CN111118182B - 血清型单核增生李斯特菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 - Google Patents

Abstract

发明提供了一组用于鉴别常见血清型单核增生李斯特菌特异性新分子检测靶标，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～13所示。所述靶标能鉴别不同型别的单核增生李斯特菌，例如谱系型Ⅰ、谱系型Ⅱ、谱系型Ⅲ、血清组Ⅰ.1、血清组Ⅰ.2、血清组Ⅱ.1、血清组Ⅱ.2、血清型4a、血清型4c。本发明还提供常见血清型单核增生李斯特菌的检测方法，该方法针对所述13个特异靶标分子设计特异性引物，对PCR扩增产物进行电泳，通过电泳结果直接判定检测样本中是否含有常见的血清型单核增生李斯特菌。

Description

血清型单核增生李斯特菌特异性新分子靶标及其快速检测 方法

技术领域

本发明属于微生物检验技术领域，涉及鉴别常见血清型单核增生李斯特菌新特异性分子靶标。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种重要的食源性致病菌，WHO将其列为四大食源性病原菌之一，该菌可引起严重的李斯特菌病，如脑膜炎、败血症、心内膜炎、脓肿和局部的脓性损伤等，敏感人群主要有孕妇、婴儿、老人和免疫力低下的人群，致死率为20％-30％。据美国CDC数据显示，每年因李斯特菌引起的疾病约有1600例，死亡约260例(https://www.cdc.gov/listeria/)。我国部分城市有报道偶发李斯特菌病病例，主要人群为孕妇、新生儿等，对我国居民的身心健康造成一定的威胁。作为重要的食源性致病菌，如何鉴定和防控单核细胞增生李斯特菌污染食品是降低单核细胞增生李斯特菌感染的关键之一。

单核细胞增生李斯特菌遗传多样性丰富，具有13种血清型，分别为1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4c、4ab、4d、4e和7型。根据分子特征和进化关系，又可将单核细胞增生李斯特菌分为四个进化家族，谱系型Ⅰ包括1/2a、1/2c、3a、3c，主要分布于食品和自然环境中；谱系型Ⅱ包括1/2b、3b、4b、4d、4e、4ab和7型，可引起人类李斯特菌病的散发和暴发；谱系型Ⅲ和Ⅳ包括4a、4c和部分4b非典型菌株，主要来自动物李斯特菌病和动物食品。单核细胞增生李斯特菌菌株致病力强弱与血清型直接相关，其中1/2a、1/2b和4b血清型是引起人类李斯特菌病的主要血清型。血清玻片凝集法是单核增生李斯特菌血清分型的“金标准”，但存在不足之处，如诊断血清质量要求高，成本昂贵，且如果血清凝集反应迟缓或特异性差，将造成错误的判断结果。以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代传统血清分型方法最具潜力的检测技术之一。

目前国内外PCR检测方法大部分是对单核增生李斯特菌进行检测，针对血清型的PCR检测靶标及引物的研究报道仅有单核增生李斯特菌谱系型Ⅰ特异性基因lmo0737；单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ特异性基因ORF2819；单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.2特异性基因lmo1118；单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2特异性基因ORF2110；单核增生李斯特菌血清型1/2a特异性基因LMOSLCC5850_0077、LMOSLCC5850_0078、hsdS。而针对其他谱系型、血清组和血清型的PCR检测靶标及引物的研究报道几乎没有，因此，也没有有关其他谱系型、血清组和血清型检测的PCR方法建立的报道。

经对现有技术的检索，尚未发现与本发明的13个单核增生李斯特菌常见血清型特异性新分子靶标及相应的PCR检测方法报道。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供用于鉴别常见血清型单核增生李斯特菌，即单核增生李斯特菌谱系型Ⅰ(1/2a-3a-1/2c-3c)、谱系型Ⅱ(1/2b-3b-7-4b-4d-4e-4ab)、谱系型Ⅲ(4a-4c)、血清组I.1(1/2a-3a)、血清组Ⅰ.2(1/2c-3c)、血清组Ⅱ.1(4b-4d-4e-4ab)、血清组Ⅱ.2(1/2b-3b-7)、血清型4a、血清型4c的特异性新分子靶标及相应的PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案来实现：

一组用于检测血清型单核增生李斯特菌的分子靶标，所述分子靶标包括如SEQ IDNO.1～13所示的核苷酸序列。

本发明涉及用于常见血清型单核增生李斯特菌的13个特异性新分子靶标，该靶标的碱基序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.13所示。主要根据单核增生李斯特菌的泛基因组分析结果获得目标血清型单核增生李斯特菌菌株特有的非必需基因。泛基因组采用原核生物泛基因组自动化分析软件(Pan-Genomics Analysis Pipeline，PGAP)中的MP方法来分析，通过本地Perl脚本对分析结果进行处理，得到所有菌株的核心基因及非核心基因信息。提取目标血清型单核增生李斯特菌菌株特有的非核心基因蛋白序列，通过本地Blast分别将其比对回单核增生李斯特菌的蛋白总库及NCBI非冗余蛋白数据库(NR)。去除能比对到已知的目标血清型单核增生李斯特菌蛋白的序列，剩下的则为目标血清型单核增生李斯特菌菌株新获得的特有基因。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌谱系型Ⅰ菌株。其中，所述单核增生李斯特菌谱系型Ⅰ菌株包括1/2a、3a、1/2c或3c型的单核增生李斯特菌株。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ菌株。其中，所述单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ菌株包括1/2b、3b、7、4b、4d、4e或4ab型的单核增生李斯特菌株。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3～5所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ菌株。其中，所述单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ菌株包括4a或4c型的单核增生李斯特菌株。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.6～7所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.1菌株。其中，所述核增生李斯特菌血清组Ⅰ.1菌株包括1/2a和3a型的单核增生李斯特菌株。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.2菌株；其中，所述核增生李斯特菌血清组Ⅰ.2菌株包括1/2c和3c型的单核增生李斯特菌株。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1菌株；其中，所述核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1菌株包括4b、4d、4e和4ab型的单核增生李斯特菌株。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2菌株；其中，所述核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2菌株包括1/2b、3b和7型的单核增生李斯特菌株。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌血清组4a菌株。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.12～13所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌血清组4c菌株。

本发明还提供了一组用于检测如上所述的分子靶标的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14～39所示。

本发明针对上述特异性分子靶标设计了特异性检测引物，可通过PCR扩增技术快速实现单核增生李斯特菌株各个型别的检测。其中，针对靶标分子SEQ ID NO.1设计的引物如SEQ ID NO.14～15所示；针对靶标分子SEQ ID NO.2设计的引物如SEQ ID NO.16～17所示；针对靶标分子SEQ ID NO.3设计的引物如SEQ ID NO.18～19所示；针对靶标分子SEQ IDNO.4设计的引物如SEQ ID NO.20～21所示；针对靶标分子SEQ ID NO.5设计的引物如SEQID NO.22～23所示；针对靶标分子SEQ ID NO.6设计的引物如SEQ ID NO.24～25所示；针对靶标分子SEQ ID NO.7设计的引物如SEQ ID NO.26～27所示；针对靶标分子SEQ ID NO.8设计的引物如SEQ ID NO.28～29所示；针对靶标分子SEQ ID NO.9设计的引物如SEQ IDNO.30～31所示；针对靶标分子SEQ ID NO.10设计的引物如SEQ ID NO.32～33所示；针对靶标分子SEQ ID NO.11设计的引物如SEQ ID NO.34～35所示；针对靶标分子SEQ ID NO.12设计的引物如SEQ ID NO.36～37所示；针对靶标分子SEQ ID NO.13设计的引物如SEQ IDNO.38～39所示。

