CN113512601A - 用于筛查变形杆菌属的分子靶标以及定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于筛查变形杆菌属的分子靶标，所述分子靶标为4段核苷酸片段，所述核苷酸片段的序列如SEQ ID NO：1～4所示，还提供了用于检测所述分子靶标的引物组，以及对应的PCR检测方法。本发明的检测方法可检测到更多的变形杆菌，变形杆菌属覆盖率更大，增强了实用性；本发明的检测方法针对变形杆菌检测具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本低、稳定性好的优点。

Description

用于筛查变形杆菌属的分子靶标以及定量检测方法

技术领域

本发明属于微生物检验技术领域，涉及鉴别变形杆菌属的方法，具体涉及 用于筛查变形杆菌属的分子靶标以及定量检测方法。

背景技术

变形杆菌属于肠杆菌科，是一类革兰氏阴性菌，呈球形或丝状形，具有鞭 毛、无荚膜、无芽胞，运动活泼。常见变形杆菌包括普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、卡氏变形杆菌(Proteus cibarius)、 彭氏变形菌(Proteuspenneri)、豪氏变形杆菌(Proteus hauseri)、产黏变形杆菌 (Proteus myxofaciens)六种。变形杆菌属是常见的腐败菌，广泛分布于土壤、污 水、腐败有机物中。变形杆菌属一般污染食品，引起色、香、味等感官性状异 常外，可破坏食物的营养组分，产生有毒性的多种代谢产物，严重影响食品质 量安全。此外，变形杆菌还是一类食源性条件致病菌，主要污染食品有肉类、 鱼、鸡蛋、乳制品、蔬菜沙拉等，污染主要发生在食品加工、储藏过程中。据 报道，食品中变形杆菌污染率在3.8～8％之间，且每年呈递增趋势。截止2011 年，已发生变形杆菌属食品中毒事件200起，中毒人数11300多人。在临床治 疗过程中，变形杆菌属作为重要感染病原菌，其危害仅次于大肠杆菌、葡萄球 菌和绿脓杆菌感染。变形杆菌属污染可造成泌尿道感染、呼吸道感染、创伤及 烧伤感染、肠炎、脑膜炎、角膜炎、败血症等，给人类健康造成重大危害。变 形杆菌污染常常是属内多种病原菌共同参与，因此，快速精确定量变形杆菌属 的污染具有重要意义。

变形杆菌属的检测方法主要有传统分离培养法、尿素酶试纸法和全自动微 生物分析系统检测法。传统分离培养法主要是依据《食物中毒诊断标准及技术 处理总则》及《变形杆菌食物中毒诊断标准及处理原则》进行实验，该法操作 繁琐、费时费力。尿素酶试纸法克服了传统分离培养法的不足，操作简单，能 够在几分钟内鉴别变形杆菌属，但准确性低、可靠性较差。全自动微生物分析 系统检测法同时具有传统分离培养法准确性好及试纸法操作简便、快速等优点, 但是仪器及比对数据库价格昂贵，检测成本相对高，一般单位难以承受。随着 分子生物学的发展，以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便 的特点，逐渐成为取代常用变形杆菌属检测方法最具潜力的技术之一，其中最 常用定量检测方法为qPCR技术。

特异性分子检测靶标是保证PCR方法特异性、灵敏度的关键。目前，国内 外PCR检测方法对变形杆菌属检测的分子检测靶标及引物已有一定的报道，主 要是针对编码延伸因子Tu的tuf、编码ATP合酶的催化亚基的atpD以及编码 DNA解旋酶的gyrB进行引物设计及快速检测。然而上述特异性基因如tuf，在 变形杆菌属内甚至其他属中具有较高同源性，经过序列比对分析得到的分子靶 标特异性相对较差。而特异的atpD、gyrB检测靶标均通过基因片段进行序列比 对，基因覆盖率相对较低，且变形杆菌特异基因突变造成缺失，易导致漏检结 果。随着变形杆菌遗传变异及新种的不断发现，基于原有的变形杆菌属分子靶 标的精准鉴定面临了巨大的挑战。寻找新型特异性靶标分子用于变形杆菌属快 速、精确定量具有重要意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了用于鉴别变形杆菌属包括普通变形 杆菌、奇异变形杆菌、卡氏变形杆菌、彭氏变形菌、豪氏变形杆菌、产黏变形 杆菌的特异性新分子靶标及相应的定量检测方法。

