CN110358851B - 用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列、引物及方法和试剂盒 - Google Patents

用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列、引物及方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN110358851B
CN110358851B CN201910750182.7A CN201910750182A CN110358851B CN 110358851 B CN110358851 B CN 110358851B CN 201910750182 A CN201910750182 A CN 201910750182A CN 110358851 B CN110358851 B CN 110358851B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus cereus
gfa
detection
primer
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910750182.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110358851A (zh
Inventor
赵圣明
王宝石
赵岩岩
马汉军
朱明明
娄文娟
谭凤玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Institute of Science and Technology
Original Assignee
Henan Institute of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Institute of Science and Technology filed Critical Henan Institute of Science and Technology
Priority to CN201910750182.7A priority Critical patent/CN110358851B/zh
Publication of CN110358851A publication Critical patent/CN110358851A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110358851B publication Critical patent/CN110358851B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列、引物及方法和试剂盒，属于食品安全检测技术领域。本发明根据3个蜡样芽孢菌的特异性核酸序列设计得到3对特异性检测引物，并建立PCR方法，检测结果特异性强；检测方法包括提取样品基因组DNA，应用特异性引物进行PCR扩增，通过凝胶电泳检测扩增产物，确定是否有269bp、750bp和591bp大小的条带；试剂盒包括特异性引物、MgCl2、PCR缓冲液、dNTP和Taq‑DNA聚合酶。本发明提供的检测方法和试剂盒能够有效的检测出食品中存在的蜡样芽孢杆菌，且具有检测灵敏度高和特异性好的优点，可广泛应用于食品中蜡样芽孢杆菌的检测。

Description

用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列、引物及方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体的说是涉及一种用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列、特异性引物及检测方法和检测试剂盒。
背景技术
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是食品中常见的一种革兰氏阳性、有鞭毛、可形成芽孢的条件致病菌。蜡样芽孢杆菌污染食品可导致食物中毒事件发生，主要症状表现为呕吐或者腹泻，蜡样芽孢杆菌还可以分泌产生呕吐毒素和肠毒素，严重可能导致局部或全身感染。常见的食品(谷物类、调味品、乳制品和肉制品等)都能被蜡样芽孢杆菌污染。据统计，2002-2015年期间发生在学校的1291起食源性疾病爆发事件，其中由于生物污染导致的占57.9％，而蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌、沙门氏菌一起位居致病微生物污染的前3位。我国对食品中蜡样芽孢杆菌的检测主要采用GB 4789.14-2014《食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》中的方法，该方法属于传统的鉴别培养基分离法，对选择性平板上生长得到的菌株进行计数。虽然操作简单，对实验设备要求不高，但是检测周期较长，需要至少3天的检测时间。基于核酸的分子生物学检测技术近年来在微生物检测中迅速发展起来，目前基于特异性检测靶点的PCR检测技术已经广泛应用于食品病原微生物的快速检测。例如基于rpoB和ompA等特异性基因对克罗诺杆菌属进行PCR方法快速检测，基于gene_3105为特异性靶点对甲型副伤寒沙门氏菌进行PCR方法快速检测，以及基于LMOf 2365_2721和AX 25_00730为特异性靶点对单增李斯特菌进行PCR方法快速检测等。