本发明还提供了一种检测血清型单核增生李斯特菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如上所述的引物组。

本发明还提供了一种检测血清型单核增生李斯特菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)使用如权利要求6所述的特异性引物对检测样本进行PCR扩增；本发明所述的特异性引物对其进行PCR扩增；根据目标血清型单核增生李斯特菌全基因组DNA序列中的13个保守序列SEQ ID NO.1～13设计特异性扩增引物；

(2)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果出现大小约229bp、237bp、230bp、307bp、291bp、285bp、265bp、192bp、188bp、213bp、361pb、524bp、或/和274bp的条带则判定样品中含有血清型单核增生李斯特菌，若电泳结果未出现目标大小的条带则判定样品中不含有血清型单核增生李斯特菌。

优选地，所述步骤(2)中电泳结果出现大小约229bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌谱系型Ⅰ菌株；电泳结果出现大小约237bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ菌株；电泳结果出现大小约230bp、307bp和291bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ菌株；电泳结果出现大小约285bp和265bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.1菌株；电泳结果出现大小约192bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.2菌株；电泳结果出现大小约188bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1菌株；电泳结果出现大小约213bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2菌株；电泳结果出现大小约361bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌血清组4a菌株；电泳结果出现大小约524bp和274bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌血清组4c菌株。

优选地，所述PCR的反应体系为25μL，包括10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl₂ 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP 1.0μL、5μM引物对1.0μL、Taq酶1U、DNA模板2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；所述PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

本发明的有益效果：本发明公开了用于鉴别常见血清型单核增生李斯特菌的特异性分子靶标及相关PCR检测方法，与现有技术相比，本发明的检测方法具有检测时间短，无需单核增生李斯特菌诊断血清即可检测目标血清型，降低了检测成本；同时本发明的检测方法可用于检测某些抗原不表达的菌株，弥补免疫检测的缺陷，更加具有实用性；本发明的特异性分子靶标即13个保守核酸具有单一的特异性，检测结果特异，结果判定简单。

附图说明

图1为实施例2中单核增生李斯特菌谱系型I PCR检测方法特异性评价电泳结果图(注：M为DL2000 DNA标准marker，1-82、89-90和92为单核增生李斯特菌谱系型I菌株，83-88、91以及93-94为非目标血清型单核增生李斯特菌菌株，95-115为其他李斯特菌菌株及非李斯特菌属菌株，C为阴性对照)。

图2为实施例3中单核增生李斯特菌谱系型ⅡPCR检测方法特异性评价电泳结果图(注：M为DL2000 DNA标准marker，1-74、76-80、83以及85为单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ菌株，75、81-82、84以及86为非目标血清型单核增生李斯特菌菌株，87-107为其他李斯特菌菌株及非李斯特菌属菌株，C为阴性对照)。

图3为图3实施例4中单核增生李斯特菌谱系型ⅢPCR检测方法特异性评价电泳结果图(注：a-c对应SEQ ID NO.3-NO.5序列；M为DL2000 DNA标准marker，1-23和34为单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ菌株，24-33为非目标血清型单核增生李斯特菌菌株，35-55为其他李斯特菌菌株及非李斯特菌属菌株，C为阴性对照)。

图4为实施例5中单核增生李斯特菌血清组I.1PCR检测方法特异性评价电泳结果图(注：a-b对应SEQ ID NO.6-NO.7序列；M为DL2000 DNA标准marker，1-35和42-43为单核增生李斯特菌血清组I.1菌株，36-42和44-47为非目标血清型单核增生李斯特菌菌株，48-68为其他李斯特菌菌株及非李斯特菌属菌株，C为阴性对照)。

图5为实施例6中单核增生李斯特菌血清组I.2PCR检测方法特异性评价电泳结果图(注：M为DL2000 DNA标准marker，1-29和39为单核增生李斯特菌血清组I.2菌株，30-38和40-41为非目标血清型单核增生李斯特菌菌株，42-62为其他李斯特菌菌株及非李斯特菌属菌株，C为阴性对照)。

图6为实施例7中单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1PCR检测方法特异性评价电泳结果图(注：M为DL2000 DNA标准marker，1-27、31-33以及38为单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1菌株，28-30、34-37以及39为非目标血清型单核增生李斯特菌菌株，40-60为其他李斯特菌菌株及非李斯特菌属菌株，C为阴性对照)。

图7为实施例8中单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2PCR检测方法特异性评价电泳结果图(注：M为DL2000 DNA标准marker，1-45、47-48以及54为单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2菌株，46、49-53以及55-57为非目标血清型单核增生李斯特菌菌株，58-78为其他李斯特菌菌株及非李斯特菌属菌株，C为阴性对照)。

图8实施例9中单核增生李斯特菌血清型4a PCR检测方法特异性评价电泳结果图(注：M为DL2000 DNA标准marker，1为单核增生李斯特菌血清型4a菌株，2-12为非目标血清型单核增生李斯特菌菌株，13-33为其他李斯特菌菌株及非李斯特菌属菌株，C为阴性对照)。

图9实施例10中单核增生李斯特菌血清型4c PCR检测方法特异性评价电泳结果图(注：a-b对应SEQ ID NO.12-NO.13序列；M为DL2000 DNA标准marker，1-22和34为单核增生李斯特菌血清型4c菌株，23-33为非目标血清型单核增生李斯特菌菌株，35-55为其他李斯特菌菌株及非李斯特菌属菌株，C为阴性对照)。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1常见血清型单核增生李斯特菌特异性新分子靶标的挖掘

根据GenBank数据库及本团队自测的不同血清型单核增生李斯特菌全基因组DNA序列，通过比较基因组学分析，主要根据单核增生李斯特菌的泛基因组分析结果获得常见血清型单核增生李斯特菌菌株特有的非必需基因。采用原核生物泛基因组自动化分析软件PGAP中的MP方法来分析，通过本地Perl脚本对分析结果进行处理，得到所有菌株的核心基因及非核心基因信息，并筛选出常见血清型单核增生李斯特菌的特异性基因片段。基因序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.13所示。提取目标血清型单核增生李斯特菌菌株特有的13个特异性基因蛋白序列，通过本地Blast分别将其比对回单核增生李斯特菌的蛋白总库及NCBI非冗余蛋白数据库(NR)。去除能比对到已知的目标血清型单核增生李斯特菌蛋白的序列，剩下的则为目标血清型单核增生李斯特菌菌株新获得的特有的基因，基因序列如SEQID NO.1-SEQ ID NO.13所示。

