CN107475434A - 一种肺炎克雷伯菌的环介导等温扩增引物组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种肺炎克雷伯菌的环介导等温扩增引物组、试剂盒及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107475434A
CN107475434A CN201710929333.6A CN201710929333A CN107475434A CN 107475434 A CN107475434 A CN 107475434A CN 201710929333 A CN201710929333 A CN 201710929333A CN 107475434 A CN107475434 A CN 107475434A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
nucleic acid
lamp
test strip
klebsiella pneumoniae
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710929333.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107475434B (zh
Inventor
彭钟琴
于辉
杨映
刘华
吴勇亮
苗鹏飞
谢佳芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Foshan University
Original Assignee
Foshan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan University filed Critical Foshan University
Priority to CN201710929333.6A priority Critical patent/CN107475434B/zh
Publication of CN107475434A publication Critical patent/CN107475434A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107475434B publication Critical patent/CN107475434B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种肺炎克雷伯菌的环介导等温扩增引物组，以及应用该引物组的LAMP核酸试纸条检测试剂盒，还有该试剂盒的检测方法。本发明的有益效果包括：核酸试纸条将核酸扩增产物放置在一个物理封闭的环境中进行检测，通过核酸检测试纸条，应用层析式双抗体夹心法的原理进行核酸扩增产物的快速检测，操作简单(1－2分钟)，判读结果时间短(10－15分钟)，与传统的琼脂糖凝胶电泳相比，具有防止实验室交叉污染、防止假阳性、操作时间短、无有毒物质、无需任何仪器设备等特点。

