CN107746890B - 鉴定单增李斯特菌血清型的多重pcr检测引物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR检测引物及方法，属于生物技术领域。所述引物分别为单增李斯特菌种上下游引物、1/2a血清型上下游引物、1/2b血清型上下游引物、1/2c血清型上下游引物和4b血清型上下游引物；所述检测方法采用上述5对引物，分别以单增李斯特菌1/2a血清型DNA、1/2b血清型DNA、1/2c血清型DNA和4b血清型DNA为模板进行多重PCR扩增反应，并将PCR扩增产物进行电泳检测，验证引物的特异性。本发明仅需要常规仪器，通过单次PCR扩增反应即可鉴定单增李斯特菌4种主要血清型，此检测方法具有特异性强、检测灵敏度高、抗干扰性强等特点。

Description

鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR检测引物及方法
技术领域
本发明涉及的是食源性致病菌血清型鉴定检测技术领域，是一种基于多重PCR反应技术的单增李斯特菌主要血清型鉴定方法。
背景技术
单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种重要的食源性致病菌，在自然界中的广泛存在。人和动物接触单增李斯特菌或食用了单增李斯特菌污染的食物，会导致脑膜脑炎、败血症、流产和死胎等疾病的发生，据WHO报道，孕妇、婴儿、老年人及免疫力低下者为李斯特菌病易感人群。
根据菌体和鞭毛抗原，单增李斯特菌分为13个血清型，但并非所有血清型都具有相同的毒性和致病能力。据研究，李斯特菌病主要由单增李斯特菌1/2a、1/2b、1/2c和4b血清型引起，在该病暴发式流行病例中，4b为优势血清型；而从食品和环境中分离出的单增李斯特菌菌株大部分为1/2a和1/2c血清型。将基于特异性靶点基因的PCR分子检测技术应用于鉴定单增李斯特菌血清型，可弥补传统血清诊断分型方法的不足，有助于快速准确分析血清型。因此对单增李斯特菌的生物表型或基因特征的分型研究，可以达到追溯致病菌传染源、控制食源性疾病暴发、保障食品卫生安全的目的。
发明内容
本发明公开了一种特异性好、灵敏度高、检测时间短的单增李斯特菌主要血清型鉴定的多重PCR反应引物及检测方法，提高其血清型鉴定的检测效率和精确度。
技术方案
本发明提供了一种鉴定单增李斯特菌主要血清型的多重PCR检测用引物，其特征在于，所述引物为：
单增李斯特菌种上游引物：5’-GCTCAGCGGCAAATCAAAC-3’，
单增李斯特菌种下游引物：5’-GGCACTCGCAACAGAAACG-3’，
检测特征片段为386bp；
单增李斯特菌1/2a血清型上游引物：5’-GGAGGAGAGTTTATTGACAAATCAGTAT-3’，
单增李斯特菌1/2a血清型下游引物：5’-TTCACCATTTCTCTTTCTTAGTTCATAG-3’，
检测特征片段为510bp；
单增李斯特菌1/2b血清型上游引物：5’-CAACTGGAGGCTTCTTAG-3’，
单增李斯特菌1/2b血清型下游引物：5’-TGAATAACTCTTCTTGTCTGT-3’，
检测特征片段为305bp；
单增李斯特菌1/2c血清型上游引物：5’-AAGCAACAAAGCAGCCTATT-3’，
单增李斯特菌1/2c血清型下游引物：5’-TCTTTCGCTTTAAGGATTGA-3’，
检测特征片段为192bp；
单增李斯特菌4b血清型上游引物：5’-TATCTTGCCTAAGTTCAG-3’，
单增李斯特菌4b血清型下游引物：5’-ATGCTCGTTTATCCTCTA-3’，
检测特征片段为254bp。
本发明所述的检测方法，包括对样品进行单增李斯特菌的选择性增菌培养，提取样品DNA，采用上述的特异性引物进行多重PCR扩增反应，并将获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，分析检测结果。
提取基因组DNA前，对样品进行选择性增菌培养，培养温度为37±1℃，培养时间为10h。所采用的培养基为改良李斯特菌增菌培养基，成分包括胰蛋白胨17.0g/L，多价蛋白胨3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸二氢钾1.4g/L，磷酸氢二钠12.0g/L，七叶苷1.0g/L，吖啶黄素0.02g/L，萘啶酮酸0.018g/L，氯化锂0.015g/L，丙酮酸钠0.7g/L。