实施例2单核增生李斯特菌谱系型I特异性新分子靶标快速检测方法的建立

本实施例提供了一种检测单核增生李斯特菌谱系型I菌株的方法：根据单核增生李斯特菌谱系型I的新特异性分子靶标设计引物，组成快速检测方法，包括以下步骤：

引物的设计：根据新特异性分子靶标碱基序列SEQ ID NO.1设计特异性扩增引物，引物序列如下表：

表1 单核增生李斯特菌谱系型I特异性PCR检测引物序列

DNA模板制备：将单核增生李斯特菌谱系型I菌株在BHI液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板。

PCR检测体系及扩增程序：

PCR检测体系为25μL，其中包括10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl₂ 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP 1.0μL、5μM引物对1.0μL、Taq酶1U、DNA模板2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；

PCR检测条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

PCR方法检测结果的判定：

凝胶电泳检测扩增产物，判定电泳结果扩增产物在229bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有单核增生李斯特菌谱系型I菌株；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有单核增生李斯特菌谱系型I菌株。

PCR检测方法的特异性评价结果：

分别取51株血清型1/2a、31株血清型1/2c、3株血清型3a共85株单核增生李斯特菌谱系型I菌株，血清型1/2b、血清型4b等9株非目标血清型单核增生李斯特菌，英诺克李斯特菌、金黄色葡萄球菌等21株非单核增生李斯特菌按照上述方法进行PCR检测，结果如图1所示，该检测方法只有单核增生李斯特菌谱系型I显示出特异性扩增条带，其他血清型单核增生李斯特菌及非单核增生李斯特菌菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表2所示，表中检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表2 本发明单核增生李斯特菌谱系型I特异性评价试验结果

实施例3单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ特异性新分子靶标快速检测方法的建立

本实施例提供了一种检测单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ菌株的方法：根据单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ的新特异性分子靶标设计引物，组成快速检测方法，包括以下步骤：

引物的设计：根据新特异性分子靶标碱基序列SEQ ID NO.2设计特异性扩增引物，引物序列如下表：

表3 单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ特异性PCR检测引物序列

DNA模板制备：将单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ菌株在BHI液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板。

PCR检测体系及扩增程序：

PCR检测体系为25μL，其中包括10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl₂ 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP 1.0μL、5μM引物对1.0μL、Taq酶1U、DNA模板2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；

PCR检测条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

PCR方法检测结果的判定

凝胶电泳检测扩增产物，如电泳结果扩增产物分别在237bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ菌株；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ菌株。

PCR检测方法的特异性评价结果

分别取48株血清型1/2b、1株血清型3b、28株血清型4b、1株血清型4d、1株血清型4e、1株血清型4ab、1株血清型7共81株单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ菌株，血清型1/2a、血清型1/2c等5株非目标血清型单核增生李斯特菌，英诺克李斯特菌、金黄色葡萄球菌等21株非单核增生李斯特菌按照上述方法进行PCR检测，结果如图2所示，该检测方法均只有单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ菌株显示出特异性扩增条带，其他血清型单核增生李斯特菌及非单核增生李斯特菌菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表4 本发明单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ特异性评价试验结果

实施例4单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ特异性新分子靶标快速检测方法的建立

本实施例提供了一种检测单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ菌株的方法：根据单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ的以下任一个新特异性分子靶标设计引物，均能组成快速检测方法，且包括以下步骤：

引物的设计：根据新特异性分子靶标碱基序列SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5设计特异性扩增引物，引物序列如下表：

表5 单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ特异性PCR检测引物序列

DNA模板制备：将单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ菌株在BHI液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板。

PCR检测体系及扩增程序：

PCR检测体系为25μL，其中包括10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl₂ 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP 1.0μL、5μM引物对1.0μL、Taq酶1U、DNA模板2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；

PCR检测条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

PCR方法检测结果的判定

凝胶电泳检测扩增产物，如电泳结果扩增产物分别在230、307、291bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ菌株；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ菌株。

PCR检测方法的特异性评价结果

分别取1株血清型4a、23株血清型4c共24株单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ菌株，血清型1/2a、血清型1/2b等10株非目标血清型单核增生李斯特菌，英诺克李斯特菌、金黄色葡萄球菌等21株非单核增生李斯特菌按照上述方法进行PCR检测，结果如图3所示，该检测方法均只有单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ显示出特异性扩增条带，其他血清型单核增生李斯特菌及非单核增生李斯特菌菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表6 本发明单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ特异性评价试验结果

实施例5单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.1特异性新分子靶标快速检测方法的建立

本实施例提供了一种检测单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.1菌株的方法：根据单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.1的以下任一个新特异性分子靶标设计引物，均能组成快速检测方法，且包括以下步骤：

引物的设计：根据新特异性分子靶标碱基序列SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.7设计特异性扩增引物，引物序列如下表：

表7 单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.1特异性PCR检测引物序列

DNA模板制备：将单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.1菌株在BHI液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板。

PCR检测体系及扩增程序：

PCR检测体系为25μL，其中包括10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl₂ 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP 1.0μL、5μM引物对1.0μL、Taq酶1U、DNA模板2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；

PCR检测条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

PCR方法检测结果的判定

凝胶电泳检测扩增产物，如电泳结果扩增产物分别在285、265bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.1菌株；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.1菌株。

PCR检测方法的特异性评价结果

分别取34株血清型2a、3株血清型3a共37株单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.1菌株，血清型1/2b、血清型1/2c等10株非目标血清型单核增生李斯特菌，英诺克李斯特菌、金黄色葡萄球菌等21株非单核增生李斯特菌按照上述方法进行PCR检测，结果如图4所示，该检测方法均只有单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.1菌株显示出特异性扩增条带，其他血清型单核增生李斯特菌及非单核增生李斯特菌菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表8 本发明单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.1特异性评价试验结果

实施例6单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.2特异性新分子靶标快速检测方法的建立

本实施例提供了一种检测单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.2菌株的方法：根据单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.2的新特异性分子靶标设计引物，组成快速检测方法，包括以下步骤：

引物的设计：根据新特异性分子靶标碱基序列SEQ ID NO.8设计特异性扩增引物，引物序列如下表：

表9 单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.2特异性PCR检测引物序列

DNA模板制备：将单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.2菌株在BHI液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板。

PCR检测体系及扩增程序：

PCR检测体系为25μL，其中包括10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl₂ 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP 1.0μL、5μM引物对1.0μL、Taq酶1U、DNA模板2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；

PCR检测条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

PCR方法检测结果的判定

凝胶电泳检测扩增产物，如电泳结果扩增产物分别在192bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.2菌株；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.2菌株。

PCR检测方法的特异性评价结果

取30株血清型1/2c单核增生李斯特菌菌株，血清型1/2a、血清型1/2b等11株非目标血清型单核增生李斯特菌，英诺克李斯特菌、金黄色葡萄球菌等21株非单核增生李斯特菌按照上述方法进行PCR检测，结果如图5所示，该检测方法均只有单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.2菌株显示出特异性扩增条带，其他血清型单核增生李斯特菌及非单核增生李斯特菌菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表10本发明单核增生李斯特菌血清组Ⅰ.2特异性评价试验结果

实施例7单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1特异性新分子靶标快速检测方法的建立

本实施例提供了一种检测单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1菌株的方法：根据单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1的新特异性分子靶标设计引物，组成快速检测方法，包括以下步骤：

