl在制备检测单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌检测试剂盒中的用途。

将基因lmo0601以及基因smcl用于制备单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌检测试剂，是指将基因lmo0601以及基因smcl作为检测靶标应用于单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的检测。

本发明的一些实施方式中，基于所述基因lmo0601以及基因smcl的序列，筛选特异性针对基因lmo0601以及基因smcl扩增引物对从而作为单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌检测试剂。

本发明提供一种单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的多重PCR检测试剂盒，所述多重PCR检测试剂盒中包括基因lmo0601检测引物以及基因smcl检测引物。

优选地，所述基因lmo0601检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

进一步地，所述基因lmo0601检测引物扩增区域核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

优选地，所述基因smcl检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物。

进一步地，基因smcl检测引物扩增区域核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

本发明采用PCR技术对基因lmo0601以及基因smcl进行检测，根据其扩增情况可分析判断检测对象是否为单核细胞增生李斯特菌或伊氏李斯特菌。因此，引物的设计是本发明试剂盒的关键。

基于本发明所述试剂盒是采用PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：ddH₂O、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

本发明的多重PCR检测试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。

所述PCR检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR反应液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有ddH₂O、dNTP、PCR buffer、rTaq酶。加入本发明的引物、待检样本DNA提取物或者样本菌液即可获得PCR反应体系。

优选地，所述多重PCR检测试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有基因lmo0601和/或基因smcl表达的DNA样本。

优选地，所述多重PCR检测试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为无基因lmo0601以及基因smcl表达的DNA样本。

本发明的另外一个方面提供了上述多重PCR检测试剂盒的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照和/或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管和/或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述基因lmo0601以及基因smcl检测引物；

(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；

(4)PCR反应结束后，分析结果。

上述方法为非疾病诊断目的方法。

进一步地，所述步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术，本领域技术人员可以根据现有操作方法制备。

进一步地，所述步骤(3)中PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃终止10min。

进一步地，所述步骤(4)中分析结果具体如下：扩增出220bp条带时，判定为单核细胞增生李斯特菌阳性；扩增出889bp条带时，判定为伊氏李斯特菌阳性。

本发明的另外一个方面提供了上述多重PCR检测试剂盒在制备基因lmo0601以及基因smcl检测产品中的用途。

所述检测产品用于检测单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌。

如上所述，本发明的单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌多重PCR检测试剂盒，具有以下有益效果：

本发明利用了PCR扩增技术建立了利用两对引物快速检测单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的多重PCR方法。该方法具有特异性好，灵敏度高，容易操作，结果判定简单的优点。经李斯特菌属和非李斯特菌属菌株的实际样本检测测试，未出现假阳性结果，具有良好的特异性。本方法通过一次PCR即可准确判断出单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌，节约时间和成本，加快了检出速度。

附图说明

图1a和1b为本发明实施例1中的多重PCR方法特异性评价实验结果。其中M.DL2000；CK.阴性对照；1-12.依次为血清型1/2a,1/2b,1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d和7的单核细胞增生李斯特菌；13-14.伊氏李斯特菌；15.无害李斯特菌；16.塞氏李斯特菌；17.格氏李斯特菌；18.威氏李斯特菌；19.肠炎沙门菌；20.鸡白痢沙门菌；21.鼠伤寒沙门菌；22.副溶血弧菌；23.大肠杆菌；24.金黄色葡萄球菌；25.空肠弯曲菌；26.结肠弯曲菌。

图2为本发明实施例1中的多重PCR方法灵敏度评价的实验结果。其中M.DL2000；CK.阴性对照；1-9.单核细胞增生李斯特菌EGD-e基因组DNA浓度浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL。

图3为本发明实施例1中的多重PCR方法灵敏度评价的实验结果。其中M.DL2000；CK.阴性对照；1-9.伊氏李斯特菌YZU0805基因组DNA浓度浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL。

图4a和4b为本发明实施例2中的猪肉样品中细菌培养物多重PCR鉴定结果。其中M.DL2000；CK.阴性对照；1.伊氏李斯特菌YZU0805；2.单核细胞增生李斯特菌EGD-e；3-39.猪肉样品中分离的疑似李斯特菌菌株。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

以下实例中，所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；DNA分子量Marker DL2000、2×Taq Master mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

实施例1：单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的多重PCR检测方法的建立

1)引物

从Genebank中下载单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌全基因组序列进行比对，最终确定两个特异性靶基因lmo0601和smcl，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5以及6所示。分别找到这两个靶基因的保守区，设计引物。两对检测用引物序列及相应扩增产物长度如表1所示。

表1单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的多重PCR检测引物

SEQ ID NO：5(lmo0601核苷酸序列)：

atgcataaacatcacttaagcaaaaaactatttttcgctggtttggtactatttattattggtgctatcggtgtagcattcacaatgaatacaggtaaaatgattgaaaaaggagaaccacttacaaaacagtgggacttatcaactgaaaatattaaaaaaattgctttttcttccgagcgtgatgcatcaattgaatggaaagaaagtacaactggaaaaaattatatcgaactaaaagggaattactctgccaatgacaaaaaggcaattcaacaattagagccagtttctgaagatgggacatcctttgatataacggtgcctgaagaagatgattggtataacggctttggcaaaatttacgcttatggaaaacaaaaagtaacaatttatttaacaaaagatactaaattagctgatttagaagtgaaatctcattcaggagatattgatgtagctgattttaaagtaaagaaatttgttagttctactaattctggggagttaaaagtgactaatctggaagcaaatactgctcaaatggctacttcttccggggatttaactttatcgaatatcaaagcaaattcgtcaattgaaacagattctggaaaaacagaattgactaatttaactggtgatttagaagtaaatggtggctcgggcgacgttaatgttgctggagttaaagcaaagaaacttaaaattgctattgattcaggagacattgagctgactagtggtactgtaaccgacttagctgttttaacaacaagttctggggatattgatgcaaatacaaaaggtaaaatccaagctgaatccgattcaggatcaattgaactcgcgggcgcaacaaataatgtaacggcgaaaacgagctcaggtgatatcgatgtagcatttaccaaacaggtgaaaaatatcgaaatcaattcagattctggtgaagttgaacttgagctaccgggtgattttaaagctatttatgaagcaagtagtaattcaggtagcgttaaagcaccaacaagtgattcgaataccgataaccgcgtaacggtgaaaacaagttccggagatattaaaatcgaaaaataa

SEQ ID NO：6(smcl核苷酸序列)：

ttagttattatcagtaaaaccaactacaggataatgatctgaaaaatcttgatacgtataagttttaaaccaagatctcacagaccattgtggtgacttggtatgcaagactttgttatgccatgaatctggacgtgcgtgattgttttcaacaaaaatataatcaaggtattctggtgctgcctttggataactttctttcaacatcgaattagttgttggatcccaagtagccatttgtccgttaaagtttgctggagagctaacttttaaaagttttaacatatcatgatactcatctgtaccgtagttaacattcaaatcgcctccaataaagataacttcttctttagatatatttttatgggcaataaatgtttgaatttcttgcatttgttctgcacgaatctcccggctagtatctttagaaatactcgagtcatccgcttgggtatgagttccaattatatgataaggttttccgtttttcataattttaacataggcgaatcctttattactgagccgatctgcgccaccgccgcgctgaaaaatatgttggcttttttcgacaataggccactggctaacgacagccactccaccatcttccaaagcaaaattggaataatttccttccgttttatcccaaccatgtttacttctcccaattacgggcgtttgatgaggatacatttctctaagattatttaatagtcgatgtgaagcacttgtatcaaaagcttcgtttaaaataacgacatcattacctttcatatagtccgcttgtgcaattaaatcagctcggtgcatttgtccccaattaggatatatattcctagaaaataaataaacgttgtgtgaagtaatcttaaaattacctggatactcatcactagcttgtattttcagctcaccatagtggccaaataaaaatgtgaaaaagagtaaaaaaatgaaagcaccgcatattttgggtattgtttttataattttaaatttttccat

2)基因组DNA模板制备

取菌液2mL，按照常规细菌基因组DNA提取方法制备细菌基因组DNA。基因组DNA提取为分子生物学领域常用方法，常规市售各种细菌DNA提取试剂盒均可实现基因组模板的提取。

3)反应体系及条件

PCR反应体系为：2×Taq Master mix 12.5μL；10μM引物lmo0601F、lmo0601R、smclF和smclR各1μL；基因组DNA模板1μL；ddH₂O补齐至25μL。PCR扩增反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃终止10min；4℃保存。

4)结果判定

SEQ ID NO：7lmo0601正反向引物扩增区域核苷酸序列

caaaacagtgggacttatcaactgaaaatattaaaaaaattgctttttcttccgagcgtgatgcatcaattgaatggaaagaaagtacaactggaaaaaattatatcgaactaaaagggaattactctgccaatgacaaaaaggcaattcaacaattagagccagtttctgaagatgggacatcctttgatataacggtgcctgaagaagatgattggta

SEQ ID NO：8smcl正反向引物扩增区域核苷酸序列

cacagaccattgtggtgacttggtatgcaagactttgttatgccatgaatctggacgtgcgtgattgttttcaacaaaaatataatcaaggtattctggtgctgcctttggataactttctttcaacatcgaattagttgttggatcccaagtagccatttgtccgttaaagtttgctggagagctaacttttaaaagttttaacatatcatgatactcatctgtaccgtagttaacattcaaatcgcctccaataaagataacttcttctttagatatatttttatgggcaataaatgtttgaatttcttgcatttgttctgcacgaatctcccggctagtatctttagaaatactcgagtcatccgcttgggtatgagttccaattatatgataaggttttccgtttttcataattttaacataggcgaatcctttattactgagccgatctgcgccaccgccgcgctgaaaaatatgttggcttttttcgacaataggccactggctaacgacagccactccaccatcttccaaagcaaaattggaataatttccttccgttttatcccaaccatgtttacttctcccaattacgggcgtttgatgaggatacatttctctaagattatttaatagtcgatgtgaagcacttgtatcaaaagcttcgtttaaaataacgacatcattacctttcatatagtccgcttgtgcaattaaatcagctcggtgcatttgtccccaattaggatatatattcctagaaaataaataaacgttgtgtgaagtaatcttaaaattacctggatactcatcactagcttgtattttcagctcaccatagtggccaaataaaaatgtgaaaaagagtaaaaaaatgaaagcaccg

凝胶条带判定方法为：扩增出220bp条带时，判定为单核细胞增生李斯特菌阳性；扩增出889bp条带时，判定为伊氏李斯特菌阳性。

5)多重PCR方法特异性评价实验

表2共涉及细菌26株。其中李斯特菌属细菌18株，包括单核细胞增生李斯特菌12株，伊氏李斯特菌2株，无害李斯特菌、塞氏李斯特菌、格氏李斯特菌和威氏李斯特菌各1株；非李斯特菌属细菌8株，其中肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌各1株。

表2单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌多重PCR检测方法特异性评价实验参考菌株

以表2中的26株细菌的基因组DNA作为模板。在PCR小管中分别分别加入12.5μL 2×Taq Master mix，基因组DNA模板1μL，10μM引物lmo0601F、lmo0601R、smclF和smclR各1μL，用ddH2O补齐到25μL并混匀，同时设置阴性对照。多重PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳并分析结果。

图1a和1b所示为多重PCR方法特异性评价实验结果。其中M.DL2000；CK.阴性对照；1-12.依次为血清型1/2a,1/2b,1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d和7的单核细胞增生李斯特菌；13-14.伊氏李斯特菌；15.无害李斯特菌；16.塞氏李斯特菌；17.格氏李斯特菌；18.威氏李斯特菌；19.肠炎沙门菌；20.鸡白痢沙门菌；21.鼠伤寒沙门菌；22.副溶血弧菌；23.大肠杆菌；24.金黄色葡萄球菌；25.空肠弯曲菌；26.结肠弯曲菌。

12株不同血清型的单核细胞增生李斯特菌均扩增出220bp特异性条带；2株伊氏李斯特菌均扩增出889bp特异性条带；而12株阴性菌株均无特异性扩增条带。以上结果表明本发明多重PCR方法易于操作和结果判定且具有良好的特异性。

6)多重PCR方法灵敏度评价实验

提取单核细胞增生李斯特菌EGDe和伊氏李斯特菌YZU0805的基因组DNA并测出初始浓度，以ddH₂O调整浓度至100ng/μL，随后进行10倍连续梯度稀释至1fg/μL置于冰上备用。在PCR小管中分别加入12.5μL 2×Taq Master mix，取各稀释度的基因组DNA 1μL作为模板，10μM引物lmo0601F、lmo0601R、smclF和smclR各1μL，用ddH₂O补齐到25μL并混匀，同时设置一个阴性对照。多重PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳并分析结果。

结果如图2、图3所示，图2中M.DL2000；CK.阴性对照；1-9.单核细胞增生李斯特菌EGD-e基因组DNA浓度浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL。图3中M.DL2000；CK.阴性对照；1-9.伊氏李斯特菌YZU0805基因组DNA浓度浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL。

多重PCR方法对单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的基因组DNA检测灵敏度分别为1pg/μL、100fg/μL，说明该方法具有较高的灵敏度。

实施例2试剂盒的制备

分别合成基因lmo0601检测引物以及基因smcl检测引物，具体见表1。

上述引物可以独立包装也可以分别单独包装，其用量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。

也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的各组引物对，也可以是含有配置好的含有各组引物PCR检测混合液。

进一步地，上述试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：ddH2O、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂等常用PCR反应试剂中的一种或多种

实施例3：猪肉样品中细菌培养物多重PCR鉴定

利用本发明所建立的多重PCR方法，对近期从猪肉样品中分离的37株疑似李斯特菌的菌株进行多重PCR鉴定，与此同时参考GB 4789.30-2016中的生化鉴定方法对多重PCR鉴定结果进行验证。菌株信息如表3所示。

表3猪肉样品中单核细胞增生李斯特菌分离株

菌株基因组模板提取方法按照常规细菌DNA提取试剂盒方法进行。利用实施例2中的试剂盒对DNA进行扩增：在PCR小管中分别加入12.5μL 2×Taq Master mix，基因组DNA模板1μL，10μM引物lmo0601F、lmo0601R、smclF和smclR各1μL，用ddH₂O补齐到25μL并混匀，同时设置一个阴性对照。多重PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳并分析结果。

多重PCR鉴定结果如图4a和4b所示，其中M.DL2000；CK.阴性对照；1.伊氏李斯特菌YZU0805；2.单核细胞增生李斯特菌EGD-e；3-39.猪肉样品中分离的疑似李斯特菌菌株。

可见，这37株细菌均为单核细胞增生李斯特菌，与生化鉴定结果完全一致，说明了该检测方法的准确度很高。且相较于生化鉴定的方法，本发明所建立的多重PCR方法耗时更短、成本更低，适合应用到样品的检测中。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌多重PCR检测试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caaaacagtg ggacttatca ac 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taccaatcat cttcttcagg ca 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacagaccat tgtggtgact tg 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggtgctttc atttttttac tc 22

<210> 5

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcataaac atcacttaag caaaaaacta tttttcgctg gtttggtact atttattatt 60

ggtgctatcg gtgtagcatt cacaatgaat acaggtaaaa tgattgaaaa aggagaacca 120

cttacaaaac agtgggactt atcaactgaa aatattaaaa aaattgcttt ttcttccgag 180

cgtgatgcat caattgaatg gaaagaaagt acaactggaa aaaattatat cgaactaaaa 240

gggaattact ctgccaatga caaaaaggca attcaacaat tagagccagt ttctgaagat 300

gggacatcct ttgatataac ggtgcctgaa gaagatgatt ggtataacgg ctttggcaaa 360

atttacgctt atggaaaaca aaaagtaaca atttatttaa caaaagatac taaattagct 420

gatttagaag tgaaatctca ttcaggagat attgatgtag ctgattttaa agtaaagaaa 480

tttgttagtt ctactaattc tggggagtta aaagtgacta atctggaagc aaatactgct 540

caaatggcta cttcttccgg ggatttaact ttatcgaata tcaaagcaaa ttcgtcaatt 600

gaaacagatt ctggaaaaac agaattgact aatttaactg gtgatttaga agtaaatggt 660

ggctcgggcg acgttaatgt tgctggagtt aaagcaaaga aacttaaaat tgctattgat 720

tcaggagaca ttgagctgac tagtggtact gtaaccgact tagctgtttt aacaacaagt 780

tctggggata ttgatgcaaa tacaaaaggt aaaatccaag ctgaatccga ttcaggatca 840

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gatattaaaa tcgaaaaata a 1101