目前基于特异性靶点基因对蜡样芽孢杆菌的PCR检测方法已有较多报道，包括基于gyrB、16 S rRNA、pcplc和HBLA等许多特异性靶点已经被广泛应用于蜡样芽孢杆菌的PCR方法快速检测研究中，其序列的特异性已经被充分挖掘。但是由于一些靶点基因的特异性不强，应用中可以扩增出一些非蜡样芽孢杆菌的其他菌属基因。因此，为了丰富蜡样芽孢杆菌的PCR快速检测方法，减少检测结果中的假阳性结果，开发一种特异性和灵敏度更高的检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列、特异性引物及检测方法和检测试剂盒，检测试剂盒具有检测灵敏度高和特异性好的优点，解决了现有技术中对蜡样芽孢杆菌检测结果不准确及检测时间长等技术问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列，包括gene_2625、gene_2626、gene_2627；所述gene_2625的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述gene_2626的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述gene_2627的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，用于检测蜡样芽孢杆菌的PCR引物，所述引物分别为引物对gFA1、gFA 2、gFA 3；具体引物序列如下：
gFA1-f：5’-TCCAAGTTGTACCAGAGATTGATGCT-3’；SEQ ID NO.4；
gFA1-r：5’-GCGAATAGTGCGGAGTATGGATTCTATA-3’；SEQ ID NO.5；
gFA 2-f：5’-GGCTAGGCAGTACCGAGGAAGAA-3’；SEQ ID NO.6；
gFA 2-r：5’-TAGCGTATCCTGGTTGAACTGGTAATTG-3’；SEQ ID NO.7；
gFA 3-f：5’-CCACGCTACTTCCTGGAATCTACAA-3’；SEQ ID NO.8；
gFA 3-r：5’-GGAATGCCTGTTCTCTTGCTACTGA-3’；SEQ ID NO.9。
进一步，一种检测蜡样芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)提取样品DNA，进行PCR扩增；
(2)凝胶电泳检测PCR扩增产物；
(3)观察电泳后条带，若在269bp或750bp或591bp位置处有条带产生，表明样品中有蜡样芽孢杆菌。
进一步，步骤(1)所述PCR扩增的反应体系为：10xPCR buffer 3μL、0.5μmol/LdNTP 2μL、4.5mmol/L MgCl2 2μL、0.6U Taq聚合酶2μL、0.8μmol/L引物gFA 1或gFA 2或gFA3 2μL(上下游引物各1μL)、DNA模板2μL、ddH2O 12μL，总反应体系25μL。
进一步，步骤(1)所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。
进一步，步骤(2)所述凝胶电泳为琼脂糖凝胶电泳。
进一步，以25μL PCR反应体系计量，对于所述的gFA 1、gFA 2、gFA 3引物，需要蜡样芽孢杆菌总DNA浓度≥3.595pg/μL。
进一步，一种检测蜡样芽孢杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对gFA 1、gFA 2、gFA 3。
进一步，所述试剂盒还包括15mM MgCl2、10×PCR buffer、0.2mM dNTP、Taq-DNA聚合酶。
进一步，所述的核酸序列或所述的PCR引物或所述的试剂盒在检测蜡样芽孢杆菌中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列、引物及方法和试剂盒，本发明应用生物信息学和比较基因组学方法从蜡样芽孢杆菌的全基因数据库中筛选获得蜡样芽孢杆菌的特异性核酸序列，并设计特异性引物进行PCR扩增、电泳检测目的基因，本发明检测结果准确，检测周期短和结果判定简单，实现了对蜡样芽孢杆菌高特异性快速检测的目的。
本发明提供检测蜡样芽孢杆菌的3个特异性核酸序列、相应的引物对、利用以上核酸序列和引物对进行检测，特异性引物对是根据蜡样芽孢杆菌的特异性核酸序列设计而成，该特异性核酸序列具有稳定性高、特异性强等优点，经PCR扩增反应和凝胶电泳检测后，可以快速准确的检测出蜡样芽孢杆菌。利用本发明提供的方法判定基因组的最低检测限为3.595pg/μL，本发明可以广泛应用于食品中蜡样芽孢杆菌的检测。
本发明以筛选得到的核酸序列设计特异性引物对进行PCR扩增和电泳检测蜡样芽孢杆菌的目的核酸序列，以该特异性核酸序列建立蜡样芽孢杆菌的PCR检测体系，并将其应用于鸡肉、牛肉和猪肉实际样品中进行检测，为食品安全领域蜡样芽孢杆菌的快速检测提供了技术支持，为食品的腐败和食源性疾病预防控制提供了理论指导。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明特异性引物对gFA 1对不同菌种特异性评价凝胶电泳图；
图2附图为本发明特异性引物对gFA 2对不同菌种特异性评价凝胶电泳图；
图3附图为本发明特异性引物对gFA 3对不同菌种特异性评价凝胶电泳图；