引物的设计：根据新特异性分子靶标碱基序列SEQ ID NO.9设计特异性扩增引物，引物序列如下表：

表11 单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1特异性PCR检测引物序列

DNA模板制备

将单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1菌株在BHI液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板。

PCR检测体系及扩增程序

PCR检测体系为25μL，其中包括10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl₂ 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP 1.0μL、5μM引物对1.0μL、Taq酶1U、DNA模板2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；

PCR检测条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

PCR方法检测结果的判定

凝胶电泳检测扩增产物，如电泳结果扩增产物分别在188bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1菌株；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1菌株。

PCR检测方法的特异性评价结果

分别取28株血清型4b、1株血清型4d、1株血清型4e、1株血清型4ab共31株单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1菌株，血清型1/2a、血清型1/2b等8株非目标血清型单核增生李斯特菌，英诺克李斯特菌、金黄色葡萄球菌等21株非单核增生李斯特菌按照上述方法进行PCR检测，结果如图7所示，该检测方法均只有单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1菌株显示出特异性扩增条带，其他血清型单核增生李斯特菌及非单核增生李斯特菌菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表12 本发明单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1特异性评价试验结果

实施例8单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2特异性新分子靶标快速检测方法的建立

本实施例提供了一种检测单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2菌株的方法：根据单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2的新特异性分子靶标设计引物，组成快速检测方法，包括以下步骤：

引物的设计：根据新特异性分子靶标碱基序列SEQ ID NO.10设计特异性扩增引物，引物序列如下表：

表13 单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2特异性PCR检测引物序列

DNA模板制备

将单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2菌株在BHI液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板。

PCR检测体系及扩增程序

PCR检测体系为25μL，其中包括10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl₂ 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP 1.0μL、5μM引物对1.0μL、Taq酶1U、DNA模板2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；

PCR检测条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

PCR方法检测结果的判定

凝胶电泳检测扩增产物，如电泳结果扩增产物分别在213bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2菌株；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2菌株。

PCR检测方法的特异性评价结果

分别取46株血清型1/2b、1株血清型3b、1株血清型7共48株单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2菌株，血清型1/2a、血清型1/2c等9株非目标血清型单核增生李斯特菌，英诺克李斯特菌、金黄色葡萄球菌等21株非单核增生李斯特菌按照上述方法进行PCR检测，结果如图6所示，该检测方法均只有单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2菌株显示出特异性扩增条带，其他血清型单核增生李斯特菌及非单核增生李斯特菌菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表14 本发明单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2特异性评价试验结果

实施例9单核增生李斯特菌血清型4a特异性新分子靶标快速检测方法的建立

本实施例提供了一种检测单核增生李斯特菌血清型4a菌株的方法：根据单核增生李斯特菌血清型4a的新特异性分子靶标设计引物，组成快速检测方法，包括以下步骤：

引物的设计：根据新特异性分子靶标碱基序列SEQ ID NO.11设计特异性扩增引物，引物序列如下表：

表15 单核增生李斯特菌血清型4a特异性PCR检测引物序列

DNA模板制备

将单核增生李斯特菌血清型4a菌株在BHI液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板。

PCR检测体系及扩增程序

PCR检测体系为25μL，其中包括10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl₂ 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP 1.0μL、5μM引物对1.0μL、Taq酶1U、DNA模板2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；

PCR检测条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

PCR方法检测结果的判定

凝胶电泳检测扩增产物，如电泳结果扩增产物在361bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有单核增生李斯特菌血清型4a菌株；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有单核增生李斯特菌血清型4a菌株。

PCR检测方法的特异性评价结果

取1株血清型4a，血清型1/2a、血清型1/2b等11株非目标血清型单核增生李斯特菌，英诺克李斯特菌、金黄色葡萄球菌等21株非单核增生李斯特菌按照上述方法进行PCR检测，结果如图8所示，该检测方法均只有单核增生李斯特菌血清型4a菌株显示出特异性扩增条带，其他血清型单核增生李斯特菌及非单核增生李斯特菌菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表16 本发明单核增生李斯特菌血清型4a特异性评价试验结果

实施例10单核增生李斯特菌血清型4c特异性新分子靶标快速检测方法的建立

本实施例提供了一种检测单核增生李斯特菌血清型4c菌株的方法：根据单核增生李斯特菌血清型4c的任一个新特异性分子靶标设计引物，均能组成快速检测方法，且包括以下步骤：

引物的设计：根据新特异性分子靶标碱基序列SEQ ID NO.12-SEQ ID NO.13设计特异性扩增引物，引物序列如下表：

表17 单核增生李斯特菌血清型4c特异性PCR检测引物序列

DNA模板制备：将单核增生李斯特菌血清型4c菌株在BHI液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板。

PCR检测体系及扩增程序

PCR检测体系为25μL，其中包括10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl₂ 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP 1.0μL、5μM引物对1.0μL、Taq酶1U、DNA模板2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；

PCR检测条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

PCR方法检测结果的判定

凝胶电泳检测扩增产物，如电泳结果扩增产物分别在524、274bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有单核增生李斯特菌血清型4c菌株；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有单核增生李斯特菌血清型4c菌株。

PCR检测方法的特异性评价结果

取23株血清型4c，血清型1/2a、血清型1/2b等11株非目标血清型单核增生李斯特菌，英诺克李斯特菌、金黄色葡萄球菌等21株非单核增生李斯特菌按照上述方法进行PCR检测，结果如图9所示，该检测方法均只有单核增生李斯特菌血清型4c菌株显示出特异性扩增条带，其他血清型单核增生李斯特菌及非单核增生李斯特菌菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表18本发明单核增生李斯特菌血清型4c特异性评价试验结果

菌株名称	菌株编号	血清型	菌株数量	检测结果
					L.monocytogenes	食品源分离株	4c	23	+
L.monocytogenes	食品源分离株	1/2a	1	-
					L.monocytogenes	食品源分离株	1/2b	1	-
L.monocytogenes	食品源分离株	1/2c	1	-
					L.monocytogenes	51782	3a	1	-
L.monocytogenes	RM3113	3b	1	-
					L.monocytogenes	ATCC19115	4b	1	-
L.monocytogenes	ATCC19114	4a	1	-
					L.monocytogenes	ATCC19117	4d	1	-
L.monocytogenes	ATCC19118	4e	1	-
					L.monocytogenes	Murray B	4ab	1	-
L.monocytogenes	SLCC2428	7	1	-
					L.innocua	ATCC33090		1	-
L.ivanovii	ATCC19119		1	-
					L.grayi	ATCC19120		1	-
L.seeligeri	CICC21671		1	-
					L.welshimeri	ATCC35897		1	-
C.sakazakii	ATCC29544		1	-
					C.sakazakii	食品源分离株		1	-
S.aureus	ATCC25923		1	-
					S.aureus	ATCC29213		1	-
P.aeruginosa	ATCC9027		1	-
					P.aeruginosa	ATCC27853		1	-
S.Enteritidis	CMCC50335		1	-
					S.Typhimurium	ATCC14028		1	-
C.jejuni	ATCC33291		1	-
					E.coli	ATCC25922		1	-
S.sonnei	CMCC(B)51592		1	-
					V.parahemolyticus	ATCC33847		1	-
V.parahemolyticus	ATCC17802		1	-
					Y.enterocolitica	食品源分离株		2	-
B.cereus	ATCC14579		1	-