吸取1.5mL增菌液进行DNA提取，基因组DNA提取方法为分子生物学领域常用方法，各种市售细菌基因组DNA提取试剂盒均可实现相同提取目的。
多重PCR反应体系为25μL，包括10×PCR Buffer2.5μL，MgCl22.5mM，dNTPMixture0.25mM，引物浓度为单增李斯特菌种引物0.4μM，1/2a、1/2b和4b血清型引物各0.8μM，1/2c血清型引物1.2μM，Taq酶2.5U，DNA模板2μL；多重PCR扩增反应条件为①94℃预变性5min，②94℃变性30s，③55℃退火30s，④72℃延伸40s，步骤②至④循环35次；⑤72℃终延伸10min，⑥4℃保存。
多重PCR扩增产物于2％琼脂糖凝胶电泳检测，分析结果，各特异性引物所得的扩增产物在对应位置产生相应大小的条带，则判定结果为阳性，反之判定为阴性。
有益效果
本发明适用于食品样品，尤其是果蔬制品、乳制品、肉类及海鲜类。与传统的血清凝集法相比，本发明所述的单增李斯特菌主要血清型多重PCR检测方法特异性好、灵敏度高、检测速度快、操作简便、成本低、结果清晰直观，可用于单增李斯特菌快速筛查血清型的检测鉴定。
试验60株菌株，李斯特菌属菌株共计42株，结果说明血清型检测多重PCR反应体系具有良好的特异性，各引物间也不存在交叉反应。
多重PCR检测人工污染样品，本发明体系检出阳性结果的时间在18h以内，与传统方法和PFGE法相比检测时间缩短了70％～90％。
使用本发明中的多重PCR检测方法进行市售样品检测340份不同来源的食品检测结果显示，血清型多重PCR检测体系的灵敏性为77.78％，特异性为98.72％，有效性为97.06％。与行业标准的凝集法相比，多重PCR检测法与凝集法具有良好的一致性。
附图说明
图1为实施例1中多重PCR反应体系检测单增李斯特菌主要血清型的电泳检测结果。图中，M：100bp ladder，CK：空白对照，泳道1为4种单增李斯特菌主要血清型菌株混合物，泳道2为单增李斯特菌FSIS 33777(血清型1/2a)，泳道3为单增李斯特菌FSIS 33873(血清型1/2b)，泳道4为单增李斯特菌FSIS 33734(血清型1/2c)，泳道5为单增李斯特菌LMB33426(血清型4b)。
图2为实施例1中多重PCR反应体系对基因组DNA检测限测定的试验结果。其中M：100bp ladder，CK：空白对照。其中泳道1～9为FSIS 33777基因组DNA浓度176.7ng/μL～1.767fg/μL。
图3为实施例1中多重PCR反应体系对基因组DNA检测限测定的试验结果。其中M：100bp ladder，CK：空白对照。其中泳道1～9为FSIS 33873基因组DNA浓度131.1ng/μL～1.311fg/μL。
图4为实施例1中多重PCR反应体系对基因组DNA检测限测定的试验结果。其中M：100bp ladder，CK：空白对照。其中泳道1～9为FSIS 33734基因组DNA浓度150.9ng/μL～1.509fg/μL。
图5为实施例1中多重PCR反应体系对基因组DNA检测限测定的试验结果。其中M：100bp ladder，CK：空白对照。其中泳道1～9为LMB33426基因组DNA浓度162.3ng/μL～1.623fg/μL。
图6为实施例1中多重PCR反应体系对基因组DNA检测限测定的试验结果。其中M：100bp ladder，CK：空白对照。其中泳道1～9为单增李斯特菌4种主要血清型菌株(FSIS33777、FSIS 33873、FSIS 33734和LMB33426)混合基因组DNA浓度604ng/μL～6.04fg/μL。
图7为实施例1中多重PCR反应体系对纯菌培养物检测限测定的试验结果。其中M：100bp ladder，CK：空白对照。其中泳道1～9为FSIS 33777纯菌培养物浓度1.4×108CFU/mL～1.4×100CFU/mL。
图8为实施例1中多重PCR反应体系对纯菌培养物检测限测定的试验结果。其中M：100bp ladder，CK：空白对照。其中泳道1～9为FSIS 33873纯菌培养物浓度6.2×108CFU/mL～6.2×100CFU/mL。
图9为实施例1中多重PCR反应体系对纯菌培养物检测限测定的试验结果。其中M：100bp ladder，CK：空白对照。其中泳道1～9为FSIS 33734纯菌培养物浓度2.6×108CFU/mL～6×100CFU/mL。
图10为实施例1中多重PCR反应体系对纯菌培养物检测限测定的试验结果。其中M：100bp ladder，CK：空白对照。其中泳道1～9为LMB 33426纯菌培养物浓度3.1×108CFU/mL～3.1×100CFU/mL。
图11为实施例1中多重PCR反应体系对纯菌培养物检测限测定的试验结果。其中M：100bp ladder，CK：空白对照。其中泳道1～9为单增李斯特菌4种主要血清型菌株(FSIS33777、FSIS 33873、FSIS 33734和LMB33426)混合纯菌培养物浓度1.17×108CFU/mL～1.17×100CFU/mL。
图12为实施例1中多重PCR反应的抗干扰性试验的检测结果。其中M：100bpladder。图12A,E：干扰菌为单增李斯特菌3a血清型，目标菌分别为1/2a血清型和4种血清型混合菌。
图12B,F：干扰菌为单增李斯特菌3b血清型，目标菌分别为1/2b血清型和4种血清型混合菌。
图12C,G：干扰菌为单增李斯特菌3c血清型，目标菌分别为1/2c血清型和4种血清型混合菌。
图12D,H：干扰菌为单增李斯特菌4e血清型，目标菌分别为4b血清型和4种血清型混合菌。
泳道1～5为目的菌与干扰菌的混合比例1:0，1:1，1:10，1:103，1:105。
具体实施方式
下面通过实施例和附图的方式来说明和解释本发明，但本发明并不只是限制在所述的实施例范围。本实例中，所有引物均交付上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所使用的DNA标准分子量100bp ladder购置广州东盛生物科技有限公司。
实施例1：对单增李斯特菌4种主要血清型的检测
(1)采用本发明的5对多重PCR检测引物Lm、m2a、m2b、m2c和m4b对单增李斯特菌4种主要血清型菌株进行PCR检测。
所用引物对的序列如下：
LmF：5’-GCTCAGCGGCAAATCAAAC-3’(SEQ ID NO.1)；
LmR：5’-GGCACTCGCAACAGAAACG-3’(SEQ ID NO.2)；
m2aF：5’-GGAGGAGAGTTTATTGACAAATCAGTAT-3’(SEQ ID NO.3)；
m2aR：5’-TTCACCATTTCTCTTTCTTAGTTCATAG-3’(SEQ ID NO.4)；
m2bF：5’-CAACTGGAGGCTTCTTAG-3’(SEQ ID NO.5)；
m2bR：5’-TGAATAACTCTTCTTGTCTGT-3’(SEQ ID NO.6)；
m2cF：5’-AAGCAACAAAGCAGCCTATT-3’(SEQ ID NO.7)；
m2cR：5’-TCTTTCGCTTTAAGGATTGA-3’(SEQ ID NO.8)；
m4bF：5’-TATCTTGCCTAAGTTCAG-3’(SEQ ID NO.9)；
m4bR：5’-ATGCTCGTTTATCCTCTA-3’(SEQ ID NO.10)。
所对应的PCR扩增产物大小依次为386bp、510bp、305bp、192bp、254bp。所述引物序列及PCR扩增产物大小如表1所示。
表1单增李斯特菌血清型多重PCR检测体系的引物
Figure BDA0001487925870000041
Figure BDA0001487925870000051
本发明所建立的PCR检测方法如下：
在PCR反应管中依次加入2.5μL10×PCR Buffer，2.5mMMgCl2，0.25mMdNTPMixture，引物浓度为单增李斯特菌种引物0.4μM，1/2a、1/2b和4b血清型引物各0.8μM，1/2c血清型引物1.2μM，Taq酶2.5U，DNA模板2μL，其余以双蒸水补齐，总体积为25μL，并设置空白对照。将PCR反应管放入离心机离心混匀反应体系后，放入PCR仪，按照如下条件进行反应：①94℃预变性5min，②94℃变性30s，③55℃退火30s，④72℃延伸40s，步骤②至④循环35次；⑤72℃终延伸10min，⑥4℃保存。PCR扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳检测。图1即为多重PCR反应的检测结果，各泳道所产生的条带大小与引物目标产物一致，清晰可见。
(2)特异性评价试验
将36株单增李斯特菌和24株非单增李斯特菌，在37℃温度下，180rpm过夜培养；取1.5mL菌液于离心管中，按照常规的基因组提取方法提取并纯化基因组DNA；基因组DNA放置于-20℃备用。本发明所涉及的菌株均可以通过公开途径获得。
将提取的基因组DNA稀释至10ng/μL后各取1μL作为模板进行多重PCR反应。反应完毕之后，2％琼脂糖凝胶电泳检测多重PCR扩增产物，多重PCR检测结果见表2。
表2中共涉及60株菌株，李斯特菌属菌株共计42株，其中，单增李斯特菌36株，英诺克李斯特菌2株，伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、斯氏李斯特菌和威氏李斯特菌各1株。李斯特菌属外共18株菌株，其中，沙门氏菌属6株，克诺罗杆菌属6株，大肠杆菌1株，耶尔森氏菌1株，志贺氏菌1株，金黄色葡萄球菌1株，荧光假单胞菌1株，副溶血弧菌1株。表2为特异性评价试验的PCR结果，结果表明引物Lm仅对36株单增李斯特菌菌株(包括13个血清型)呈阳性，而对其余24株非单增李斯特菌菌株无阳性扩增条带出现。引物m2a对10株单增李斯特菌1/2a血清型菌株均能扩增出目标条带，而其他血清型菌株，尤其是与该血清型进化亲缘关系相近的3a血清型菌株无扩增反应；引物m2b、m2c和m4b分别仅对各自对应血清型的单增李斯特菌菌株有特异性扩增条带，而各自血清群中相似血清型菌株仅扩增种引物条带，以上结果说明血清型检测多重PCR反应体系具有良好的特异性，各引物间也不存在交叉反应。
表1多重PCR反应特异性评价实验采用的菌株及检测结果
Figure BDA0001487925870000052
Figure BDA0001487925870000061
Figure BDA0001487925870000071
表1中+表示PCR结果为阳性；－表示PCR结果为阴性
(3)检测限测定试验
A、基因组DNA的检测限
以4种单增李斯特菌血清型菌株的基因组DNA为模板来测定多重PCR反应体系的检测限。分别将4种单增李斯特菌菌株(菌株编号为FSIS 33777，FSIS 33873，FSIS 33734和LMB 33426)的基因组DNA连续10倍梯度稀释，取各稀释度的DNA作为模板，进行多重PCR反应，检测结果见图2～图6。多重PCR检测对1/2a血清型、1/2b血清型、1/2c血清型、4b血清型和4种血清型混合菌株基因组DNA的检测限分别为176.7fg/μL、13.11fg/μL、15.09fg/μL、162.3fg/μL和6.04pg/μL。
B、纯菌培养物的检测限
分别取单增李斯特菌1/2a血清型菌株FSIS 33777、1/2b血清型菌株FSIS 33873、1/2c血清型菌株FSIS 33734和4b血清型菌株LMB 33426的过夜培养物，以无菌生理盐水进行10倍梯度稀释。取各稀释度的菌液混合物作为模板，进行多重PCR反应，检测结果见图7～11。多重PCR检测对1/2a血清型、1/2b血清型、1/2c血清型、4b血清型和4种血清型混合菌株纯菌培养物的检测限分别为1.4×103CFU/mL、6.2×102CFU/mL、2.6×103CFU/mL、3.1×103CFU/mL和1.17×104CFU/mL。
(4)抗干扰试验
单增李斯特菌主要血清型1/2b和4b、1/2a和1/2c分别属于谱系Ⅰ群、Ⅱ群，选取相应进化谱系的其他单增李斯特菌血清型3b、4e、3a和3c菌株作为干扰菌。分别取目的菌和干扰菌的过夜培养物，以生理盐水连续10倍梯度稀释，其中干扰菌的菌液细胞浓度调整至N×104～N×109CFU/mL，4种单增李斯特菌血清型菌株的菌液浓度为N×104CFU/mL。然后将单增李斯特菌目标血清型菌液分别与干扰血清型菌株，按照1:1,1:10,1:103和1:105的比例混合，提取基因组DNA作为模板，进行PCR验证，检测结果如图12A～图12H所示。电泳结果显示，当4种单增李斯特菌血清型菌株分别与不同浓度的各自对应的干扰菌混合时，多重PCR反应体系内种引物和目标血清型引物均能扩增出2条片段大小正确、清晰的目标条带；而不同比例的干扰菌与目的菌株混合物混合时，该多重PCR反应体系的扩增结果中5个目的条带均存在。不同比例的干扰血清型菌株与单增李斯特菌目的血清型菌株混合，均对此多重PCR反应体系的检测结果无影响，说明本实验建立的多重PCR反应体系的抗干扰性良好。
实例2多重PCR检测人工污染样品
待接种的不同单增李斯特菌血清型菌株以生理盐水10倍梯度稀释，每10mL牛奶样品接入1mL稀释菌液，人工污染牛奶样品中的单增李斯特菌初始浓度通过平板计数法测定。接种好的人工污染样品转接到90mL改良增菌培养基mLEM(即为改良李斯特菌增菌培养基，成分包括胰蛋白胨17.0g/L，多价蛋白胨3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸二氢钾1.4g/L，磷酸氢二钠12.0g/L，七叶苷1.0g/L，吖啶黄素0.02g/L，萘啶酮酸0.018g/L，氯化锂0.015g/L，丙酮酸钠0.7g/L，蒸馏水1000mL)中，37℃增菌培养，于4h、6h、8h、10h和12h取样1mL，采用热裂解法提取基因组DNA，然后进行PCR反应，通过电泳结果判断多重PCR体系对不同增菌时间及不同接种水平下人工污染样品的检测效果，检测结果如表3所示。在模拟实际样品的人工污染试验中，验证不同污染水平下单增李斯特菌的检测时效，经过8～12h增菌，该体系即可检出牛奶中N×100CFU/10mL污染量的单增李斯特菌，其中血清型1/2b检测速度最快，血清型4b最慢，该体系检出阳性结果的时间在18h以内，与传统方法和PFGE法相比检测时间缩短了70％～90％。
表3单增李斯特菌主要血清型菌株的人工污染牛奶样品的多重PCR检测
Figure BDA0001487925870000081
Figure BDA0001487925870000091
实例3使用本发明中的多重PCR检测方法进行市售样品检测
340份不同来源的食品，分为四大类。样品通过从包装和散装产品中随机采样，取样后保存在冰袋中，1小时内转移至实验室进行分析。称取25g或25mL样品，加入225mL改良培养基mLEM，37±1℃培养10h。取1.5mL增菌液，采用试剂盒法提取细菌基因组DNA，然后进行多重PCR检测，同时以行业标准SN/T 2521-2010单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法检测同一样品作为对照试验。检测结果见表4。结果显示，31个样品呈现单增李斯特菌阳性，检出率为9.1％。在被检出的单增李斯特菌中，11株分离株为单增李斯特菌1/2a血清型，检出率为3.2％，5株分离株为单增李斯特菌1/2b血清型，检出率为1.5％，8株分离株为单增李斯特菌1/2c血清型，检出率为2.4％，9株分离株为单增李斯特菌4b血清型，检出率为2.6％，有6株分离株仅证实为单增李斯特菌种，无法鉴定到血清型。
表4本发明中多重PCR检测方法对市售样品的检测结果
Figure BDA0001487925870000092
其中，a为1/2a血清型阳性，b为1/2b血清型阳性，c为1/2c血清型阳性，d为4b血清型阳性，e为单增李斯特菌检出，血清型未知。
多重PCR反应体系及SN/T 2521-2010行业标准对食品中单增李斯特菌血清型的检测结果分析见表5。结果显示，血清型多重PCR检测体系的灵敏性为77.78％，特异性为98.72％，有效性为97.06％。与行业标准的凝集法相比，认定凝集法的检测结果为真实的，在340份被检样品中，多重PCR检测结果显示出7个假阳性样品(凝集法结果为阴性，未出现凝集，而多重PCR检测结果为多重血清型混合的样品)和6个假阴性样品(凝集法为阳性，多重PCR检测结果为其他血清型污染的样品)。其经过公式计算，κ系数为0.79，说明多重PCR检测法与凝集法具有良好的一致性。
表5多重PCR法和血清凝集法对不同来源的市售食品检测结果的比较分析
Figure BDA0001487925870000101
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR检测引物及方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(19)
<400> 1
gctcagcggc aaatcaaac 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(19)
<400> 2
ggcactcgca acagaaacg 19
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(28)
<400> 3
ggaggagagt ttattgacaa atcagtat 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(28)
<400> 4
ttcaccattt ctctttctta gttcatag 28
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(18)
<400> 5
caactggagg cttcttag 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(21)
<400> 6
tgaataactc ttcttgtctg t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(20)
<400> 7
aagcaacaaa gcagcctatt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(20)
<400> 8
tctttcgctt taaggattga 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(18)
<400> 9
tatcttgcct aagttcag 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(18)
<400> 10
atgctcgttt atcctcta 18

Claims (5)

1.鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR检测引物，其特征在于，所述引物为：
单增李斯特菌种上游引物：5’-GCTCAGCGGCAAATCAAAC -3’，
单增李斯特菌种下游引物：5’-GGCACTCGCAACAGAAACG -3’，
检测特征片段为386bp和
单增李斯特菌1/2a血清型上游引物：5’-GGAGGAGAGTTTATTGACAAATCAGTAT -3’，
单增李斯特菌1/2a血清型下游引物：5’-TTCACCATTTCTCTTTCTTAGTTCATAG -3’，
检测特征片段为510bp和
单增李斯特菌1/2b血清型上游引物：5’- CAACTGGAGGCTTCTTAG -3’，
单增李斯特菌1/2b血清型下游引物：5’-TGAATAACTCTTCTTGTCTGT -3’，
检测特征片段为305bp和
单增李斯特菌1/2c血清型上游引物：5’-AAGCAACAAAGCAGCCTATT -3’，
单增李斯特菌1/2c血清型下游引物：5’- TCTTTCGCTTTAAGGATTGA -3’，
检测特征片段为192bp和
单增李斯特菌4b血清型上游引物：5’- TATCTTGCCTAAGTTCAG -3’，
单增李斯特菌4b血清型下游引物：5’- ATGCTCGTTTATCCTCTA -3’，
检测特征片段为254bp。
2.权利要求1所述多重PCR检测用引物在鉴定单增李斯特菌主要血清型方面的非诊断性应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，对样品进行单增李斯特菌的选择性增菌培养，提取样品DNA，采用权利要求1所述的单增李斯特菌种上下游引物、1/2a血清型上下游引物、1/2b血清型上下游引物、1/2c血清型上下游引物和4b血清型上下游引物，以样品单增李斯特菌DNA为模板进行多重PCR扩增反应，并将获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，分析检测结果。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的单增李斯特菌选择性增菌培养过程中，所采用的培养基为改良李斯特菌增菌培养基，成分包括胰蛋白胨17.0 g/L，多价蛋白胨3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，磷酸二氢钾1.4 g/L，磷酸氢二钠12.0 g/L，七叶苷1.0 g/L，吖啶黄素0.02 g/L，萘啶酮酸0.018 g/L，氯化锂0.015 g/L，丙酮酸钠0.7 g/L，蒸馏水1000 mL。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，多重PCR反应体系为25 μL，包括10×PCR Buffer2.5μL，MgCl22.5 mM，dNTP Mixture0.25 mM，引物浓度为单增李斯特菌种引物0.4 μM，1/2a、1/2b和4b血清型引物各0.8μM，1/2c血清型引物1.2μM，Taq酶2.5U，DNA模板2μL；多重PCR扩增反应条件为①94 °C预变性5 min，②94 °C变性30 s，③55 °C退火30s，④72°C延伸40s，步骤②至④循环35次；⑤72°C终延伸10min，⑥4°C保存。
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