图1-图3中，M为DL2000marker(从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；泳道1-31分别为表1中1-31号菌株；
图4附图为本发明特异性引物对gFA 1对不同浓度基因组模板灵敏度评价凝胶电泳图；
图5附图为本发明特异性引物对gFA 2对不同浓度基因组模板灵敏度评价凝胶电泳图；
图6附图为本发明特异性引物对gFA 3对不同浓度基因组模板灵敏度评价凝胶电泳图；
图4-图6中，M为DL2000 marker；泳道1-6为别为359.5fg/μl、3.595pg/μl、35.95pg/μl、359.5pg/μl、3.595ng/μl、35.95ng/μl的DNA模板。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1PCR检测方法对不同菌种特异性评价
(1)蜡样芽孢杆菌特异性核酸序列的筛选
从NCBI基因组公共数据库中，获取蜡样芽孢杆菌ATCC 14579的基因组DNA序列数据。根据比较基因组学的方法将该代表菌株的全基因组DNA序列中的每1个基因在NCBI的BLAST程序中进行比对，在选择的过程中要求Query cover值为100％的同源性最好，同时与其它芽孢菌属的菌株不具有同源性的基因(Query cover值＜10％)作为该蜡样芽孢杆菌的准特异性核酸序列。比对后共获得11个准特异性核酸序列(与蜡样芽孢杆菌具有同源性与其他微生物不具有同源性)。选取以上核酸序列为模板，使用Primer 5.0设计引物。以5株蜡样芽孢杆菌和26株非蜡样芽孢杆菌(表1)的基因组DNA为模板，进行PCR特异性验证。根据结果表明基因gene_2625、gene_2626、gene_2627相对其他基因表现出更好的特异性，蜡样芽孢杆菌菌株基因组DNA可扩增出特异性条带，非蜡样芽孢杆菌菌株DNA均未扩增出目标条带。因此，筛选确定基因gene_2625、gene_2626、gene_2627为蜡样芽孢杆菌的特异性核酸序列。
(2)引物设计
通过BLAST分析获得的蜡样芽孢杆菌准特异性基因数量相对较多，因此在设计引物过程中，选择序列长度在400bp以上的基因设计引物。使用Premier 5.0软件设计引物，获得的引物再通过Oligo 6.0软件和BLAST网站进行分析，选择二聚体较少、自身无发夹结构、退火温度为60℃左右及与非模板DNA同源性较低的引物作为该基因的特异性引物。从备选引物中筛选确定3对特异性引物对：gFA 1、gFA 2、gFA 3，核酸序列分别为：
gFA1-f：5’-TCCAAGTTGTACCAGAGATTGATGCT-3’；SEQ ID NO.4；
gFA1-r：5’-GCGAATAGTGCGGAGTATGGATTCTATA-3’；SEQ ID NO.5；
gFA 2-f：5’-GGCTAGGCAGTACCGAGGAAGAA-3’；SEQ ID NO.6；
gFA 2-r：5’-TAGCGTATCCTGGTTGAACTGGTAATTG-3’；SEQ ID NO.7；
gFA 3-f：5’-CCACGCTACTTCCTGGAATCTACAA-3’；SEQ ID NO.8；
gFA 3-r：5’-GGAATGCCTGTTCTCTTGCTACTGA-3’；SEQ ID NO.9；
上述引物委托武汉金开瑞生物工程有限公司进行合成。
(3)DNA模板的制备
将包括5株蜡样芽孢杆菌菌株，11株与蜡样芽孢杆菌同源性比较接近的芽孢杆菌菌属菌株，15株食品检出率较高的食源性腐败菌和致病菌菌株(表1)(编号CGMCC的菌株购自于中国普通微生物菌种保藏中心，编号CICC的菌株购自于中国工业微生物菌种保藏中心，编号ATCC的菌株购自于美国标准生物评保藏中心，编号CMCC的菌株购自于中国医学微生物菌种保藏中心，编号AS的菌株购自于中国科学院微生物研究所，无编号的为本实验保藏的菌株)接种于50mL液体LB或MRS培养基中，于37℃条件下培养12h后，分别取1mL的菌悬液于1.5mL的离心管中，经8000r/min离心2min后弃上清。使用上海生工Ezup柱式细菌基因组提取试剂盒提取所有供试菌株的基因组DNA作为PCR扩增模板。
(4)PCR扩增体系的建立
建立PCR扩增体系：25μL反应体系包括：10×PCR buffer 3μL、2.5mM dNTP 2μL、25mM MgCl2 2μL、0.6U Taq聚合酶2μL、0.8μM引物gFA 1或gFA 2或gFA 3 2μL、DNA模板2μL、ddH2O 12μL，总反应体系25μL。
设定PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。于PCR仪中按照上述反应体系和反应程序，分别以上述步骤中提取的各菌株的DNA模板进行扩增，用于下一步凝胶电泳检测。
(5)凝胶电泳检测
将上述PCR扩增产物和Marker(DL 2000)分别取6μL添加于到1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，120v电压电泳1h后，经Gold View荧光染色后在凝胶成像仪中观察电泳结果。
PCR检测结果如表1和图1-图3所示，以5株蜡样芽孢杆菌和26株非蜡样芽孢杆菌的基因组DNA为模板，进行PCR扩增后仅有蜡样芽孢杆菌在269bp、750bp、591bp位置出现特异性电泳条带，为阳性结果，以“+”表示；非蜡样芽孢杆菌菌株DNA均未扩增出目标条带，为阴性结果，以“－”表示。结果表明本发明提供的检测方法，特异性强，稳定性好，检测结果准确。
表1 所用菌株及PCR扩增结果
Figure BDA0002166929750000071
