CN104726550A - 一种检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的试剂盒 - Google Patents

一种检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了快速准确检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的方法。本发明针对金黄色葡萄球菌高度保守序列设计和优化了一对特异性引物，采用荧光定量PCR对待测样品进行检测，确认待测样品是否被金黄色葡萄球菌污染。在进行qPCR检测前，本发明采用叠氮溴化丙锭对食品中金黄色葡萄球菌进行处理。本发明的有益效果主要体现在：检测特异性好，qPCR能对靶细菌进行定量检测；PMA的使用消除了检测的假阳性结果；避免了杂菌的干扰，可直接用于自然条件下食品样品的检测；可用于基层医疗卫生单位、食品企业和各疾病预防控制中心筛查和检测，具有较大的经济、社会效益。

Description

一种检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种快速选择性检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的试剂盒及检测方法。
技术背景
金黄色葡萄球菌是一种需氧或兼性厌氧的革兰氏阳性菌，在空气、土壤、水、灰尘和食品中分布广泛。奶类、肉类、鱼及其制品等更是金黄色葡萄球菌污染的主要对象，当误食该菌数量达到105~106 CFU/g时可引起食物中毒，造成急性肠胃炎，主要症状表现为呕吐。据美国疾病控制中心报告，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒严重程度仅次于大肠杆菌，占细菌性食物中毒的33%，而在加拿大高达45%。美国每年由金黄色葡萄球菌引起的住院病例平均为292000例，日本的调查结果也表明平均32.5%的食品存在金黄色葡萄球菌的污染。我国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也比较严重，全国各地均有报道，排在细菌性食物中毒的第四位。
目前金黄色葡萄球菌的检测方法仍然是传统培养法。传统方法具有劳动强度高、耗时、费用高等缺点，且特异性差，报告检测结果大约需要4-7天，已不能满足微生物快速准确检测的现实需要。因此，迫切需要建立新的快速、准确检测技术和方法。
近年来，免疫学、分子生物学等方法的应用使金黄色葡萄球菌的检测有了长足的发展。但是，如ELISA和免疫荧光法等免疫学方法在操作程序及特异性方面还不理想；基于PCR技术的分子生物学方法以其特异、快速等优势而被广泛应用，然而普通PCR方法容易造成假阳性检测结果，并且难以对实际污染浓度进行定量。因此，开发准确且能定量检测金黄色葡萄球菌的方法至关重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种食品中金黄色葡萄球菌活细胞检测试剂盒及检测方法，可实现对金黄色葡萄球菌活细胞快速、准确、特异检测。
本发明通过以下技术方案实现上述目的。
一种运用PMA-qPCR选择性检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的试剂盒，主要包括金黄色葡萄球菌阳性对照品、阴性对照品、DNA荧光染料、DNA聚合酶、PCR反应液和PMA溶液的六个离心管；所述PCR反应液含有PCR缓冲液、dNTP，还含有金黄色葡萄球菌特异性上游引物、下游引物，所述引物序列如下：
上游引物: 5’-CGATTGATGGTGATACGGTT-3’
下游引物: 5’-GCACTTGCTTCAGGACCAT-3’；
所述金黄色葡萄球菌阳性对照品为金黄色葡萄球菌重组质粒DNA标准品，序列如下：cgattgatggtgatacggttaaattaatgtacaaaggtca aacaatgacattcagactattattggttgatacacctgaaacaaagcatcctaaaaaaggtgtagagaaatatggtcctgaagcaagtgc。
1、根据编码金黄色葡萄球菌编码耐热核酸酶的nuc基因（GenBank：DQ507382.1）设计并合成特异性引物，其序列如下：
上游引物: 5’-CGATTGATGGTGATACGGTT-3’；
下游引物: 5’-GCACTTGCTTCAGGACCAT-3’。
2、PMA处理待测样品：用终质量浓度为5 μg/mL的PMA和待测样混匀后室温避光5 min，每隔30 s摇匀一次，卤素灯曝光5 min，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用热裂解煮沸法提取待测样品DNA。
3、阳性标准品即阳性对照的制备：上述引物的PCR阳性产物经2%琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带并回收纯化，将产物连接到T载体上构建成质粒。提取阳性克隆质粒，稀释到适当的浓度即作为阳性标准品。
4、标准曲线的制备：为了达到定量检测的效果，将上述阳性质粒5 μL，按10倍梯度稀释，依次稀释5-7个梯度。以梯度阳性标准品及PMA处理后的待测样DNA在相同条件下进行qPCR反应，以标准品浓度的对数值为横坐标，循环数（Ct值）为纵坐标绘制标准曲线。根据待测样测得的Ct值，对照标准曲线，获得待测样中金黄色葡萄球菌活细胞的准确浓度。
本发明的另一个目的在于提供一种检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的方法，其步骤如下：
（1）取食品样品，加无菌1×PBS缓冲液研磨成混合物，离心除去大的食物残渣，取上清得到菌悬液，整个过程均为无菌操作。
（2）取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙锭溶液，使叠氮溴化丙锭PMA的终质量浓度为5 μg/mL，混匀后室温避光5 min，每隔30 s摇匀一次，卤素灯曝光5 min，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用热裂解煮沸法提取待测样品DNA；
（3）取DNA荧光染料、DNA聚合酶和PCR反应液混合，分别加入PMA处理过的待测样品DNA或者阴性对照品配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应，反应管置于ABI 7900HT荧光定量PCR仪进行荧光检测；
所述PCR反应液含有特异性上游引物、下游引物，所述引物序列如下：
上游引物: 5’-CGATTGATGGTGATACGGTT-3’
下游引物: 5’-GCACTTGCTTCAGGACCAT-3’
（4）设定阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，而且Ct值少于35，则判断为金黄色葡萄球菌阳性，即样本中存在金黄色葡萄球菌活细胞。
所述步骤（3）中qPCR反应体系为：2 μL的DNA荧光染料、2.5 μL PCR缓冲液、上、下游引物各0.8 μL、0.2 μL的DNA聚合酶、2.0 μL的dNTPs、2 μL的模板，双蒸水补齐20 μL。
所述步骤（3）中qPCR反应体系为：95℃预变性30 s、95℃变性5 s、58℃退火1 min，40个循环。
发明建立了利用qPCR技术融合核酸交联剂特性的方法，检测了食品中金黄色葡萄球菌活细胞，并经检测实际样本，表明该方法切实可行。由于本方法使用了能选择性透过死细胞细胞膜并与DNA交联的PMA，使得检测的准确性大大提高，消除了由于死细胞导致的假阳性结果；由于使用了ABI 7900HT实时荧光定量PCR，使得目的菌的检测灵敏性更高，而且可以对食品中金黄色葡萄球菌活细胞做到精确定量。
综上所述，本发明可以快速、准确、高特异地检测食品中的金黄色葡萄球菌活细胞，不需要复杂的仪器，为金黄色葡萄球菌活细胞的检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位、食品企业和各疾病预防控制中心筛查和检测，具有较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
1、能特异性检测金黄色葡萄球菌，速度快，可以在4小时内得到结果；
2、只检测具有致病性的活菌，消除假阳性结果，且能定量检测；
3、食品基质和其他杂菌等原因没有对检测造成影响；
4、本发明涉及的特异性引物，灵敏度高，高效地检测目的菌，操作简便，结果判定简单，降低了检测成本。
附图说明
图1 PMA处理的死细胞和活细胞的PCR扩增效果。M：DL2000 DNA Marker；Ⅱ~Ⅸ泳道为PMA处理死细胞后的扩增情况，2~9泳道为PMA处理活细胞后的扩增情况，浓度均为1.5 × 108 ~1.5 × 101 CFU/mL；Ⅰ和1泳道为阴性对照；
图2 实时荧光定量PCR标准曲线及扩增效率。标准曲线为Y=-3.282X+45.032，R2=0.9935；Y：循环数，X：细胞的浓度；扩增效率通过方程式E =10-1/斜率-1计算得到101.7%，在正常范围（85～110%）之内。
图3 PMA-qPCR检测方法在杂菌存在条件下的应用，杂菌存在组和不存在组无差异。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进一步阐释，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件是实验方法，通常按照常规条件中的条件，按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可很容易地从公开商业渠道获得。
实施例
1.引物设计及特异性的验证
将编码金黄色葡萄球菌耐热核酸酶的特异性基因nuc的序列输入到引物设计软件Oligo7中，设置GC%范围为40～60%，扩增产物长度在80～150 bp之间，退火温度在57～62℃之间，从备选引物中选择出最优引物（引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成），序列如下：
上游引物: 5’-CGATTGATGGTGATACGGTT-3’
下游引物: 5’-GCACTTGCTTCAGGACCAT-3’
摸索PCR反应的最适温度和循环数，最终得出最有条件为：最适温度58℃，反应循环数是40。选取最优的条件并采用表1提供的菌株对引物特异性进行验证，菌株的编号和来源见表1。
表1 供试菌株及检测结果（+表示阳性，-表示阴性）
a CMCC，中国药物菌种保藏中心，中国；
b JX-CDC，江西省疾病预防与控制中心，中国；
c ATCC，美国典型菌种保藏中心，美国；
d NCTC，国家典型菌种保藏中心，英国。
2. PMA处理死细胞和活细胞的比较
取LB培养基纯培养的金黄色葡萄球菌（编号CMCC26001）两管，各1 mL，分为死细胞组和活细胞组，9000 g离心5 min，弃上清，沉淀用无菌1×PBS（pH7.4，实验室自配）重悬；十倍梯度稀释后菌液浓度分别为1.5 × 108 ~1.5 × 101 CFU/mL；死细胞组80℃水浴处理20 min，细胞死亡。两组菌液经PMA处理并热裂解煮沸法提基因组DNA后进行PCR扩增。
普通PCR的10 μL体系包含5 μL 2 × Taq MasterMix (Takara)，上、下游引物浓度各0.2 μL，2 μL制备的模板DNA溶液，补加2.6 μL去离子水。反应条件为95℃ 10 min，接着40个循环（94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s），最后72℃延伸10 min。反应结束后，用枪头吸取5 μL反应液，加到1.5%琼脂糖凝胶的上样孔里，85 V电泳30 min，取出凝胶块，在紫外成像系统中观察电泳条带，并拍照记录（如图1）。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若活细胞用PMA处理后有130 bp条带，而死细胞经PMA处理后均没有特异性条带，则指示PMA消除了死细胞DNA的扩增信号，可以用PMA做下一步实验。
3. PMA-qPCR对死细胞和活细胞的定量检测
取食品样品香肠、鱼肉和鸡肉（无菌状态）各1 g，均取三组（分为活细胞组、死细胞组和PMA处理的死细胞组），各加无菌1×PBS缓冲液9 mL研磨成混合物，每种食品分别接种金黄色葡萄球菌的浓度为105 CFU/g（高于此浓度易造成中毒）。900 g离心2 min除去大的食物残渣，取上清得到菌悬液，整个过程均为无菌操作。其中一组死细胞用终质量浓度为5 μg/mL的PMA溶液按照本发明试剂盒要求处理。取三组的菌液400 μL，10000 g离心3min，弃上清，加等体积的1×PBS，10000 g离心3min，倒去上清，加等体积的双蒸水，混匀，煮沸10 min，10000 g离心3min，上清即为基因组DNA。PMA-qPCR定量检测结果详见表2。
表2 PMA-qPCR定量检测结果
ND：未检出。
4. 杂菌污染食品的预处理
取食品样品香肠、鱼肉和鸡肉（无菌状态）各1 g，均取6份，各加无菌1×PBS缓冲液9 mL研磨成混合物，再进行人工污染，A组接种金黄色葡萄球菌的浓度为107 CFU/g，B组接106 CFU/g，C组接105 CFU/g，三组均含有对照组和实验组，实验组再接种杂菌蜡样芽孢杆菌JDZ102Y（杂菌1）、肠炎沙门氏菌ATCC13076（杂菌2），浓度均为1.0 × 105 CFU/g，对照组不接种杂菌。具体人工污染情况详见表3。
表3 人工污染情况（+表示实验组接种，-表示对照组不接种）
取1 mL混合物900 g离心2 min除去大的食物残渣，取上清得到菌悬液，整个过程均为无菌操作。取400 μL制备好的菌悬液用终质量浓度为5 μg/mL叠氮溴化丙锭溶液按照本发明试剂盒要求处理。处理后按上述方法提基因组DNA。PMA-qPCR检测结果发现实验组和对照组无显著差异，表明杂菌的存在不干扰对目标菌的检测，详见图3，图3A为香肠样品，图3B为鱼肉样品，图3C为鸡肉样品。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  南昌大学
 
<120>  一种检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的试剂盒
 
<130>  2014
 
<160>  9    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
cgattgatgg tgatacggtt                                                 20
 
 
<210>  2
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
gcacttgctt caggaccat                                                  19
 
 
<210>  3
<211>  130
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
cgattgatgg tgatacggtt aaattaatgt acaaaggtca aacaatgaca ttcagactat     60
 
tattggttga tacacctgaa acaaagcatc ctaaaaaagg tgtagagaaa tatggtcctg    120
 
aagcaagtgc                                                           130
 
 
<210>  4
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
cgattgatgg tgatacggtt                                                 20
 
 
<210>  5
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
gcacttgctt caggaccat                                                  19
 
 
<210>  6
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
cgattgatgg tgatacggtt                                                 20
 
 
<210>  7
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  7
gcacttgctt caggaccat                                                  19
 
 
<210>  8
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  8
cgattgatgg tgatacggtt                                                 20
 
 
<210>  9
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  9
gcacttgctt caggaccat                                                  19
 
 

Claims (5)

1. 一种运用PMA-qPCR选择性检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的试剂盒，包括金黄色葡萄球菌阳性对照品、阴性对照品、DNA荧光染料、DNA聚合酶、PCR反应液和叠氮溴化丙锭（PMA）溶液的六个离心管，所述PCR反应液含有PCR缓冲液、dNTP，还含有金黄色葡萄球菌特异性上游引物、下游引物，所述引物序列如下：
上游引物: 5’-CGATTGATGGTGATACGGTT-3’
下游引物: 5’-GCACTTGCTTCAGGACCAT-3’；
所述金黄色葡萄球菌阳性对照品为金黄色葡萄球菌重组质粒DNA标准品，序列如下：cgattgatggtgatacggttaaattaatgtacaaaggtca aacaatgacattcagactattattggttgatacacctgaaacaaagcatcctaaaaaaggtgtagagaaatatggtcctgaagcaagtgc。
2. 一种运用权利要求1所述试剂盒选择性检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）取食品样品，加无菌1×PBS缓冲液研磨成混合物，离心除去大的食物残渣，取上清得到菌悬液，整个过程均为无菌操作；
（2）取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙锭溶液，使叠氮溴化丙锭PMA的终质量浓度为5 μg/mL，混匀后室温避光5 min，每隔30 s摇匀一次，卤素灯曝光5 min，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用热裂解煮沸法提取待测样品DNA；
（3）取DNA荧光染料、DNA聚合酶和PCR反应液混合，分别加入待测样品DNA或者阴性对照品配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应，反应管置于ABI 7900HT荧光定量PCR仪进行荧光检测；
其特征在于，所述PCR反应液含有特异性上游引物、下游引物，所述引物序列如下：
上游引物: 5’-CGATTGATGGTGATACGGTT-3’
下游引物: 5’-GCACTTGCTTCAGGACCAT-3’
（4）设定阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，而且Ct值少于35，则判断为金黄色葡萄球菌阳性，即样本中存在金黄色葡萄球菌。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法同时以梯度浓度的重组质粒DNA标准品在与待测样品DNA相同条件下进行qPCR扩增反应，以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据待测样品测得的Ct值，对照标准曲线，获得待测样品中金黄色葡萄球菌的准确浓度；所述DNA标准品序列如下：cgattgatggtgatacggttaaattaatgtacaaaggtcaaacaatgacattcagactattattggttgatacacctgaaacaaagcatcctaaaaaaggtgtagagaaatatggtcctgaagcaagtgc。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述PMA溶液配制方法为1mg PMA溶解于20%的二甲亚砜中，配制成1 mg/mL的PMA储备液，-20℃避光保存。
5. 如权利要求2所述的方法，其特征步骤在于：步骤（3）所述PCR反应体系为：2 μL的DNA荧光染料、1×PCR缓冲液、0.3～0.5 μM的引物、1～5U的DNA聚合酶、0.2～0.5 mM的dNTPs，通常取2 μL的模板；反应体系为：95℃预变性30 s、95℃变性5 s、58℃退火1 min，40个循环。
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