实施例11单核增生李斯特菌疑似菌株的检测

利用实施例2-10中的常见血清型单核增生李斯特菌PCR检测方法对162株从食品样品中分离的单核增生李斯特菌疑似菌株进行检测，食品样品采集于广东省的超市及集贸市场，样品处理及疑似菌株的分离参见国标法。利用本发明方法，目标血清型单核增生李斯特菌检出菌株数分别如下：单核增生李斯特菌谱系型I共72株、单核增生李斯特菌谱系型Ⅱ共72株、单核增生李斯特菌谱系型Ⅲ共19株、单核增生李斯特菌血清组I.1共45株、单核增生李斯特菌血清组I.2共27株、单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.1共28株、单核增生李斯特菌血清组Ⅱ.2共44株、单核增生李斯特菌血清型4c共19株、单核增生李斯特菌血清型4a未检出，经单核增生李斯特菌诊断血清鉴定是目标血清型单核增生李斯特菌(表19)。通过本实施例说明本发明的常见血清型单核增生李斯特菌的13种PCR检测方法可靠性高。

表19 本发明的检测方法与血清凝集法检测结果对比

血清型	本发明检测法	血清凝集法
			谱系型I(1/2a-3a-1/2c-3c)	72	1/2a(45)、1/2c(27)
谱系型Ⅱ(1/2b-3b-7-4b-4d-4e-4ab)	72	1/2b(44)、4b(28)
			谱系型Ⅲ(4a-4c)	19	4c(19)
血清组I.1(1/2a-3a)	45	1/2a(45)
			血清组I.2(1/2c-3c)	27	1/2c(27)
血清组Ⅱ.1(4b-4d-4e-4ab)	28	4b(28)
			血清组Ⅱ.2(1/2b-3b-7)	44	1/2b(44)
4a	0	0
			4c	19	4c(19)