Description

一种肺炎克雷伯菌的环介导等温扩增引物组、试剂盒及其检 测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域。
背景技术
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceaespp.)克雷伯菌属中致病性较强的一类条件致病菌，广泛存在于人和动物肠道、呼吸道以及水、土壤和谷物中，常引起肺炎、脑膜炎、化脓性炎症、泌尿系统疾病、败血症等。据中国细菌耐药性监测网数据表明，克雷伯菌属细菌的临床分离率位列革兰氏阴性菌的第2位，也是我国CHINET细菌耐药性检测系统定期监测的耐药菌之一。除引起人类感染发病外,现已从禽类、两栖类和鱼类等多种动物体内分离到这种细菌，且在世界各地都有报道，并呈现增多趋势，该菌作为人畜共患病原菌已被广泛重视。目前检测肺炎克雷伯菌感染的方法主要包括：微生物培养法和生理生化检测、组织病理学观察、显微镜镜检以及PCR、实时荧光PCR等分子诊断方法。微生物培养法耗时且培养条件复杂，生理生化检测结果的判读依赖于操作者的主观判断，从而导致结果重复差，易错判；组织病理学观察依赖切片技术，耗时；显微镜技术依赖涂片技术；分子检测如PCR、实时荧光PCR技术需要昂贵的仪器设备、技术要求高。由于各自的缺陷，常规的病原检测技术大都不适合养殖基层的现场快速检测。
发明内容
本发明提供一种简便快捷，对肺炎克雷伯菌灵敏、特异的LAMP引物。
肺炎克雷伯菌的环介导等温扩增引物组，包括引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6，各引物的序列如SEQ ID№1～6所示。
将上述引物组应用于肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒，各引物的引物浓度均为10μM。
上述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括Bst DNA聚合酶，10×buffer，dNTPMix，MgSO4，甜菜碱。
该肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)引物组前处理：将0.5ul的引物P1和P2、5ul的引物P3和P4、2ul的引物P5和P6混合均匀；
2)环介导等温扩增反应：将样品、引物组和反应液混合均匀后，放入恒温水浴锅，在65℃下，进行环介导等温扩增反应40分钟；
3)核酸试纸条检测：将恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，10mim观察结果。
本发明的有益效果包括：核酸试纸条将核酸扩增产物放置在一个物理封闭的环境中进行检测，通过核酸检测试纸条，应用层析式双抗体夹心法的原理进行核酸扩增产物的快速检测，操作简单(1－2分钟)，判读结果时间短(10－15分钟)，与传统的琼脂糖凝胶电泳相比，具有防止实验室交叉污染、防止假阳性、操作时间短、无有毒物质、无需任何仪器设备等特点。
附图说明
图1是所述肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒特异性实验核酸试纸条检测a1～a9样的检测结果图；
图2是所述肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒特异性实验核酸试纸条检测a10～a17样的检测结果图；
图3是所述肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒敏感性实验核酸试纸条检测b1～b11样的检测结果图；
图4是所述肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒对18份菌株样本的核酸试纸条检测c1～c10样的检测结果图；
图5是所述肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒对18份菌株样本的核酸试纸条检测c11～c20样的检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒特异性实验核酸试纸条检测。
试验用菌株：鱼源致病性肺炎克雷伯菌，编号为a1；维氏气单胞菌，编号为a2；温和气单胞菌，编号为a3；嗜水气单胞菌，编号为a4；豚鼠气单胞菌，编号为a5；费氏柠檬酸杆菌，编号为a6；柱状黄杆菌，编号为a7；恶臭假单胞菌，编号为a8；铜绿假单胞菌，编号为a9；类志贺邻单胞菌，编号为a10；迟钝爱德华菌，编号为a11；腐败希瓦氏菌，编号为a12；鳗弧菌，编号为a13；溶藻弧菌，编号为a14；副溶血弧菌，编号为a15；霍乱弧菌，编号为a16。
菌株的培养：肺炎克雷伯菌、维氏气单胞菌、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、费氏柠檬酸杆菌、恶臭假单胞菌，铜绿假单胞菌、类志贺邻单胞菌、迟缓爱德华菌、腐败希瓦氏菌采用脑心浸液琼脂平板28℃恒温培养24h；柱状黄杆菌采用0.05％胰蛋白胨琼脂平板28℃恒温培养48h；鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌采用胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板28℃恒温培养24h。各培养的细菌抽提DNA。无菌dd H2O作为阴性对照模板。
LAMP扩增：使用FimK基因序列设计的一套LMAP引物进行LAMP扩增。反应体系为25μl：0.2ml的PCR反应管中加入菌液模板2μl，10×buffer 2.5μl，MgSO4(100mmol/L)1.5μl，0.5ul的引物P1和P2、5ul的引物P3和P4、2ul的引物P5和P6，dNTP(10mmol/L)3.5μl，Bst DNA聚合酶(8000U/ml)1μl，ddH2O补齐至25μl。使用65℃扩增40min。LAMP扩增后的产物，用核酸试纸条检测。
图1所示的核酸试纸条检测结果，显示采用上述LAMP方法样品，a1的肺炎克雷伯菌的试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区(C线)，一条位于检测区(T线)，a2～a16的其他模板试纸条质控区(C线)出现一条红色条带，检测区(T线)没有条带，阴性对照试纸条及其余菌株的试纸条的质控区(C线)出现一条红色条带，检测区(T线)也没有条带。
实施例2：肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒敏感性实验核酸试纸条检测。
微量核酸测定仪测定肺炎克雷伯菌模板的浓度，再进行10倍梯度稀释。对不同浓度模板进行LAMP扩增后，核酸试纸条检测显示在模板浓度为2×10-6μg/μl时，依然可以观察到清晰的两条红色条带,一条位于质控区(C线)，一条位于检测区(T线)，模板浓度为2×10-7μg/μl时，还可以观察到2条红色条带，表明LAMP反应能检测模板的最低浓度为2×10-7μg/μl，其中1为DNA Marker，b1-b10号试样肺炎克雷伯菌模板的浓度分别为20μg/μl、2μg/μl、2×10-1μg/μl、2×10-2μg/μl、2×10-3μg/μl、2×10-4μg/μl、2×10-5μg/μl、2×10-6μg/μl、2×10-7μg/μl、2×10-8μg/μl，b11为阴性对照。结果如图2所示，b1～b9的浓度下均能得到阳性结果，证明该试剂盒具有极高的敏感性。
实施例3：肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒对18份菌株样本的核酸试纸条检测。
菌株样品的采集：从病鱼身上分离、采集样品18份，分别为c1～c18。
运用实施例1中所述LAMP方法及核酸试纸条检测方法对18个分离菌株进行检测，以含有FimK基因序列(GenBank登录号EU044788.1)的T载体克隆为编号c19的阳性质控品，无菌dd H2O作为编号c20的阴性质控品。
含FimK基因序列T载体克隆的制备：以肺炎克雷伯菌为模板，利用FimK引物对(SEQID NO:1和SEQ ID NO:2)进行PCR扩增，得到265bp的扩增产物，经测序与GenBank登录号EU044788.1的序列相符，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中。含FimK基因序列的T载体克隆即为阳性质控品。
结果如图3所示，c1～c10样品扩增出特异性目的条带。将c1～c18的18份分离菌株通过传统的微生物生理生化鉴定技术结合16SrDNA分子生物学方法鉴定后，验证出c1～c10样品确实为鱼源致病性肺炎克雷伯菌，即LAMP核酸试纸条检测方法的准确性为100％。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 一种肺炎克雷伯菌的环介导等温扩增引物组、试剂盒及其检测方法
<130> 2017
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggagcgtta tctttccg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcagatccg ggagatgtt 19
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tttattagcg caagcgcctt tgactgcact tcaatgcgta t 41
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
actgccagtt aagcgacagt ctccccagcg attttaactg 40
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttgacgatgc tcatatccag tt 22
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtggattca ctggcgaa 18

Claims (5)

1.一种肺炎克雷伯菌的环介导等温扩增引物组，其特征在于：包括引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6，各引物的序列如SEQ ID №1～6所示。
2.一种肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的环介导等温扩增引物组。
3.根据权利要求2所述的肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒，其特征在于：所述环介导等温扩增引物组的各引物的引物浓度均为10μM。
4.根据权利要求2所述的肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒，其特征在于：还包括反应液，所述反应液包括Bst DNA聚合酶，10×buffer，dNTP Mix，MgSO4，甜菜碱。
5.肺炎克雷伯菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)引物组前处理：将0.5ul的引物P1和P2、5ul的引物P3和P4、2ul的引物P5和P6混合均匀；
2)环介导等温扩增反应：将样品、引物组和反应液混合均匀后，放入恒温水浴锅，在65℃下，进行环介导等温扩增反应40分钟；
3)核酸试纸条检测：将恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，10mim观察结果。
CN201710929333.6A 2017-10-09 2017-10-09 一种肺炎克雷伯菌的环介导等温扩增引物组、试剂盒及其检测方法 Active CN107475434B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710929333.6A CN107475434B (zh) 2017-10-09 2017-10-09 一种肺炎克雷伯菌的环介导等温扩增引物组、试剂盒及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710929333.6A CN107475434B (zh) 2017-10-09 2017-10-09 一种肺炎克雷伯菌的环介导等温扩增引物组、试剂盒及其检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107475434A true CN107475434A (zh) 2017-12-15
CN107475434B CN107475434B (zh) 2021-03-30

Family

ID=60606007

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710929333.6A Active CN107475434B (zh) 2017-10-09 2017-10-09 一种肺炎克雷伯菌的环介导等温扩增引物组、试剂盒及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107475434B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588183A (zh) * 2018-05-03 2018-09-28 佛山科学技术学院 一种钙黄绿素可视化lamp检测肺炎克雷伯菌的检测反应体系

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101892300A (zh) * 2010-02-10 2010-11-24 广州华峰生物科技有限公司 肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及其使用方法
CN102899419A (zh) * 2012-11-12 2013-01-30 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 运用核酸恒温扩增技术检测肺炎克雷伯菌的试剂及其扩增方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101892300A (zh) * 2010-02-10 2010-11-24 广州华峰生物科技有限公司 肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及其使用方法
CN102899419A (zh) * 2012-11-12 2013-01-30 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 运用核酸恒温扩增技术检测肺炎克雷伯菌的试剂及其扩增方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STRUVE,C.等: "Klebsiella pneumoniae type 1 fimbriae gene cluster, complete sequence", 《GENBANK核酸数据库》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588183A (zh) * 2018-05-03 2018-09-28 佛山科学技术学院 一种钙黄绿素可视化lamp检测肺炎克雷伯菌的检测反应体系

Also Published As

Publication number Publication date
CN107475434B (zh) 2021-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Application of real-time PCR for quantitative detection of Campylobacter jejuni in poultry, milk and environmental water
CN107022644A (zh) 果蔬中六种食源性致病菌多重lamp检测引物、检测试剂盒及检测方法
Wei et al. Development and application of a multiplex PCR assay for rapid detection of 4 major bacterial pathogens in ducks
Guernion et al. Identifying bacteria in human urine: current practice and the potential for rapid, near-patient diagnosis by sensing volatile organic compounds
Al-Kandari et al. Genotypic and phenotypic diversity differences of presumptive commensal and avian pathogenic E. coli
CN109628622A (zh) 一种检测多杀性巴氏杆菌的实时定量lamp引物组及试剂盒
CN103898222A (zh) 一种基于bcfD基因的沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法
CN104342496B (zh) 一种快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法
Baaboua et al. A review of current knowledge and gaps about Campylobacter methods: from culture to characterization.
CN107475434A (zh) 一种肺炎克雷伯菌的环介导等温扩增引物组、试剂盒及其检测方法
CN111518935A (zh) 一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法
CN113512601B (zh) 用于筛查变形杆菌属的分子靶标以及定量检测方法
Li et al. Development of a rapid and fully automated multiplex real-time PCR assay for identification and differentiation of Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus on the BD MAX platform
CN109666752A (zh) 一种检测绵羊肺炎支原体的实时定量lamp引物组及试剂盒
AU2019100071A4 (en) Pcr detection kit for rapidly identifying salmonella of specific serotypes
CN105256041A (zh) 对亲水气单胞菌o44，o24，o25和o28特异的核苷酸及应用
CN108950027A (zh) 一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的试剂盒和方法
CN103305593B (zh) 一种利用RNA恒温扩增的沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒
CN109628621A (zh) 一种检测肺炎克雷伯氏菌的实时定量lamp引物组及试剂盒
CN109251990A (zh) 一种基于巢式pcr的检测沙门氏菌的引物组、用途、包含该引物组的试剂盒及其检测方法
Abu Rumaila et al. Electronic tongue for determining the limit of detection of human pathogenic bacteria
CN113913318B (zh) 一种同时携带四个喹诺酮类药物耐药突变位点的鼠伤寒沙门菌及其应用
CN114107532B (zh) 用于鉴定铜绿假单胞菌的分子靶标及其定量检测方法
CN104032000A (zh) 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒
Sırıken et al. Pseudomonas aeruginosa detection methods from ground beef and chicken meat samples

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant