CN116024358A

CN116024358A - 一种检测沙门菌的靶基因、pcr引物对、检测方法和用途

Info

Publication number: CN116024358A
Application number: CN202210791299.1A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 孟闯; 丁睿清; 潘志明; 尚月月; 徐双媛; 刘钧; 康喜龙; 顾丹
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-07-04
Filing date: 2022-07-04
Publication date: 2023-04-28

Abstract

本发明公开了一种检测沙门菌的靶基因、PCR引物对、检测方法和用途。PagN基因作为靶标在制备和/或筛选检测沙门菌产品中的用途，所述PagN基因的核苷酸序列包括如SEQID NO.3所示序列。本发明的PagN基因在沙门菌中出现，而不在其他微生物中存在，PagN基因作为不同血清型沙门菌PCR检测的靶标，本发明还提供了PCR引物对，能同时识别不同血清型沙门菌，特异性高、灵敏度高和准确率高，对识别沙门菌的暴发流行，相关疾病的诊断和控制具有重要意义。

Description

一种检测沙门菌的靶基因、PCR引物对、检测方法和用途

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测沙门菌的靶基因、PCR引物对、检测方法和用途。

背景技术

沙门菌(Salmonella)是一种重要的人兽共患病原菌，在全球范围内广泛分布。根据Kauffman-White提出的血清型分类，沙门菌可分为A、B、C1、C2、D、E1～E4、F、G、I等血清群，这些血清群进一步细分成血清型，目前已发现2600多种血清型。

在过去几十年中由其引发的食物中毒事件屡屡发生，造成了严重的公共卫生问题。根据食品和饲料快速警报系统(RASFF)的报告，沙门菌的发病率从2006年到2020年一直在逐年增长。引起人类感染的常见沙门菌主要有肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、圣保罗沙门菌、海德堡沙门菌、纽波特沙门菌、德尔卑沙门菌等多种血清型沙门菌。还有一些血清型虽不常见，却有更强的致病性，如猪霍乱沙门菌、都柏林沙门菌等亦能引起严重疾病。因此，对沙门菌采取可靠、高效的检测手段尤为重要。

目前，鉴定传统沙门菌所使用的主要技术依然是传统微生物培养法，该方法需要预增菌、选择性增菌、分离纯化等一系列预处理，耗时一般长达1周左右，难以满足快速检测的需求。因此需要研究出更快，更简便的方法。国际标准化组织(ISO)在过去的几年内使PCR标准化并用于食品检测。PCR可以在短时间内产生更多的数据，数据的可信度更高，降低工作量，因此分析的花费也低。沙门菌的外膜蛋白(OMP)存在于多数血清型中，常具有较高的相似性，是一类可对多种沙门菌血清型进行广谱检测的靶标。但现有技术中靶标存在特异性不强，检测灵敏度低的问题。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测沙门菌的靶基因、PCR引物对、检测方法和用途，以期解决现有技术中存在的问题。

发明人发现PagN基因存在于沙门菌绝大多数血清型中，而非沙门菌中PagN基因的相似性为0，非沙门菌中不存在PagN基因。根据PagN基因的分布特点可将沙门菌与非沙门菌区分开。在此基础上发明人设计了相关的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。

本发明的第一方面保护，PagN基因作为靶标在制备和/或筛选检测沙门菌产品中的用途，所述PagN基因的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示序列。

本发明的第二方面保护，检测PagN基因的物质在制备和/或筛选检测沙门菌产品中的用途。

根据本申请的某些实施方式，所述检测PagN基因的物质包括PCR引物对，所述PCR引物对的序列包括如SEQ ID NO.1所示序列和如SEQ ID NO.2所示序列。

本发明的第三方面保护，一种用于快速检测沙门菌的引物对，所述PCR引物对的序列包括如SEQ ID NO.1所示序列和如SEQ ID NO.2所示序列。

本发明的第四方面保护，一种快速检测沙门菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括检测PagN基因的物质。

根据本申请的某些实施方式，所述PCR检测试剂盒试剂盒还含有无菌水、Taq DNA聚合酶、样品基因组DNA提取试剂中的一种或多种。

由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

根据本申请的某些实施方式，所述PCR检测试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。

根据本申请的某些实施方式，所述PCR检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR检测液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有无菌水(ddH₂O)、2×Taq Master mix。加入本发明的引物、待检样本DNA提取物或者样本菌液即可获得PCR反应体系。

根据本申请的某些实施方式，所述PCR检测试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有PagN基因表达的DNA样本。

根据本申请的某些实施方式，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为无PagN基因表达的DNA样本。

本发明的第五方面保护，一种快速检测沙门菌的方法，包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)所述样品基因组DNA与PCR反应体系进行PCR反应，所述PCR反应体系含有检测PagN基因的物质；优选地，所述检测PagN基因的物质包括PCR引物对，所述PCR引物对的序列包括如SEQ ID NO.1所示序列和如SEQ ID NO.2所示序列；

(3)PCR反应结束后，分析结果。

根据本申请的某些实施方式，以PCR反应体系的总体积为基准计，所述检测PagN基因的物质的浓度为40～60nM。在某些优选的实施方式中，为50nM。

根据本申请的某些实施方式，所述分析结果包括进行凝胶电泳检测PCR反应产物，然后比较电泳后条带，如果在554bp位置有条带，则证明所述样品中含有沙门菌。

根据本申请的某些实施方式，所述PCR反应的条件设置为：(a)95℃预变性5min；(b)95℃变性30s；(c)58℃退火30s；(d)72℃延伸1min，(b)～(d)循环25次，(e)72℃5min；(f)4℃保存。

本发明的第五方面保护，如上文所述的引物对或如上文所述的PCR检测试剂盒在检测沙门菌中的用途。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明发现PagN是一个8次跨膜的外膜蛋白，由位于染色体的PagN基因编码，存在于绝大多数沙门菌血清型中，在非沙门菌中不存在PagN基因，其能作为不同血清型沙门菌PCR检测的靶标。

2)以本发明的PCR为引物对制成的PCR检测试剂盒，能适用于不同血清型沙门菌的检测，具有沙门菌属特异性。本发明的试剂盒能快速高通量检测不同血清型沙门菌，可作为沙门菌属鉴定的辅助方法，并为沙门菌的监测与实验室诊断提供了一种简单快速、特异性好、灵敏度高且重复性好的新方法。

3)相比与常用的stn PCR，以发明的PCR引物对对样本进行检测时，检测敏感性更高。

4)相比与传统微生物培养法，以发明的PCR引物对对样本进行检测时，时间更短、更简便。

附图说明

图1显示为本发明的实施例3中采用PCR引物对分别对18种不同血清型沙门菌进行检测的结果图。其中，泳道M为DL1000 DNA marker；1为甲型副伤寒沙门菌；2为德尔卑沙门菌；3为鼠伤寒沙门菌；4为印第安纳沙门菌；5为加利福利亚沙门菌；6为婴儿沙门菌；7为罗森沙门菌；8为姆班达卡沙门菌；9为汤普逊沙门菌；10为纽波特沙门菌；11为病牛沙门菌；12为肯塔基沙门菌；13为肠炎沙门菌；14为鸡白痢沙门菌；15为韦尔泰夫利丁沙门菌；16为伦敦沙门菌；17为山夫顿堡沙门菌；18为阿伯丁沙门菌。

图2显示为本发明的实施例3中采用PCR引物对分别对肠炎沙门菌和14种非沙门菌进行检测的结果图。其中，泳道M为DL1000 DNA marker；1为肠炎沙门菌；2为大肠杆菌ATCC25922；3为弗氏柠檬酸杆菌；4为副溶血弧菌；5为单核细胞增生李斯特菌；6为葡萄球菌；7为肺炎克雷伯杆菌；8为空肠弯曲菌；9为结核分枝杆菌；10为普通变形杆菌；11为铜绿假单胞菌；12为阴沟肠杆菌；13为福氏2a志贺氏菌；14为霍氏肠杆菌；15为乳酸杆菌。

图3显示为本发明的实施例4中PCR检测试剂盒灵敏度鉴定的结果图。其中，泳道M为DL1000 DNA marker；1-6代表不同浓度的肠炎沙门菌C50041的DNA基因组，1为328.23μg/mL；2为32.28μg/mL；3为3.22μg/mL；4为322ng/mL；5为32.2ng/mL；6为3.22ng/mL；7为0.32ng/mL；8为阴性对照。

图4显示为本发明的实施例5中PCR检测试剂盒在模拟样品中的检测结果图。其中，M为DL1000 DNA marker；1-6分别为1CFU/mL、10CFU/mL、10²CFU/mL、10³CFU/mL、10⁴CFU/mL和10⁵CFU/mL的肠炎沙门菌C50041的菌悬液；7为阴性对照。

图5显示为本发明的实施例5中stn PCR方法在模拟样品中的检测结果图。其中，M为DL500 DNA marker；1为阴性对照；2-7分别为0CFU、1CFU、10CFU、10²CFU、10³CFU、10⁴CFU。

图6显示为本发明的实施例6中猪肉样品经PCR检测试剂盒进行沙门菌检测的结果图的结果。其中，泳道M为DL1000 DNA marker；1-40分别为编号1-40号的猪肉的PCR泳带。

图7显示为本发明的实施例6中猪肉样品经传统微生物分离培养方法结合血清型鉴定的结果图。其中，泳道M为DL1000 DNA marker；1-4分别为传统微生物培养法结合血清型鉴定的PCR泳带。

图8显示为本发明的实施例7中鸡胚样品经PCR检测试剂盒的检测结果图。其中，泳道M为DL1000 DNA marker；1-9分别代表编号1-9号鸡胚样品的PCR泳带。

图9显示为本发明的实施例7中采用传统微生物培养方法结合血清型鉴定鸡胚样品中沙门菌的结果图。其中，泳道M为DL1000 DNA marker；1-2为传统微生物培养方法结合血清型的PCR泳带。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本申请的下述实施例中，BPW液体培养基的组成为：蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠9.0g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸亚铁0.25g，溶于1 000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。

本申请的下述实施例中，XLT4琼脂环凯微生物科技有限公司。

本申请的下述实施例中，肠炎沙门菌C50041由实验室保存。

实施例1生物信息学方法鉴定PagN基因的分布

在NCBI中使用Blastn在线比对软(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在全基因组数据库中搜索PagN基因，搜索结果表明PagN基因存在于绝大多数沙门菌血清型中，而非沙门菌中PagN相似性为0，表明在非沙门菌中不存在PagN基因。

根据PagN基因的分布特点可将沙门菌与其他非沙门菌区分开。

实施例2试剂盒的制备

本实施例中，以PagN基因为模板，筛选出最佳检测用PCR引物对，并制备PCR检测试剂盒。包括如下步骤：

1)引物设计与合成

根据沙门菌PagN基因保守片段设计引物以区分是否为沙门菌，通过NCBI网站中Primer-BLAST在线比对引物的特异性，从中选择最佳检测用引物对。最佳检测用引物对的核苷酸序列如下表1所示。

委托擎科生物科技有限公司合成表1中引物对。

表1

2)PCR反应

以肠炎沙门菌的PagN基因为模板，采用表1中的引物对进行PCR反应，PCR反应体系见表2。

表2


		2×Taq Master mix	10μL
pagN-F/pagN-R	各50nM
		模板	1μL
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补至20μL

PCR程序为：95℃5min；95℃30s；58℃30s；72℃1min，循环25次，72℃5min；4℃保存。

表1中pagN-F和pagN-R引物能够扩增出肠炎沙门菌的PagN基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

CCGTAGTCAATGTCTATGGAATCAACTCAACCTTCAGCCAGGATGAGATAGTTAATGGTCATGCAACGTTACCTGACCGTACCAAAGGCGTTTTTGGCGGCGGGGTTGCTATCGGTTATGACTTTTATGATCCATTCCAGCTTCCAGTACGTTTAGAACTGGATACCACTTTCAGAGGTGAGACGGATGCTAAAGGCGGGCAGGATATTATTGCATTTGGTGATCCAGTACACATAAATGTAAAAAATCAGGTCCGAATGACCACTTACATGGTTAATGGCTATTATGATTTTCACAATAGTACGGCATTTACTCCCTATATCAGCGCAGGCGTTGGCCTCGCTCATGTGAAGCTAAGTAATAACACCATTCCTGTTGGTTTTGGTATTAATGAAACTCTGTCTGCTTCAAAAAATAACTTTGCCTGGGGCGCAGGTATCGGTGCAAAATATGCTGTAACAGATAATATTATGATTGACGCCAGTTATAAATACATTAATGCTGGCAAAGTAAGCATTTCAAAAAATCACTATGCTGGTGATGAACATACCGCTTA

pagN-F和pagN-R引物扩增沙门菌目的基因序列(554bp)，不能扩增出非沙门菌的PagN基因的核苷酸序列。

3)PCR检测试剂盒的制备

PCR检测试剂盒包括终浓度为40～60nM pagN-F和pagN-R引物，Taq DNA聚合酶。

作为一示例，试剂盒包括如下：2×Taq Master mix 10μL、pagN-F 50nM、pagN-R50nM、ddH₂O补至20μL。

各引物对可单独包装，也可以配成PCR检测液。PCR检测液中，pagN-F，pagN-R引物在PCR最终体系中的浓度均为50nM。

也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的各引物对，也可以是含有配置好的含有各引物对的PCR检测液。

进一步地，所述试剂盒还可以含有无菌水(ddH₂O)、2×Taq Master mix、样品基因组DNA等。

实施例3特异性鉴定

本实施例中，采用实施例2的PCR引物对，以18种不同血清型沙门菌和14种非沙门菌的基因组分别为模板，采用PCR方法检测沙门菌。

18种沙门菌包括：B群(甲型副伤寒沙门菌、德尔卑沙门菌、鼠伤寒沙门菌、印第安纳沙门菌、加利福利亚沙门菌)、C群(婴儿沙门菌、罗森沙门菌、姆班达卡沙门菌、汤普逊沙门菌、纽波特沙门菌)、D群(肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌)、E群(韦尔泰夫利丁沙门菌、伦敦沙门菌、山夫顿堡沙门菌)、F群(阿伯丁沙门菌)等。

14种非沙门菌包括：大肠杆菌ATCC25922、弗氏柠檬酸杆菌、副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、空肠弯曲菌、结核分枝杆菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、福氏2a志贺氏菌、霍氏肠杆菌和乳酸杆菌。

PCR反应体系为(20μL)：2×Taq Master mix 10μL，pagN-F 50nM，pagN-R 50nM，模板1μL，ddH₂O补至20μL。

PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s；58℃30s；72℃1min，循环25次，72℃5min；4℃保存。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

图1为本实施例中采用PCR引物对分别对18种不同血清型沙门菌进行检测的结果图。其中，泳道M为DL1000 DNA marker；1为甲型副伤寒沙门菌；2为德尔卑沙门菌；3为鼠伤寒沙门菌；4为印第安纳沙门菌；5为加利福利亚沙门菌；6为婴儿沙门菌；7为罗森沙门菌；8为姆班达卡沙门菌；9为汤普逊沙门菌；10为纽波特沙门菌；11为病牛沙门菌；12为肯塔基沙门菌；13为肠炎沙门菌；14为鸡白痢沙门菌；15为韦尔泰夫利丁沙门菌；16为伦敦沙门菌；17为山夫顿堡沙门菌；18为阿伯丁沙门菌。

从图1可知，PCR电泳结果表明，以18种沙门菌的基因组为模板采用PCR引物对进行PCR反应后，泳道能扩增出目的条带，目的条带大约为554bp。

图2为本实施例中采PCR引物对分别对肠炎沙门菌和14种非沙门菌进行检测的结果图。其中，泳道M为DL1000 DNA marker；1为肠炎沙门菌；2为大肠杆菌ATCC25922；3为弗氏柠檬酸杆菌；4为副溶血弧菌；5为单核细胞增生李斯特菌；6为葡萄球菌；7为肺炎克雷伯杆菌；8为空肠弯曲菌；9为结核分枝杆菌；10为普通变形杆菌；11为铜绿假单胞菌；12为阴沟肠杆菌；13为福氏2a志贺氏菌；14为霍氏肠杆菌；15为乳酸杆菌。

从图2可知，以肠炎沙门菌为模板能扩增出约554bp的泳带，而以14种非沙门菌的基因组为模板无泳带。

从图1和图2综合可知，采用本发明的PCR引物对通过PCR方法能快速鉴定未知细菌是否为沙门菌。

实施例4灵敏性鉴定

本实施例中，对实施例2中以PCR引物对制备得到的PCR检测试剂盒进行灵敏性鉴定。包括如下步骤：

1)采用实施例2的PCR引物对，将肠炎沙门菌C50041的DNA基因组进行梯度稀释，稀释后的浓度依次为328.23μg/mL、32.28μg/mL、3.22μg/mL、322ng/mL、32.2ng/mL、3.22ng/mL和0.32ng/mL，分别以1μL稀释后的DNA基因组为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳后观察条带亮度，直到不出现扩增条带为止，鉴定试剂盒检测沙门菌的灵敏性。

2)同时设置阴性对照组，未添加肠炎沙门菌C50041，其余均同本实施例中步骤1)。

图3为本实施例中PCR检测试剂盒灵敏度鉴定的结果图。其中，泳道M为DL1000 DNAmarker；1-6代表不同浓度的肠炎沙门菌C50041的DNA基因组，1为328.23μg/mL；2为32.28μg/mL；3为3.22μg/mL；4为322ng/mL；5为32.2ng/mL；6为3.22ng/mL；7为0.32ng/mL；8为阴性对照。

从图3可知，电泳结果表明，PCR检测试剂盒的检测限为32.2ng/mL的沙门菌。

实施例5在模拟样品中的应用

本实施例中，采用实施例2的试剂盒在模拟样品中进行沙门菌鉴定。包括如下步骤：

实验组：从农贸市场购买猪肉并切割成10g的条片状，正反面紫外灭菌各30min，得到肉片。采用实施例2的试剂盒，将肠炎沙门菌C50041用ddH₂O调整至10¹CFU/mL、10²CFU/mL、10³CFU/mL、10⁴CFU/mL和10⁵CFU/mL的菌悬液，取100μL各个稀释梯度的菌悬液均匀喷洒在肉片的上表面(约10cm²)，待菌悬液充分吸收干燥后将肉片放进100mL BPW液体培养基中置于37℃分别培养4h、6h、8h、10h和12h，分别得到培养液。取各个时间点的1mL培养液制备基因组模板，采用实施例2的PCR检测试剂盒在检测培养液是否被沙门菌污染，同步进行stn PCR检测作为对照。

阴性对照：其与实验组不同点在于未添加肠炎沙门菌C50041，其余均与实验组相同。

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

图4为本实施例中PCR检测试剂盒在模拟样品中的检测结果图。其中，M为DL1000DNA marker；1-6分别为1CFU/mL、10CFU/mL、10²CFU/mL、10³CFU/mL、10⁴CFU/mL和10⁵CFU/mL的肠炎沙门菌C50041的菌悬液；7为阴性对照。

从图4可知，电泳结果表明，PCR检测试剂盒在模拟样品富集培养10h即可检出1CFU/10g肉片的沙门菌，能在15h内完成检测，其中样品处理1h，BPW增菌12h，PCR 2h，合计15h。

图5为stn PCR在模拟样品中的检测结果。其中，其中，M为DL500 DNA marker；1为阴性对照；2-7分别为0CFU、1CFU、10CFU、10²CFU、10³CFU、10⁴CFU。

从图5可知，电泳结果表明，stn PCR的检测限在培养6h、8h、10h后依次为10⁴CFU/10g、10⁴CFU/10g、10CFU/10g。

图4和图5的结果表明，以PagN为靶标采用PCR方法在模拟污染样品富集培养10h即可检出1CFU/10g的沙门菌，而在相同增菌培养时间内stn PCR的沙门菌检测限为10CFU/10g，说明以PagN为靶标采用PCR方法的敏感性高于stn PCR方法。

实施例6在猪肉样品的应用

本实施例中，采用实施例2的试剂盒在猪肉样品中进行沙门菌鉴定。包括如下：

采用实施例2中试剂盒，检测40份猪肉样品的增菌液，具体步骤如下：

1)猪肉样品的处理

本试验中猪肉样品采自扬州某农贸市场，无菌取出猪肉共40份样品，分别对其进行编号，为1-40号，1-40号样品分别进行增菌处理(Zhou XH,et al.Food Control,2017)，对应得到编号为1-40的增菌液。

2)PCR方法检测猪肉样本中的沙门菌

分别取100μL本实施例中步骤1)得到的编号为1-40的增菌液，洗涤后经沸水浴10min作为PCR模板。按照下述的PCR反应体系和PCR反应程序进行反应，得到PCR反应产物。对得到的PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

PCR反应体系为(20μL)：2×Taq Master mix 10μL，pagN-F 50nM，pagN-R 50nM，本实施例中步骤2)得到的PCR模板1μL，ddH₂O补至20μL。

图6为本实施例中猪肉样品经PCR检测试剂盒进行沙门菌检测的结果图。其中，泳道M为DL1000 DNA marker；1-40分别为编号1-40号猪肉样品的PCR泳带。

从图6可知，可扩增出一条目的条带(554bp)的泳道为沙门菌，没有扩增出条带的泳道表示没有沙门菌。结果显示40份样品中共有3份可检测出一个条带，这些样品中含有沙门菌。

3)传统微生物培养法分离沙门菌结合血清型鉴定猪肉样本中沙门菌

将本实施例步骤1)得到的增菌液用接种环分区划线于XLT4琼脂培养基上，选择特征性菌落进行stn PCR，得到了3份阳性样品，分离株经生化鉴定和血清型鉴定确定其中1株为肠炎沙门菌、2株为罗森沙门菌。stn PCR、生化鉴定和血清型鉴定参考现有技术进行(LiY,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016；刘蓓蓓.沙门菌PCR检测方法的建立及其初步应用[D],扬州大学,2009)。

图7为本实施例中猪肉样品经传统微生物培养方法结合血清型鉴定的结果图。其中，泳道M为DL1000 DNA marker；1-4分别为传统微生物培养法结合血清型鉴定的PCR泳带。

从图6和图7可知，本试剂盒检测结果与传统微生物培养法检测结果完全一致。说明本发明的试剂盒准确度高，特异高。采用传统微生物培养法分离沙门菌结合血清型鉴定的方法，将40份猪肉样品的沙门菌携带情况筛选出来，需要至少3天的时间。而采用本发明实施例2的检测试剂盒，不需要挑取单菌落，可减少至少24h，即可判断出样品中是否有沙门菌，且正确率为100％。

实施案例7在鸡胚样品中的应用

本实施例中，采用实施例2的试剂盒在鸡胚样品中进行沙门菌鉴定。包括如下：

采用实施例2中试剂盒，检测9份鸡胚样品的肝脏增菌液，具体步骤如下：

1)鸡胚样品的处理

本试验中样品采自江苏某鸡场，无菌取出已生病或刚死亡的鸡胚的肝脏共9份样品，分别对其进行编号，为1-9号，1-9号样品分别进行增菌处理(Fei X,et al.FoodControl,2017)，对应得到编号为1-9的增菌液。

2)PCR方法检测鸡胚样品中的沙门菌

分别取100μL本实施例中步骤1)得到的编号为1-9的增菌液，洗涤后经沸水浴10min作为PCR模板。按照下述的PCR反应体系和PCR反应程序进行反应，得到PCR反应产物。对得到的PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

图8为本实施例中鸡胚样品经PCR检测试剂盒的检测结果图。其中，泳道M为DL1000DNA marker；1-9分别代表编号1-9号鸡胚样品的PCR泳带。

从图8可知，可扩增出一条目的条带(554bp)的泳道为沙门菌，没有扩增出条带的泳道表示没有沙门菌。结果显示9份样品中，共有2份可检测出一个条带，这些样品中含沙门菌。

3)传统微生物培养法分离沙门菌结合血清型鉴定

将本实施例中步骤1)得到的增菌液用接种环分区划线后涂布于XLT4琼脂上，选择特征性菌落进行stn PCR，得到了2份阳性样品，分离株经生化鉴定和血清型鉴定均为鸡白痢沙门菌。

stn PCR、生化鉴定和血清型鉴定参考现有技术进行(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)。

图9为本实施例中采用传统微生物培养方法结合血清型鉴定鸡胚样品中沙门菌的结果图。其中，泳道M为DL1000 DNA marker；1-2为传统微生物培养方法结合血清型的PCR泳带。从图8和图9可知，本发明的PCR检测试剂盒检测结果与传统微生物培养法检测结果完全一致，说明本发明的试剂盒准确度高，特异高。

综合实施例6和7可知，采用传统微生物培养法结合血清型鉴定的方法，将猪肉、鸡胚样品的沙门菌携带情况筛选出来，需要至少3天的时间；而采用本发明实施例2的检测试剂盒，因不需要挑取单菌落，可减少至少24h，即可判断出样品中是否有沙门菌，且正确率为100％。

综上所述，本发明的用于快速检测沙门菌的PCR引物对和PCR检测试剂盒相较于传统微生物培养法结合血清型鉴定方法具有如下优势：

传统沙门菌鉴定采用生化鉴定和血清型鉴定，需购买特定的生化和血清型鉴定试剂盒，价格昂贵，步骤繁琐，尤其在大样本中分离沙门菌时，需耗费大量时间(至少7天)，且工作量庞大，其结果是由肉眼进行判断，因而可能存在人为误差；而本发明试剂盒的检测方法操作简单，成本非常低，整个鉴定过程在3小时内即可完成(包含PCR和琼脂糖凝胶电泳)，且准确率达到100％。

因此，本发明以肠炎沙门菌C50041的PagN蛋白基因为靶基因，应用Primer5软件设计特异性引物，并且通过NCBI进行序列比对，筛选出PCR引物对，采用本发明的PCR引物与样品进行PCR反应时，能快速检测出样品是否还有沙门菌，具有特异性强、敏感度高和简便快捷的特点，此外，本发明通过对PCR反应条件的优化、引物特异性和灵敏度的试验以及模拟污染样品的检测，建立沙门菌的PCR快速检测方法，为以后临床样品检测提供了技术支持，同时，对识别沙门菌的暴发流行，相关疾病的诊断和控制具有重要意义。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.PagN基因作为靶标在制备和/或筛选检测沙门菌产品中的用途，所述PagN基因的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示序列。

2.检测PagN基因的物质在制备和/或筛选检测沙门菌产品中的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述检测PagN基因的物质包括PCR引物对，所述PCR引物对的序列包括如SEQ ID NO.1所示序列和如SEQ ID NO.2所示序列。

4.一种用于快速检测沙门菌的PCR引物对，其特征在于，所述PCR引物对的序列包括如SEQ ID NO.1所示序列和如SEQ ID NO.2所示序列。

5.一种快速检测沙门菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括检测PagN基因的物质。

6.如权利要求5所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测PagN基因的物质包括PCR引物对，所述PCR引物对的序列包括如SEQ ID NO.1所示序列和如SEQ ID NO.2所示序列。

7.如权利要求5所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有无菌水、TaqDNA聚合酶、样品基因组DNA提取试剂中的一种或多种。

8.一种快速检测沙门菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(3)PCR反应结束后，分析结果。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述分析结果包括进行凝胶电泳检测PCR反应产物，然后比较电泳后条带，如果在554bp位置有条带，则证明所述样品中含有沙门菌。

10.如权利要求4所述的PCR引物对或如权利要求5～7任一项所述的PCR检测试剂盒在检测沙门菌中的用途。