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110>

广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心），广东环凯生物科技有

限公司，广东环凯生物技术有限公司

<120> 血清型单核增生李斯特菌特异性新分子靶标及其快速检测方法

<130> 12.25

<160> 39

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1374

<212> DNA

<213> 合成

<400> 1

atgtttaatt tgcaaaaagg ttttccagaa aattttaaat ggggtagctc cactaatgcg 60

caacaatttg aaggtggcta taaagaaggt ggaaaagggc tttcgattgc ggatgtgagg 120

gttattccag atatgccaga cgaatctgat tttgaatcgt tcaaaacggc ttcagaccat 180

tatcatcatt ataaagagga tattgcttat tacggggaaa tgggcttcca aatttatcgt 240

tttacaatgg cttggtcgag aattttcccg aacggagacg aaacagaacc aaacgatgct 300

ggagttgagt tttatagtaa tatgttggca gagttagaaa aatataatat cgaaccagtt 360

gttactttat atgcttatga tatgccgtta caactgcttg aaaaatataa tggttggcta 420

gatagagcaa ttatcaaaga ttacctacat tatgtagaaa cggtcgtgaa attatttaaa 480

ggtcgagtga aatattgggt tcctttcaac gagcaaaact ttatttcgat tgattctgaa 540

tacatgagtg gttatcgtgc taaaaataaa gcagaagttt tccaaattca acatcatttt 600

aatttgtgtt atgcagaagc aacgaagctt gtacaccaaa ttgatccaga tgcaaaagtt 660

ggtggaaata ttggtaacat ttgcccttac ccaatgactt gcaaacccga agatgtcgaa 720

gcaagtgaca aagtagcgca acagttaggt tatgcttatg gagatattta tttcagagga 780

tactatccaa aatacttcct taaagaatat gaaggcgtag attttgagca aatcatttta 840

gatgatgact taactattat caaaagttct gagccagact tcatgtcgtt aacatactat 900

atgtcgagtg cgattgaagc aaaaggtgaa gaggaagttg tggtaatgaa cgggatcaaa 960

gcgccaaacc catattgtga aacaactgaa tggggttgga caattgatcc atatggtttt 1020

aaacattatt tgcaagagtt ctatcatcgc tatcaattac caattctaat tctggagaat 1080

gggatgggtg cacgcgacga aaaaaatacc gatgatacaa ttgatgatac gtaccgaatt 1140

gattatttgg cttcacatat tgcgcgtatg caagaagctg ttgaagaggg gtgcgaaatt 1200

attggttatc ttacatggtc cgcaacagat ctttattcaa cgcgtgaagg tttcgagaaa 1260

agatatggct ttgtttatgt tgataaagat aatagctata aacgtttgaa gaagaaaagt 1320

ttctattggt ataaaaaagt aattgaaact aatggaaatg atttaaatta ttaa 1374

<210> 2

<211> 474

<212> DNA

<213> 合成

<400> 2

atgacttttt taaacacctt aaaattaaat ttggaaaatg aaaaaaagag aatgttatcc 60

gatgctttta tgaaaaaaca agaaggaatc attgtaaact atatagtgac ttgcagtaag 120

gattctgcta ttggcattag taaaaaggca attgatatat tattgataat caatgaaaat 180

acatttcctg aatggccaaa tgtagataga tggctttcta ttttgccaaa atattttacg 240

gattcttttt caaaatcaaa aatattgcat agtgaagatt ggctatttga agagtggtta 300

tactggtttg aacctgaaaa tagattttgg tttttaggag aattagatcc tgttgataat 360

gagcatttga aaataagcat agttgtacaa gaacaccctt ttccagtaga atcattagaa 420

gttctactta tgaagctagg aacaagcgaa ttacatgaaa ttggtatgga atga 474

<210> 3

<211> 378

<212> DNA

<213> 合成

<400> 3

atgaagcaat atcaaaattt aaacatatgg attgaagctg aagcatggga tgaagataat 60

tgggatatgg aagattctaa tctagatgtc atcgttactt tttcaaatcg ttctaaatgg 120

atagctacat tttttactta taaaaatatt caaagcttgc aagccaaaaa taagcaaacc 180

ggtgaatgta tgaatggaac ttattttttt gccagtgata tgattcttat tgataatacg 240

agtcgagagc gtgtctatga agtcattgct catctaatgg agcaagaaga atttgagaca 300

gcttttacaa aatacccaga tgtggataaa agcgaagatt atctttaccc aactaatttt 360

tttaaagata gttattaa 378

<210> 4

<211> 2088

<212> DNA

<213> 合成

<400> 4

gtgaaaagaa aattaagttt aattattgta gcaggaatga ttcttttcca atcatttagt 60

gcatatccat tagcaacttt tgctgcagat actaagccac ttaaagcaac tcttcaagca 120

ggtagtactt atgcaagtgc atttcctgat gctaatttag cgaaagttgt cgcacaagca 180

gcgactggct cggatgatat tacacaagta gcgacacaag atgatttgga caaagttgtg 240

acactaacag ctaattcaaa agaaatcgct aacttagcgg ggatggattt gttacgtaat 300

gtaactagca tcaatttaag cgacaacaaa attactactg ttagtttgaa aggtgatatc 360

actttaccaa acgtaactag tatcaattta agaggtaacg atttaactac aatcgatatt 420

caagatcaac ctaaattagt taaagtcttt tgcgacacgc gagatagcgc agaattaact 480

gaagttgttt taaagaatct tccagcctta aaagttgctg gcggtgtaag tgacgcttct 540

ggagatacaa ttgatttctc aaaaacacgc acattaacaa aaatgacttt agaaaattta 600

ccagcaatgg caggagctct cgctttaaat gaatgttcta tgacggaagt aacagtaaaa 660

aatcttccgc aagcaatcaa cataactatc tatgataata aagtaaaaac tttagcagga 720

ttagaagatt taccacttat tacaagaatc tatgcaagta aaaatgaaat aactgaatta 780

gatagcttaa aatcatttcc agaagtagga aatattgcaa taagtaataa ccatgttagt 840

gtattgccgg aagagttgaa aacaaaactt ccaaaattag cctatatcaa cgcatcaaat 900

caaacaatta cacttcctga acaaacagta gcgccaaatt tagttcttga taatagtatc 960

aaaaactttg ggcaagtagc gacggcgaac tctatttcag ataagggtac ttataaagac 1020

aatcaaatta cgtggactgc tgcaaattta aaagacgtaa atacagtaga ttacggattt 1080

agtgagtctg tgagtcaatc tcctattgat ggaacttttt ctggtaaagt aactgttctt 1140

ttgaaaaaag ttgatttacc agtgataaca gcaagagatg aaatatatta tgaaaaaaat 1200

gcaaatataa ctgaaaaggt atttttatca aatgttgcag caagtgcaac agaaggagcc 1260

actataacaa ccgattacaa tacagttgtt gattttacca aaggtggaac ttatgaagta 1320

acattaaatg cgaaaaacag tgcaggcttt gaagcggaac cagtgaaagt aaaggttcac 1380

attaataagg cgcttgctcc agttattaca gctaatacag aaataagcta tatggtattt 1440

gctgaagtga cggaagctga ttttctgaaa aacattcaag cttcaacaaa tgacggttct 1500

attattacaa gtgattttgg aacagttgta aaatggaatg aagctggcga ttatacagta 1560

acactgaaat ctgttaattc agatgatgta gatgcaaaac cggttcaagt aacggttcgt 1620

attaccccaa atcctacccc tattttagct aatgttgttt ttgatataga cgatgttcaa 1680

acaacagaag ctattgtggt ggaaggcttc atcactgaac cagccgcacc aacgaaagat 1740

ggttatactt tcgacggttg gtatgatgcg gaaacaggcg gaaacaaatg gaacttcgca 1800

acaaacaaaa tgccggcaac tgggatcact ttatatgcgc aatttagcaa gattgtaaat 1860

aatgacccgc aaacaggtgg cggtactact actgtaaccg aaaataataa tggcgtttta 1920

tcggatccac cagcaaatac aaataataaa gctaaagatc aaaacaagaa gagccaaaca 1980

ggcaaacacc cggcaacagg tgatagccaa aatatgcttt acttgttagc agggctatta 2040

cttgtaggtg tatccttacg tattttcaaa aaaacgtata gcaaataa 2088

<210> 5

<211> 432

<212> DNA

<213> 合成

<400> 5

atgatacgaa taaatgattt atggaataga gaagaattgc tgattaaaaa tggtattcat 60

ttttcagatg gttcgggggt ggaagtggag ataagttact atcctgttcc ggatatcaaa 120

aagggtcatt acttttcatt tttggatgtt tataaagagg atcaagaaaa catgacaaaa 180

atcgatgttt ttaaggaaat caagttatcc aatggtttct actgttgtgt tggtgagggg 240

agttatggtt cggaaggatt tgttgtttat cttgatgagc gtaaaaattt actttgggtt 300

ttatactcgg aaacttccaa tccatttgta aatattatgg aagagtgcga aggtatcgta 360

gttgcggaat caagcgctaa ttttaaaata aggttggatg taaacaagcc aactagctta 420

agtttgaaat aa 432

<210> 6

<211> 1269

<212> DNA

<213> 合成

<400> 6

gtgggaggaa atccaaatgc aagagtcttg acaacagaga ctgtaaattt ttacaacaaa 60

tatatttcac agaccatgga tgactatttc gaattctata gtaaggtatg gaaagaattg 120

aaaggaatag accaaataat agatgaaagc gatataaaag gtgtttttaa agtaggctac 180