Figure BDA0002166929750000081
注：+表示PCR阳性结果；－表示PCR阴性结果。
实施例2 PCR检测方法对不同模板浓度灵敏度评价
蜡样芽孢杆菌的特异性核酸序列筛选和引物设计步骤同实施例1。
DNA模板的制备：吸取50μL于-80℃低温保存的蜡样芽孢杆菌菌液，接种于50mL LB液体培养基，37℃培养12h。使用上海生工Ezup柱式细菌基因组提取试剂盒提取蜡样芽孢杆菌的基因组DNA，经测定，浓度为35.95ng/μl，利用无菌蒸馏水进行10倍的梯度稀释。共稀释6个梯度，以稀释后的DNA溶液作为PCR扩增模板。
PCR扩增体系的建立：
建立PCR扩增体系：25μL反应体系包括：10×PCR buffer 3μL、2.5mM dNTP 2μL、25mM MgCl2 2μL、0.6U Taq聚合酶2μL、0.8μM引物gFA 1或gFA 2或gFA 3 2μL、DNA模板2μL、ddH2O 12μL，总反应体系25μL。PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。于PCR仪中按照上述反应体系和反应程序，分别以上述步骤中提取并稀释的各菌株的DNA模板进行扩增，用于下一步凝胶电泳检测。
取6μL PCR扩增产物添加到1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，120v电压电泳1h后，经Gold View荧光染色后在凝胶成像仪中观察电泳结果。
电泳结果见图4-图6(泳道1-6分别为359.5fg/μl、3.595pg/μl、35.95pg/μl、359.5pg/μl、3.595ng/μl、35.95ng/μl的DNA模板；M为DL 2000 marker)。由图4-图6可知，引物对gFA 1、gFA 2、gFA 3在泳道2-6的269bp、750bp、591bp位置处均获得扩增条带，第2泳道相应的模板DNA浓度为3.595pg/μL。泳道1只有750bp位置处有扩增条带，相应的模板DNA浓度为359.5fg/μL。因此判定对于引物gFA 2的检测灵敏度较高可达359.5fg/μL，gFA 1和gFA3灵敏度为3.595pg/μL。
实施例3蜡样芽孢杆菌人工污染试验
将蜡样芽孢杆菌接种于LB培养基中增菌12h后，使用0.9％无菌生理盐水进行10倍梯度稀释。取不同稀释度的菌液接种于经巴氏杀菌(85℃处理15s)的牛肉样品中，每个处理进行3个重复。每个样品取25g，分别用1mL不同稀释度的蜡样芽孢杆菌菌液污染后，无菌均质2min，置入225ml的LB液体培养基中，在37℃、180rpm的条件下增菌培养12h。牛肉样品的污染浓度分别为4.62×103CFU/g、4.62×102CFU/g、4.62×101CFU/g和4.62×100CFU/g。在培养过程中从4h开始每隔2h取1mL的增菌液提取DNA，按照实施例1中的反应条件进行PCR扩增，同时以无菌水作为对照。扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，检测结果见表2。
表2 人工污染牛肉样品PCR扩增结果
Figure BDA0002166929750000091
表2结果表明，当增菌培养10h后，3对引物均能检测出各污染浓度样品中的蜡样芽孢杆菌。而增菌4h时，只有污染浓度为4.62×103CFU/g的样品，才可以检测到蜡样芽孢杆菌。
实施例4使用本发明中的试剂盒进行实际样品检测
按照本发明中建立的PCR反应体系开发蜡样芽孢杆菌检测试剂盒，并以此为基础对市售的样品进行检测，以GB4789.14-2014《食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》中的方法2进行对照。
本发明中所建立的试剂盒中包括以下试剂和酶：3对特异性引物(10μM)gFA 1、gFA2、gFA 3的上下游引物各500μL、MgCl2(15mM)800μL、10×PCR buffer 1mL、脱氧核苷三磷酸混合物(0.2mM)500μL、Taq-DNA聚合酶(1U/μL)500μL。本试剂盒理论使用次数400次以上。
本发明的试剂盒使用说明如下：
(1)在无菌条件下称取待检样品10g，加入90mL LB培养基(或其他适宜的培养基亦可)中，37℃培养12h；
(2)使用市售试剂盒提取基因组DNA；
(3)按照如下体系进行PCR扩增：10×PCR buffer 3μL、2.5mM dNTP 2μL、25mMMgCl2 2μL、0.6U Taq聚合酶2μL、0.8μM引物gFA 1或gFA 2或gFA 3 2μL、DNA模板2μL、ddH2O12μL，总反应体系25μL。
(4)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，在凝胶成像中观察是否在269bp或750bp或591bp位置出现特异性电泳条带，如果存在则为阳性，如果不存在，则为阴性。
53份样品均购买于河南新乡各大超市和农贸市场，按照本发明中试剂盒的使用说明和GB 4789.14-2014《食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》中的方法2进行对照检测，检测结果见表3。
表3 本发明试剂盒和国家标准检测方法对市售样品的检测结果
Figure BDA0002166929750000101