<210> 6

<211> 1008

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttagttatta tcagtaaaac caactacagg ataatgatct gaaaaatctt gatacgtata 60

agttttaaac caagatctca cagaccattg tggtgacttg gtatgcaaga ctttgttatg 120

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tgcctttgga taactttctt tcaacatcga attagttgtt ggatcccaag tagccatttg 240

tccgttaaag tttgctggag agctaacttt taaaagtttt aacatatcat gatactcatc 300

tgtaccgtag ttaacattca aatcgcctcc aataaagata acttcttctt tagatatatt 360

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atctttagaa atactcgagt catccgcttg ggtatgagtt ccaattatat gataaggttt 480

tccgtttttc ataattttaa cataggcgaa tcctttatta ctgagccgat ctgcgccacc 540

gccgcgctga aaaatatgtt ggcttttttc gacaataggc cactggctaa cgacagccac 600

tccaccatct tccaaagcaa aattggaata atttccttcc gttttatccc aaccatgttt 660

acttctccca attacgggcg tttgatgagg atacatttct ctaagattat ttaatagtcg 720

atgtgaagca cttgtatcaa aagcttcgtt taaaataacg acatcattac ctttcatata 780

gtccgcttgt gcaattaaat cagctcggtg catttgtccc caattaggat atatattcct 840

agaaaataaa taaacgttgt gtgaagtaat cttaaaatta cctggatact catcactagc 900

ttgtattttc agctcaccat agtggccaaa taaaaatgtg aaaaagagta aaaaaatgaa 960

agcaccgcat attttgggta ttgtttttat aattttaaat ttttccat 1008

<210> 7

<211> 220

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaaacagtg ggacttatca actgaaaata ttaaaaaaat tgctttttct tccgagcgtg 60

atgcatcaat tgaatggaaa gaaagtacaa ctggaaaaaa ttatatcgaa ctaaaaggga 120

attactctgc caatgacaaa aaggcaattc aacaattaga gccagtttct gaagatggga 180

catcctttga tataacggtg cctgaagaag atgattggta 220

<210> 8

<211> 889

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacagaccat tgtggtgact tggtatgcaa gactttgtta tgccatgaat ctggacgtgc 60

gtgattgttt tcaacaaaaa tataatcaag gtattctggt gctgcctttg gataactttc 120

tttcaacatc gaattagttg ttggatccca agtagccatt tgtccgttaa agtttgctgg 180

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caaatcgcct ccaataaaga taacttcttc tttagatata tttttatggg caataaatgt 300

ttgaatttct tgcatttgtt ctgcacgaat ctcccggcta gtatctttag aaatactcga 360

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ttggcttttt tcgacaatag gccactggct aacgacagcc actccaccat cttccaaagc 540

aaaattggaa taatttcctt ccgttttatc ccaaccatgt ttacttctcc caattacggg 600

cgtttgatga ggatacattt ctctaagatt atttaatagt cgatgtgaag cacttgtatc 660

aaaagcttcg tttaaaataa cgacatcatt acctttcata tagtccgctt gtgcaattaa 720

atcagctcgg tgcatttgtc cccaattagg atatatattc ctagaaaata aataaacgtt 780

gtgtgaagta atcttaaaat tacctggata ctcatcacta gcttgtattt tcagctcacc 840

atagtggcca aataaaaatg tgaaaaagag taaaaaaatg aaagcaccg 889

Claims

1.一种单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重PCR检测试剂盒中包括基因lmo0601检测引物以及基因smcl检测引物，所述基因lmo0601检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO .2所示的反向引物；所述基因smcl检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO .4所示的反向引物。

2.根据权利要求1所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述多重PCR检测试剂盒中包括ddH₂O、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述多重PCR检测试剂盒还含有阳性对照和/或阴性对照。

4.如权要求1~3任意一项所述的单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的多重PCR检测试剂盒非疾病诊断目的的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照和/或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管和/或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述基因lmo0601以及基因smcl检测引物；

(4)PCR反应结束后，分析结果。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，35个循环；72℃终止10 min。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中结果分析方法具体如下：扩增出220 bp条带时，判定为单核细胞增生李斯特菌阳性；扩增出889 bp条带时，判定为伊氏李斯特菌阳性。

7.如权利要求1~3任意一项所述的单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌多重PCR检测试剂盒在制备基因lmo0601以及基因smcl检测产品中的用途。