tgtccagaag gaggaagtaa attcaacaat gtagctgatt atggaggaga attacacaat 240

agatttatta actacactgc ccgaaaagat gccctaacag acaagtttaa aacagctaaa 300

gaattttatt ttttcgcaga taaaacactt tatagcaaat ttatggaacg taaaaatgaa 360

tttataaaac ttaattcatt attaggtaaa tatggttcat ttttacaagg ggatagaata 420

aatagtgcta gttacaatag cgaaatgaaa acattacgag cagaaatgta taaaattagt 480

actgttcagg aacaggtagt aagagatata tttgatgttt acagtaattc catgttagga 540

gagggagaaa ttgcaaaaag aattaaagat aagtatggaa ataccgtatc aaaagagcag 600

ctagatatac tcattgcata tgcgcaatgg attgtattaa agcaaagaag cgacggaaca 660

tggagaagtg atgaaagttt acttgcaaaa gacgccaagg tttgtctagt ccgaggtgag 720

gatggaaatt tgaagcttat gcctcaggat gaagtaaagg ataaaggcga aattcaattt 780

acaattccag gagtaaatgt atctaaagta gttacagcag gatttgattt tggtgtagat 840

aaaaagggaa atatagtcgc accagaggac tggaaattac ctaagaaaga ggtaggattt 900

ggagcggctg ttaattttag tgcgctgggt atagaatttc caaataattt taatgaagat 960

aaagcggtgc aaaagcttaa acttaataaa gttgagacgg gaaacataga aataaacgct 1020

aacacatcaa ctcaaggtat ttcagtggga gctcatgttt ctggagtaga agcgtccgga 1080

actattcttg attggcatgg gagggatact gggtttagtg tgaaagttaa tttatcggta 1140

ttaacagcag gagcagaggc aaaaataaca atggctaatg gtatatcatt taaactcggc 1200

acaggtttga ttggagcggg tatttctgca aacacatatg atgtaattga taaaaggctt 1260

aaattttaa 1269

<210> 7

<211> 456

<212> DNA

<213> 合成

<400> 7

atgaaactaa agtggccaaa atacatgtat gaagatgcgg aaataaaagc acaattttta 60

acaaaggaaa atcaagctgt tttacaagaa tacgatcaga atgttaacgc aatccagttg 120

gaattgcaag aaaagattat gttagttaag ggaccagtct atattaaaga ggagttcata 180

gatcaaacca taattctttt aaataacagt acaactagta tagctgatgt tcaattagaa 240

atagaactaa cgcttcatac cggtgaaagt ttagaaggaa agttcttatt acaaacagaa 300

aaatatggag aaattttgcc taatgaagga attgtagaat tttgtcgttt tcctaataac 360

agcaaattag ctgaaatgac tctgaaaagt acggaatatg aagttaagtc agaactaact 420

tatactaatt tattagcgga agatggggag ggataa 456

<210> 8

<211> 324

<212> DNA

<213> 合成

<400> 8

atgtatcaaa aagcttcaga gaagatgaaa gaaacgatga aagcgaatat tgcacttgtt 60

gagagtataa ggatttctag tatttctaac aagaaattgc aatcagataa taaaagtgga 120

cacacggtgg ttacctttaa agacaataaa tgggtggcta gaatatgtgt atctggagta 180

gaacatcaac taggatcttt tgttactaaa gaagaggcca ttgatgctag gatagaaggg 240

gaaaaatatt ttcaaccttt gataaataaa tataataata gactggatgt gttttatagt 300

gaacgtagac ccttttggac gtaa 324

<210> 9

<211> 624

<212> DNA

<213> 合成

<400> 9

atggaatttc ataaatttat taaagaagat atgctgatct attcatggat tactaacaat 60

tttcatctta ataaaaagga actaaaaaga agacatcaac ttatcttaga atcaactgaa 120

attcttgtta ttgagacggg gctggttttg caagaaagaa tggctactcg gtataatgga 180

tgtttgatag ttggggagca acagattatc tacactacac aagggagcct ttttatacac 240

ggattagaaa atacaacata cagcatagtc ccagtggaaa aggtgtttgc taaattggaa 300

gaacaaggat tattatctaa cttccttttg caactagcag aggggttgga ggaagattta 360

gagtgggaag taaaattaaa ttcagccaat tcaaaagaac gtgtagatat ggttttaaaa 420

atgcttatta agaaatatca actaaattac caaactaatc caagattccc aagatggtta 480

aaaattcacg tgcttgctaa attagcaaag tgttcaattt caaccacttc aatgattatg 540

aatgagcaaa ataagaatag agtgctaaac aaaaaaacaa ctccgtggct tttgctagaa 600

aagtatcaag cgttatttaa ctga 624

<210> 10

<211> 357

<212> DNA

<213> 合成

<400> 10

atgttaaaga gaaatgtaca aaaagggatg attagtttaa ttgcaattat gatgttttta 60

tcaatgttca gttttacaaa tttaaattct attaaaactg tagaggctgc aacaactgcg 120

tacaatacaa ttgagtacaa taaatcagtt aatttagatg ctaatattgc atatccagaa 180

acaaatgcat tttggtctgc accatattat tcagaaggat caacatttat atcaagtgca 240

actgcacctt cttatgcaaa aaaagatgtt aaattaataa gagaggcaaa aactgaaaga 300

ggaatttact atcaagtaaa attgggagac aaaattattg gttggcttga taaatga 357

<210> 11

<211> 1989

<212> DNA

<213> 合成

<400> 11

atgacaacaa agatggggac atcagataca gatttaattg aactaagtgg gaaatgggtt 60

tatagacatc cactaagagg taatagttta tatgtaaatg gaactttgta tgaagtaaaa 120

gaaggcgaat acaataaatc ttccggtcta gactacatga ttgtcgagaa tacaaccaca 180

ggcgaaatta gtatggtatt cgaaggcacg caaggcaccc aagatttcct aacagacggc 240

acactccctg gctccatccc taacacgcaa ttaagagaag ctgacgcagc atacaaaaaa 300

gaaagccaaa aatataacat taaaaatgtc gcaggaaact ctctaggcgg tggtttatct 360

aattatgtag catctaaaaa tgatggcata agaagcgtca cttataatcc agctatccta 420

cccaatggaa tatatgataa ggataatcca agaattacta actatttaag tgaatatgat 480

ccactaacct taggggaacg tggggcagga tatggagatc gtctaccagg tgaatcccat 540

attcttcaaa acaatgtccc ttggctgcaa accattcttt ctaatcatac gggttatgat 600

gatgcaggtg tcacggttaa cggtaaaaat attcccattg atgcagatgc ttatcttcct 660

gtaggtattt ggagtggaaa gattttgacg ggtggaagaa aagggcaaaa aatcgatatg 720

aatccggaca atattcgaat tttagccaat agtttacgga cgcgaatgac agagcaaata 780

agtagggggc agttttattt agacacagct gtagacttag tgaataacga gggaagtcat 840

ttggatgata gaacggtttc tttacagaaa tcatttgaaa acttgttggg ggaaggagaa 900

tttggcggaa ttattacttc attagctaat tatgctgagt ttcgagatgg aatggaagaa 960

gctaatccag tatgttttgc ggcattagat gtgatgcaga gagtgaggac tttaccaata 1020

ttaggagagt tgctagatgt ggtttcaggt actttcttaa gtgttggagg ttttttgagc 1080

gatattccgg ttcttgttgg agatcttgct ttaaagatag aagatacaat ggatcaagta 1140

tcgaaagtca aaatgcaggc tgtaccggaa ctgtttaaag gaatcgataa ccagtacttg 1200

agcgatgcaa tggtggcaga actaaaagag cattataaaa tattggatga taataaagat 1260

ttggtcgtta agcaagtatt aacttttagc tcccaagtca cgtatgtatc gaatgaactt 1320

gaaaaagcag ataaactttt aagtgccacg caaaaagtcc aaagtgttgg agcgccgcca 1380

gcaacacaag catatgtctt aaaagaatca aaagctttga aagacgggat ggggaagaaa 1440

cagcgcttat tagatagaaa ctataaagca ttcactaata aaacaactag cttattaata 1500

ccagcattaa gtggcgttta tagcattgtc aatcaattaa aacaagcaat tagatcagct 1560

atacagcact tgaaaaatct tcaatcgggc ttttcgatgg tgaaaattcc ctttacagat 1620

gcagacaatc aagtaagaga gcaaataagc gaatatatta gaaaactcca agaaatccta 1680

ttgacagtaa aaggtgtagg aagcgcagta aaagatttgc aatcaaattt accaaatgtg 1740

ttagctgcct accgtcctta tattgacacg gcattatttg atggcacaaa attccgggat 1800

gttattttgt taaataaagc agcagcaaat atcttccgca gtgcggaaat gatttttggg 1860

gatattaagc atcaattaag tggaaacgat tcagcagcta tttctgcatt agataagtta 1920

gctgtaaaaa ctagtaaaaa tatgaaaatt ttattagaac aaataaagcg tgggagtatt 1980

aatgtttag 1989

<210> 12

<211> 1212

<212> DNA

<213> 合成

<400> 12

atgacttgta tgccattaag tggtccaagt tttgctccaa tagaaactag catgaataca 60

attaggcttc aattaagtac agttgaaggc aatatgaata actacgataa tggtaatatc 120

aatcttttta ataattacca tcaactagta tcagctgtta gaaaagcaat tgcatcggct 180

aaaaagagtt atagaggagc aaatggagaa ctaaattatc aacctggtgc atttggaaat 240

agcccagaag gacaagagtt aacaaatgct aattatcaat tagaagtagc taaattagct 300

acattatacg aggtggaaga tggtaattta gataatatgg tagattatgc aaatgatctg 360

cttcaagatc cgaatagatt agaacaggaa ttagcttatt taaaatactt gatagaaaat 420

aatgcttttc atgataaaca agaagagaga agtcaattaa cagcatttta ttatttattg 480

attcgtttga gggatggtca aaaattagca ataggcgcag ctgcaccagg taaaagcgat 540

ttccgagtga aatatataga attagtcgcg aatagtaaat ctggagtaga attaaacgta 600

acgtgtcaag atatgaatcc atcagacttt gagatgtatc agcccattta tgtaagacca 660

gatgcacttg aagctgaaag aatacgccgt ttgaataata aatttgtcat acagcatttt 720

agtaataatg tagatgcaca agtagataat gatgagaatg cgaaacttag agaacaagta 780

gagtcagaga aaggaaattg gattatacct ttagcaactg ctggaatagg tggagtagtg 840

cctgtttttg gacttttatt tactgggctg gatatagcat ccgggatagg aaattcatac 900

tcaggaagtg tacgtgcaga aaaacaaatt tataaagacg aattggttaa cactgcagat 960

aaatttggta tgactgtaac aatgacaact gttaccacgg agcagccata tactatggaa 1020

ataacaatga accctacacc ggaaacaaaa caaattttac aacgttggca agaacgatcg 1080

aaagataacg gttcagcagt tgagttccct gatttagaaa aaatggatta tattgaactg 1140

cataagtatt acatggacaa taataaatat tggtcggatg acgacgaaaa atatattttt 1200

ggaaagcagt ga 1212

<210> 13

<211> 369

<212> DNA

<213> 合成

<400> 13

atgaaaaagc aacataactc aaagcttatt ttattacaag aaattcattc aacagaacta 60

gaaatcccac ttaaagattg ggaatatgac cccgaaaaag aactttacct tgttgttgat 120

ttgtttattg gaacaaatga tggcacgaaa agaggaaatt attttcatgt tccagtggta 180

acaccagcaa ctttgtataa acttccaaaa gggaaacgaa aagcaatcgt attggaatat 240

taccgctatg atttactttt ggataaaata gaatccattt tggaaaaatg tacaaaagag 300

agctgggatg attcttgtga agcgctgcaa aattatttct tttgggaata tgaaaattac 360

aaagcttaa 369

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 14

aaggtggcta taaagaagg 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 15

gcatcgtttg gttctgttt 19

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 16

gagaatgtta tccgatgc 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 17

agccaatctt cactatgc 18

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 18

aatcgttcta aatggatagc 20

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 19

tcgcttttat ccacatct 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 20

attagcctat atcaacgc 18

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 21

ttcatctctt gctgttatc 19

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 22

ggtggaagtg gagataagt 19

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 23

tccgcaacta cgatacct 18

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 24

agatgcccta acagacaag 19

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 25

atttctccct ctcctaac 18

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 26

aagggaccag tctatatt 18

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 27

ctgacttaac ttcatattcc g 21

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 28

cgaatattgc acttgttgag 20

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 29

ctatcctagc atcaatggc 19

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 30

atggctactc ggtataatgg 20

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 31

tacttcccac tctaaatctt cc 22

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 32

gggatgatta gtttaattgc 20

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 33

gaataatatg gtgcagac 18

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 34

ctccatccct aacacgcaat 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 35

gacacctgca tcatcataac 20

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 36

atagcccaga aggacaag 18

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 37

cgcattctca tcattatcta c 21

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 38

caacagaact agaaatccca c 21

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 39

gcttcacaag aatcatccca g 21

Claims (5)

1.一组用于检测血清型单核增生李斯特菌的分子靶标组合作为被检测靶标在鉴别血清型单核增生李斯特菌中的应用，其特征在于，所述分子靶标组合包括如SEQ ID NO.1~13所示的核苷酸序列，所述应用为非疾病诊断和治疗目的应用；

所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌1/2a、1/2c和3a血清型菌株；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌1/2b、3b、7、4b、4d、4e和4ab血清型菌株；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3~5所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌4a和4c血清型菌株；所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 6~7所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌1/2a和3a血清型菌株；所述核苷酸序列如SEQID NO.8所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌1/2c血清型菌株；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌4b、4d、4e和4ab血清型菌株；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌1/2b、3b和7血清型菌株；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌4a血清型菌株；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.12~13所示的分子靶标用于检测单核增生李斯特菌4c血清型菌株。

2.一组用于检测如权利要求1所述的分子靶标组合的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO. 14~39所示。

3.一种检测血清型单核增生李斯特菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2所述的引物组。

4.一种非疾病诊断和治疗目的的检测血清型单核增生李斯特菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）使用如权利要求2所述的引物组对检测样本进行PCR扩增；

（2）将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，核苷酸序列如SEQ ID NO.14-15所示引物的扩增产物的电泳结果出现229bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌1/2a、1/2c或3a血清型菌株；核苷酸序列如SEQ ID NO. 16-17所示引物的扩增产物的电泳结果出现237bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌1/2b、3b、7、4b、4d、4e或4ab血清型菌株，核苷酸序列如SEQ ID NO. 18-19所示引物的扩增产物的电泳结果出现230bp、核苷酸序列如SEQ ID NO. 20-21所示引物的扩增产物的电泳结果出现307bp和核苷酸序列如SEQ IDNO. 22-23所示引物的扩增产物的电泳结果出现291bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌4a或4c血清型菌株；核苷酸序列如SEQ ID NO. 24-25所示引物的扩增产物的电泳结果出现285bp和核苷酸序列如SEQ ID NO. 26-27所示引物的扩增产物的电泳结果出现265bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌1/2a或3a血清型菌株；核苷酸序列如SEQID NO. 28-29所示引物的扩增产物的电泳结果出现192bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌1/2c血清型菌株；核苷酸序列如SEQ ID NO. 30-31所示引物的扩增产物的电泳结果出现188bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌4b、4d、4e或4ab血清型菌株；核苷酸序列如SEQ ID NO. 32-33所示引物的扩增产物的电泳结果出现213bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌1/2b、3b或7血清型菌株；核苷酸序列如SEQ ID NO. 34-35所示引物的扩增产物的电泳结果出现361bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌4a血清型菌株；核苷酸序列如SEQ ID NO. 36-37所示引物的扩增产物的电泳结果出现524bp和核苷酸序列如SEQ ID NO. 38-39所示引物的扩增产物的电泳结果出现274bp的条带则判定样品中含有单核增生李斯特菌4c血清型菌株。

5.如权利要求4所述的检测血清型单核增生李斯特菌的方法，其特征在于，PCR的反应体系为25μL，包括10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L的MgCl₂ 2.0μL、2.5mmol/L的dNTP1.0μL、5μM上下游引物各1.0μL、Taq酶1U、DNA模板2μL、灭菌双蒸水补足体积至25μL；PCR反应条件为95℃ 预变性5min；95℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10 min。

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