表3结果显示，GB 4789.14-2014《食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》中的方法2共检出10个样品的蜡样芽孢杆菌呈阳性，本发明所建立的试剂盒共检出11个样品的蜡样芽孢杆菌呈阳性，两者结果基本一致，说明本发明中试剂盒检测结果具有较高的可靠性。
综上所述，本发明应用生物信息学和比较基因组学方法从蜡样芽孢杆菌的全基因数据库中筛选蜡样芽孢杆菌的特异性核酸序列，并设计特异性引物进行PCR扩增、电泳检测目的基因，本发明检测结果准确，检测周期短且结果判定简单，实现了对蜡样芽孢杆菌的高特异性快速检测。
本发明提供检测蜡样芽孢杆菌的3个特异性核酸序列、相应的引物对、利用以上核酸序列和引物对进行检测，特异性引物对是根据蜡样芽孢杆菌的特异性核酸序列设计而成，该特异性核酸序列具有稳定性高、特异性强等优点，经PCR扩增反应和凝胶电泳检测后，可以快速准确的检测出蜡样芽孢杆菌。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 河南科技学院
<120> 用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列、引物及方法和试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 951
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgatccaac ctgtaactaa agtcatttta ttctcagaag taaattcgaa atttggttta 60
ccgtttcttc aggaattaat acaagagcct tctatttctg tagaggctct tgtaactagt 120
cccgaaggaa agttatgttc ttattatatt ggagaacctg atcaagttga tttagaaaaa 180
gaagccaaag acattggaat tcccgtgtta cgaccggata aactgaatta ttctaacaca 240
atagaattat taaaaaatta taatgctgac tattttatta ttgctaatta ccaaaaaatc 300
ttaaaagaag atattttatc tatcccaaaa gaagatacta taaattttca tccaagccca 360
ttacctaggt atgctggatt agcacctttt ttctggatgg ctaaaaatgg agaaaaagaa 420
ggtggtgttt catgtatcca agttgtacca gagattgatg ctggtcctat tttagctcaa 480
ttgccagttg tgatgtcagg gactgaaacg gctttagaaa ttcgagagac acattttaaa 540
caatccatta ttttactaaa acaagttctt caaaaaatta aaaacaatga tttcacttca 600
aaattgcagt tattgtctaa tcgaacctat tatagtcaac caaaagaaga agattatttt 660
gtaaattggg aacaggatat agaatccata ctccgcacta ttcgcgctgg gtatccacaa 720
ggagctttgg catttaatca ttataatgaa aaaatccgaa tattaagtgc tgaaagaaca 780
gaatatcctc aaccaattca aagtattggt gtatttcgtg aacataacaa taaaattctt 840
gtttctacaa aagatggatg gcttcattta caaatgatta taaatgatgt tttatcaacc 900
agcacacaaa tagatgaaca agaacataat gaacaggtag tgtcaattta a 951
<210> 2
<211> 843
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgtattggg aacgcgtaaa ccgaagcctt ggatggctag gcagtaccga ggaagaacaa 60
gtacaaagac agaaaaaact acgcgatgct gttgttggaa ttgcaggaac tggtggtatt 120
ggaggagcac ttgctacacg tcttgttaga atgggagtaa gaaatctaaa acttgcagat 180
ccagattcat ttgatgtttc gaatatgaat agacaaatgg gtgctgatct ggatcatcta 240
ggaaaaaata aagctgaagt tgttgctgaa atgacttaca atcttacgaa agatgtaaac 300
atagaggtat atccagaggg aattactcct gaaagtgctg aggagtttat gaaggattgt 360
gattacgttt tagaccagat ggatttttac gaaattcgta atcgatatgc attacatcgt 420
gcttttcgaa aatcagatcg ctgtaaattc atgttaaaag tccctacagt tgcgcatggt 480
acatatattt ataaatacac aaaagattct atgcctatcg aagaagtata tggaattccc 540