本发明采取以下技术方案实现本发明的目的：

第一个方面：本发明提供了用于筛查变形杆菌属的分子靶标，所述分子靶标 为4段核苷酸片段，所述核苷酸片段的序列如SEQ ID NO：1～4所示。通过泛 基因组分析得到变形杆菌中分别含有如SEQ ID NO：1～4所示的特异性序列片 段，这些片段均可作为鉴别变形杆菌属的特异性分子靶标。且该靶标对目标菌 基因覆盖率为100％，非目标菌覆盖率为0％。

优选地，所述变形杆菌属包括普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、奇异变形 杆菌(Proteus mirabilis)、卡氏变形杆菌(Proteus cibarius)、彭氏变形菌(Proteuspenneri)、豪氏变形杆菌(Proteus hauseri)、产黏变形杆菌(Proteus myxofaciens)。 本发明通过实验验证了本发明的分子靶标可检测出多种变形杆菌，覆盖率为 100％。

第二个方面：本发明提供了一组用于扩增上述分子靶标的引物组，所述引物 序列如SEQ ID NO：5～12所示。本发明设计了能够扩增上述分子靶标的引物， 通过该引物可扩增出多种变形杆菌的目的条带，且灵敏度为均为10²CFU/mL。

优选地，如SEQ ID NO：5～6所示的引物扩增序列如SEQ ID NO：1所示的 分子靶标；如SEQ ID NO：7～8所示的引物扩增序列如SEQ ID NO：2所示的分 子靶标；如SEQ IDNO：9～10所示的引物扩增序列如SEQ ID NO：3所示的分 子靶标；如SEQ ID NO：11～12所示的引物扩增序列如SEQ ID NO：4所示的分 子靶标。

第三个方面：本发明提供了上述分子靶标或如上述引物组在筛查或检测变 形杆菌中试剂的应用。通过本发明的分子靶标和引物，能够精确的检测出多种 不同的变形杆菌，特异性较好，精确度较高。

第四个方面：本发明提供了一种鉴定变形杆菌的方法，包括如下步骤：

S1使用如上所述的引物组对样品或待测菌的基因组DNA进行PCR扩增；

S2观察扩增产物是否出现目的条带，如果出现目的条带则判定该样品含有 变形杆菌，或该待测菌株为变形杆菌。

本发明通过设置多个PCR体系，同时对目标DNA使用不同引物进行扩增， 提高检测效率。本发明的引物对应的产物特异较好，通过观察扩增产物是否在 预期位置即可判断是否存在所述变形杆菌属。

优选地，所述PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl₂2μL，2.5mmol/L dNTP 1μL，模板DNA 100ng，10μmol/L引物各1μL， Tag酶1U，灭菌双蒸水补足体积至25μL；所述PCR扩增程序为：95℃预变性 10min；95℃变性30s；57℃退火30s；72℃延伸60s；变性、退火、延伸共进 行30个循环；最后72℃延伸10min。

第五个方面：本发明提供了一种定量检测变形杆菌的方法，包括如下步骤：

S1使用上所述的引物组对待测样品的基因组DNA进行qPCR扩增；

S2以标准品的菌株纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的qPCR的实时 Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为变形杆菌属的标准曲线；

S3分析扩增结果，通过荧光信号值与标准曲线进行比对，确定待测样品中 变形杆菌的含量。

本发明通过设置多个qPCR体系，同时对目标DNA使用不同引物进行扩增， 提高检测效率。本发明的引物对应的产物特异较好，通过判断体系中荧光信号 强度定量检测体系中变形杆菌属浓度。

优选地，所述qPCR扩增体系为：2×TB Green Premix反应液10μL，模板 DNA100ng，10μmol/L引物各1μL，灭菌双蒸水补足体积至20μL。

优选地，所述qPCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退 火30s，变性、退火共进行40个循环。

与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明体提供了用于鉴别变形杆菌 属(包括普通变形杆菌、奇异变形杆菌、卡氏变形杆菌、彭氏变形菌、豪氏变 形杆菌、产黏变形杆菌)的特异性分子靶标，并提供了相关的扩增这些分子靶 标的引物组，以及对应的PCR检测方法。本发明的检测方法可检测到更多的变 形杆菌，变形杆菌属覆盖率更大，增强了实用性；本发明的检测方法针对变形 杆菌检测具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本低、稳定 性好的优点。

附图说明

图1为实施例2中变形杆菌PCR鉴定方法特异性评价电泳结果示意图。

图2为实施例6中变形杆菌纯培养液qPCR定量检测方法建立的结果示意 图。

图3为实施例7中人工加标样本变形杆菌qPCR定量检测方法建立的结果示 意图。

图4为实施例7中人工加标样本变形杆菌qPCR定量检测方法qPCR的实时Ct值示意图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实 施例对本发明作进一步说明。

实施例1筛选获得变形杆菌属的特异性分子靶标

根据NCBI网站中368株变形杆菌和40株非变形杆菌基因组数据，进行泛 基因组分析；筛选得到变形杆菌(包括：普通变形杆菌、奇异变形杆菌、卡氏 变形杆菌、彭氏变形菌、豪氏变形杆菌、产黏变形杆菌)的特异性基因片段， 获得的基因片段序列分别如SEQ IDNO：1～4所示。

筛选所获得变形杆菌属的特异性分子靶标均来自奇异变形杆菌 NCTC4199，各靶标基因片段序列对应基因位点如下表1。

表1变形杆菌属的特异性分子靶标基因组位点

实施例2鉴定变形杆菌的PCR方法

1)引物设计

根据实施例1中的如SEQ ID NO：1～4所示的序列设计特异性PCR扩增引 物组(包括正向引物和反向引物)，引物组序列如下表2。

表2特异性PCR检测引物组

2)鉴别变形杆菌属的方法，步骤如下：

S1 DNA模板制备：将待测菌株分别在LB液体培养基中增菌培养，使用商 品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模 板；

S2 PCR扩增：使用表2引物组1～4中的其中之一对待测样品DNA进行PCR 扩增

①PCR检测体系：

②PCR扩增程序：

S3：取PCR扩增产物进行凝胶电泳；

S4：观察各引物组对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带。如果存在， 说明样品中含有变形杆菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含 有对应的变形杆菌。

实施例3本发明变形杆菌PCR检测方法的特异性评价

取变形杆菌24株，非目标变形杆菌23株，按照实施例2的方法进行PCR 检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2 PCR扩增 时，使用的引物为引物组1～4中任一种引物。设置空白对照，空白对照的模板 为不含基因组的水溶液。

所用各细菌的菌株及检测结果如下表3所示，表中，检测结果栏目中“+”表 示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图1所示；实施例2中序号分别为 1～4的引物组，编号1～24为24株变形杆菌；编号25～47为非目标变形杆菌；P 为阳性对照；M为2000Maker。

表3本发明变形杆菌属鉴定特异性评价试验结果

由图1和表3可得，4种引物组的检测结果均只有变形杆菌显示出特异性扩 增条带，非目标变形杆菌株均无特异性条带，说明本发明鉴定方法特异性高。

实施例4本发明的变形杆菌属检测靶标与现有靶标对比结果

本发明利用NCBI数据库中368株变形杆菌和40株非变形杆菌基因组数据， 通过泛基因组数据分析，成功得到4个变形杆菌属特异性新分子靶标。同时搜 索现有变形杆菌属特异分子检测靶标tuf、atpD、gyrB。基于建立的本地BLAST 基因数据库比对结果发现，本发明的分子靶标对目标菌基因覆盖率为100％，非 目标菌覆盖率为0％。而现有文献报道的以tuf、atpD、gyrB作为检测的分子靶 标，其目标菌基因覆盖率分别为44.8％、24.7％、28.8％，非目标菌覆盖率为依 次为0％、0％、5％。因此，通过本实施例说明，本发明的变形杆菌属靶标准确 度高、特异性好，能有效识别实际样本中目标变形杆菌，与现有报道靶标相比 具有明显的优势。具体结果如下表4。

表4本发明变形杆菌属靶标与现有靶标对比结果

参考文献

Paradis,Sonia et al.“Phylogeny of the Enterobacteriaceae based ongenes encoding elongation factor Tu and F-ATPase beta-subunit.”Internationaljournal of systematic and evolutionary microbiology vol.55,Pt 5(2005):2013-2025. doi:10.1099/ijs.0.63539-0

Young,J Met al.“Relationships of plant pathogenicEnterobacteria basedon partial atpD,carA,and recA as individual and concatenated nucleotide andpeptide sequences.”Systematic and applied microbiology vol.30,5(2007):343-54.doi:10.1016/j.syapm.2007.03.002

Limanskiǐ ASonia et al.[Species-specific detection of Proteusvulgaris and Proteus mirabilis by the polymerase chain reaction].Zh MikrobiolEpidemiol Immunobiol.2005 May-Jun；(3):33-9.Russian.PMID:16028510.

实施例5鉴定变形杆菌的qPCR定量检测方法

1)引物设计

根据实施例1中的所述序列SEQ ID NO：1～4设计特异性qPCR扩增引物组 (包括正向引物和反向引物)，引物组序列同上表2。

2)鉴别变形杆菌属的方法，步骤如下：

S1 DNA模板制备：将变形杆菌在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化 的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；

S2 PCR扩增：使用所述的引物组1～4中的其中一种对待测样品DNA进行 PCR扩增

③qPCR检测体系：

④qPCR扩增程序：

S3：取qPCR扩增体系于Roche

96荧光定量扩增仪上进行；

S4：利用软件

96SW 1.1分析扩增结果是否符合预期。在空白 对照不存在荧光信号前提下，如果产生荧光信号，说明样品中含有变形杆菌； 如果不产生荧光信号，则样品中不含有对应的变形杆菌。

实施例6变形杆菌纯培养液qPCR定量检测方法灵敏度评价

将培养至浓度为10⁸CFU/mL的标准菌株奇异变形杆菌CMCC49005和普通 变形杆菌CMCC49027菌株混合，使用去离子水按照10倍梯度稀释，得浓度为 10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸CFU/mL的菌株纯培养物，按照实施例 5进行DNA模板的提取，即为变形杆菌属qPCR的检测标准品，按照实施例5 进行qPCR反应，每个模板分别进行三次平行实验。

绘制标准曲线：以标准品的菌株纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的 qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为变形杆菌属的标准曲线。

标准曲线如图2(1、2、3、4)所示，第1～4对引物检测限均为10²CFU/mL， 所述变形杆菌属的拟合标准曲线分别为y＝-0.1898x²-1.238x+34.506、y＝-3.1991 x²-0.64552x+33.952、y＝-3.4991x²-0.32423x+33.514、y＝-3.3205x²-1.0688x+ 37.596，对应的相关系数依次为：R²＝0.9985、R²＝99896、R²＝99665、R²＝99578。

实施例7人工加标样本变形杆菌qPCR定量检测方法灵敏度评价

新鲜鱼肉采用酒精消毒后切除样品表层的方法制备无菌样品，经NA营养 琼脂平板培养后结果显示处理后的新鲜鱼肉样品中无微生物存在，保证后续实 验中鱼肉样品中的微生物均来源于人工污染。

NA计数平板结果显示人工污染样品的变形杆菌初始菌液浓度为5.9×10⁸ CFU/mL。使用0.85％的无菌生理盐水对人工污染样品的均质液进行10倍梯度 稀释，以制备含变形杆菌菌浓度为10²CFU/mL～10⁸CFU/mL的人工污染模拟样 品。以各梯度均质液中提取的细菌基因组DNA为模板，以无菌蒸馏水为空白对 照，按照实施例5进行qPCR反应，每个模板分别进行三次平行实验。按照实例 6中曲线拟合方式建立对应的人工加标样本标准曲线。

标准曲线如图3(1、2、3、4)所示，第1～4对引物检测限均为5.9×10³CFU/mL， 所述变形杆菌属的拟合标准曲线分别为y＝-0.35304x²-0.11248x+34.028、 y＝-0.20143x²-1.0114x+33.952、y＝-0.3667x²-1.1883x+40.373、y＝-0.34 x²-0.13829x+36.072，对应的相关系数依次为：R²＝0.98854、R²＝98941、R²＝ 99614、R²＝99896。

实施例8实际样本中变形杆菌qPCR定量检测结果

从广州当地三个超市及肉菜市场采集的鲜活鲈鱼、鲟鱼、鲳鱼、石斑鱼、 草鱼5种鱼类样品装于无菌均质袋中运回实验室。在洁净工作台中，无菌操作 下将鱼肉样品进一步分割称重，每个样品5组，每组2份，每份100g，共50 份。然后分别用聚乙烯保鲜膜(其中，氧气透过率：18500cm³/(m²·24h·atm)， 二氧化碳透过率：89500cm³/(m²·24h·atm)，透湿性：34.6/(m²·24h))进行 包装，然后放于4℃冰箱储存9天，模拟鱼肉储存环境。50份样品独立储存。 在储存的第1、3、5、7、9天，分别从各样品中取样，分别提取各样本的基因 组DNA利用实例5中qPCR方法进行检测，使用的引物为引物组1～4中任一组 的引物。并利用传统培养法进行对照检测。检测结果如表5，表中“+”表示检测 结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。

表5实际样本中变形杆菌检测的结果

由表5可得，与传统培养金标准方法比较，在检测的50份鱼肉样本中，利 用本发明qPCR方法进行变形杆菌检测，所有50份草鱼样本目标变形杆菌都可 准确检出，检出准确率为100％。本发明的变形杆菌qPCR分子检测方法针对模 拟鱼肉储存品质的监测，无需对样本富集处理，只需提取样本DNA，配置对应 qPCR体系进行反应及后续检测，整个过程只需3h，检测成本大约6元。而且实 验发现，针对较高浓度变形杆菌污染样本时，无需DNA提取，只需要在PCR 过程中增加10分钟预变性过程，即可完成快速检测，检测时间1.5h，成本可降低到1元以内。反之，传统培养金标准方法一般都需要预增菌、分离纯化、生 化鉴定、血清分型等步骤，检测时间为3-5天，操作相对复杂、检测成本也较高。 相比之下，本发明的变形杆菌qPCR分子检测方法具有检测成本低、操作简单、 检测时间短、准确度高、可靠性好等特点，能有效识别实际样本中目标变形杆 菌。后续通过设计多重PCR体系并结合微流控芯片等装置，有望实现高通量检 测。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域 的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

广东环凯生物科技有限公司

<120> 用于筛查变形杆菌属的分子靶标以及定量检测方法

<130> 5.18

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 472

<212> DNA

<213> 变形杆菌

<400> 1

atggctaatc aaaataaagg tcttacccga atcattaaag ctggtggcta ttcatatcag 60

ggcttacgcg ccgcttggat caatgaagcc gcttttagac aagaagctat tgtgacctta 120

atagcaatta tccttgcatt ttttatcgat gtcagtgttc tagagcgcat tttattgatt 180

gcttcagtcg tccttgtcgt catttttggt acgtgtcgta aaaacatcgg gtgaagaaga 240

gtttatctac ctttcaggtg gtattctcga agttcagcct acaggcgtca ttgtactggc 300

agatacagct atccgtggtc gtgatttgga tgaagcgaaa gcgttggaat ctaagcgtaa 360

agctgaagaa cacattcaat cctctcatgg tgatgttgat tatgctcaag catcagcaga 420

attagccaaa gcgattgcaa aactacgtgt aatcgaattg actagacgct aa 472

<210> 2

<211> 417

<212> DNA

<213> 变形杆菌

<400> 2

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gaagtcaaac atattcaggt aactggtagc gaaggtgagc tcggtattta tccgcagcat 120

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gcagaattag ccaaagcgat tgcaaaacta cgtgtaatcg aattgactag acgctaa 417

<210> 3

<211> 462

<212> DNA

<213> 变形杆菌

<400> 3

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tatctctccc gtgatatgag tatgtttgat gaatatggtg tacctgggga gcgtttttgg 120

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gcttatggct taggcatttt tatgctgcta tatgcaacag gtttatatct atttggcttt 300

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atttttaatt cacctctgcc aacctctgtc ttttttgagt aa 462

<210> 4

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<212> DNA

<213> 变形杆菌

<400> 4

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actactttgt tgaacagtgt ccggaagatc ccatttcaga gatgattaaa attcaaattc 780

attcaataga acagcatcct gttgttttac attaa 815

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 5

aaataaaggt cttacccgaa tc 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 6

gacgacaagg acgactgaa 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 7

acggcgaagt caaacata 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 8

ttacgcttag attccaacg 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 9

gcttatggct taggcattt 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成

<400> 10

agaggttggc agaggtga 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 11

ccgttagcgc cagttattt 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 12

gcctgctcca tcttctttt 19

Claims (10)

1.用于筛查变形杆菌属的分子靶标，所述分子靶标为4段核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段的序列分别如SEQ ID NO：1～4所示。

2.如权利要求1所述的分子靶标，其特征在于，所述变形杆菌属包括普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、卡氏变形杆菌(Proteuscibarius)、彭氏变形菌(Proteus penneri)、豪氏变形杆菌(Proteus hauseri)、产黏变形杆菌(Proteus myxofaciens)。

3.一组用于扩增如权利要求1所述的分子靶标的引物组，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO：5～12所示。

4.如权利要求3所述的引物组，其特征在于，如SEQ ID NO：5～6所示的引物扩增序列如SEQ ID NO：1所示的分子靶标；如SEQ ID NO：7～8所示的引物扩增序列如SEQ ID NO：2所示的分子靶标；如SEQ ID NO：9～10所示的引物扩增序列如SEQ ID NO：3所示的分子靶标；如SEQ ID NO：11～12所示的引物扩增序列如SEQ ID NO：4所示的分子靶标。

5.如权利要求1所述的分子靶标或如权利要求3所述的引物组在筛查或检测变形杆菌试剂中的应用。

6.一种鉴定变形杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1使用如权利要求3所述的引物组对样品或待测菌的基因组DNA进行PCR扩增；

S2观察扩增产物是否出现目的条带，如果出现目的条带则判定该样品含有变形杆菌，或该待测菌株为变形杆菌。

7.如权利要求6所述的的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl₂2μL，2.5mmol/L dNTP 1μL，模板DNA 100ng，10μmol/L引物各1μL，Tag酶1U，灭菌双蒸水补足体积至25μL；所述PCR扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s；57℃退火30s；72℃延伸60s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10min。

8.一种定量检测变形杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1使用权利要求3所述的引物组对待测样品的基因组DNA进行qPCR扩增；

S2以标准品的菌株纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为变形杆菌属的标准曲线；

S3分析扩增结果，将荧光信号值与标准曲线进行比对，确定待测样品中变形杆菌的含量。

9.如权利要求8所述的的方法，其特征在于，所述qPCR扩增体系为：2×TB GreenPremix反应液10μL，模板DNA 100ng，10μmol/L引物各1μL，灭菌双蒸水补足体积至20μL。

10.如权利要求8所述的的方法，其特征在于，所述qPCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，变性、退火共进行40个循环。

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