gaagatgcta caatgactcc agaggttatt aaaagactta tggaacgcct tatccctgaa 600
atgccttcat atccaagtaa agaaatgtta gatcattggt ttatcgactt agagagaatg 660
cctatttttg ctggatgccc accgcttgca gaaggtgttt tagcagagcg attagcatta 720
gctattacag aacttgatca attgtcaggt gctcagcaat taccagttca accaggatac 780
gctatgtttg atactatggc ttggcaatct aaaatagttc atggtaagtg gtggtctgaa 840
tga 843
<210> 3
<211> 978
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgggaattg aaattatatt tcctccgtat atagcaaata acaaagaaac gctgttacaa 60
cgcattcaat tttctttttc acctttgaat gaaatgtttc gaagcatgca tgtattaaac 120
aatccaaaac atcacgggat tcacttacca tgggttattg aagctaaaaa aaacttaaca 180
aatgaaatgc aaaaggatct acaatatttt aatctatgtt ttgaactagg agttccaccc 240
acgctacttc ctggaatcta caaatctgta ttcacaattg aagaggagat agaattactt 300
gctaaaaaat taactgttaa aaatgctcgt aagattctac atgagttaac acttgtcttt 360
gaacacaggg agaatcgatt tatacctagt ttagctaaag gaattgaatg gacagatttt 420
actttcagta ataagagtaa tatactcgaa gatttaaaga ggcgaccaac ctttgtattc 480
cgtaggttgc ttaattttct aacagattat tatcaaataa ttttctcggc tatatgggaa 540
gatttaaaga gtgaattatt aaatgaaatt gtagaacaaa ctaccttact caaaacaaaa 600
gggttttcag catttattgc ttccttatcc tcagagcgca tttcttggat tgataataaa 660
aataaattgt atcttcacaa accatttaaa acaatttatc agatgaaaag tgatgaatct 720
attattttta tgcctagtta ttttgtttgg cctcattttt ttgtagacga aataaaagag 780
ggggttgtta ttgtttatga ttcttcagta gcaagagaac aggcattccc agagcaacct 840
attgaaaaaa tggtagatat ttatcgagct ttaggggagc cttctaggtt gcaaattttg 900
aggatattac aggaacgttc attaacaacg caatctttgg cacaaatttg ccatttgagc 960
gaggggggcc gtttctag 978
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tccaagttgt accagagatt gatgct 26
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gcgaatagtg cggagtatgg attctata 28
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggctaggcag taccgaggaa gaa 23
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tagcgtatcc tggttgaact ggtaattg 28
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ccacgctact tcctggaatc tacaa 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ggaatgcctg ttctcttgct actga 25

Claims (5)

1.用于检测蜡样芽孢杆菌的PCR引物，其特征在于，所述引物分别为引物对gFA 1、gFA2、gFA 3；具体引物序列如下：
gFA1-f：5’-TCCAAGTTGTACCAGAGATTGATGCT-3’；SEQ ID NO.4；
gFA1-r：5’-GCGAATAGTGCGGAGTATGGATTCTATA-3’；SEQ ID NO.5；
gFA 2-f：5’-GGCTAGGCAGTACCGAGGAAGAA-3’；SEQ ID NO.6；
gFA 2-r：5’-TAGCGTATCCTGGTTGAACTGGTAATTG-3’；SEQ ID NO.7；
gFA 3-f：5’-CCACGCTACTTCCTGGAATCTACAA-3’；SEQ ID NO.8；
gFA 3-r：5’-GGAATGCCTGTTCTCTTGCTACTGA-3’；SEQ ID NO.9。
2.一种利用权利要求1所述引物检测蜡样芽孢杆菌的方法，不以疾病的诊断为目的，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取样品DNA，进行PCR扩增；
（2）凝胶电泳检测PCR扩增产物；
（3）观察电泳后条带，若在269 bp或750 bp或591 bp位置处有条带产生，表明样品中有蜡样芽孢杆菌；
步骤（1）所述PCR扩增的反应体系为：10×PCR buffer 3 μL、2.5 mM dNTP 2 μL、25mMMgCl2 2 μL、0.6 U Taq聚合酶2 μL、0.8 μM引物gFA 1或gFA 2或gFA 3 2 μL、DNA模板2 μL、ddH2O 12 μL，总反应体系25 μL；
步骤（1）所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸10 min。
3.一种检测蜡样芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对gFA 1、gFA 2、gFA 3。
4.根据权利要求3所述的一种检测蜡样芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括MgCl2、10×PCR buffer、dNTP、Taq-DNA聚合酶。
5.权利要求1所述的PCR引物在制备检测蜡样芽孢杆菌试剂中的应用。
CN201910750182.7A 2019-08-14 2019-08-14 用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列、引物及方法和试剂盒 Active CN110358851B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910750182.7A CN110358851B (zh) 2019-08-14 2019-08-14 用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列、引物及方法和试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910750182.7A CN110358851B (zh) 2019-08-14 2019-08-14 用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列、引物及方法和试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110358851A CN110358851A (zh) 2019-10-22
CN110358851B true CN110358851B (zh) 2023-01-17

Family

ID=68223747

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910750182.7A Active CN110358851B (zh) 2019-08-14 2019-08-14 用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列、引物及方法和试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110358851B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434899A (zh) * 2015-09-02 2017-02-22 上海产业技术研究院 快速恒温检测蜡样芽孢杆菌的方法、引物及试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL219153B1 (pl) * 2012-07-10 2015-03-31 Univ Warszawski Nowe szczepy bakteryjne, plazmid pSinA, sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do chemolitotroficznego utleniania arseninów i szczepy wytworzone tym sposobem oraz ich zastosowania

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434899A (zh) * 2015-09-02 2017-02-22 上海产业技术研究院 快速恒温检测蜡样芽孢杆菌的方法、引物及试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Detection of Enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Strains by PCR Analysis;BJARNE MUNK HANSEN et al.;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;20010131;第67卷(第1期);第185-189页 *
蜡样芽孢杆菌特异性基因筛选及聚合酶链式反应检测方法的建立;赵岩岩等;《食品与发酵工业》;20201231;第46卷(第10期);第271-277页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110358851A (zh) 2019-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Domann et al. Culture-independent identification of pathogenic bacteria and polymicrobial infections in the genitourinary tract of renal transplant recipients
Le Bourhis et al. Development and validation of PCR primers to assess the diversity of Clostridium spp. in cheese by temporal temperature gradient gel electrophoresis
Pal et al. Rapid detection and differentiation of Erysipelothrix spp. by a novel multiplex real‐time PCR assay
Capurro et al. Comparison of a commercialized phenotyping system, antimicrobial susceptibility testing, and tuf gene sequence-based genotyping for species-level identification of coagulase-negative staphylococci isolated from cases of bovine mastitis
CN106868167A (zh) 用于现场快速检测牛支原体的引物、探针及试剂盒
CN109735638B (zh) 鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌st121的多重pcr检测引物、试剂盒、方法及应用
CN105936935B (zh) 一种快速鉴定特定血清型沙门菌的pcr检测试剂盒
Moustafa et al. Molecular typing of haemorrhagic septicaemia-associated Pasteurella multocida isolates from Pakistan and Thailand using multilocus sequence typing and pulsed-field gel electrophoresis
CN104212901A (zh) 用于金黄色葡萄球菌耐药性检测的组合物
CN104232783B (zh) 牛种布氏菌弱毒疫苗株a19的快速检测方法
CN109337995B (zh) 土拉杆菌及其亚种的pcr检测方法和试剂盒
Rusak et al. Rapid detection of Yersinia enterocolitica serotype O: 3 using a duplex PCR assay
CN111118182B (zh) 血清型单核增生李斯特菌特异性新分子靶标及其快速检测方法
CN110951898B (zh) 克罗诺杆菌属内4个种的特异性新分子靶标及其快速检测方法
CN109811073B (zh) 双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用
CN110724752B (zh) 多重pcr检测人鱼共患病病原菌的方法
CN104946769B (zh) 肺炎支原体快速检测和基因分型的试剂盒
CN109735645B (zh) 一种检测球形孢子丝菌的实时荧光pcr引物、探针及试剂盒
CN110358851B (zh) 用于检测蜡样芽孢杆菌的核酸序列、引物及方法和试剂盒
JP3525259B2 (ja) ペクチネータス属菌の検出
Benahmed et al. Detection of Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Cubana from naturally contaminated chick feed
Zhang et al. Mining Listeria monocytogenes single nucleotide polymorphism sites to identify the major serotypes using allele-specific multiplex PCR
CN104846067A (zh) 单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重pcr检测试剂盒及检测方法
KR101299627B1 (ko) 식중독 세균 동시 검출용 프라이머 및 이의 용도
CN110408712B (zh) 细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒及引物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant