CN113373249B

CN113373249B - 用于筛查黄杆菌属的分子靶标及其定量检测方法

Info

Publication number: CN113373249B
Application number: CN202110742534.1A
Authority: CN
Inventors: 吴清平; 周宝青; 叶青华; 刘振杰; 李凡; 尚玉婷; 相欣然; 王楚芳; 张菊梅; 丁郁; 陈谋通; 薛亮; 王涓; 吴诗; 曾海燕; 蔡淑珍; 万强
Original assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN113373249A

Abstract

本发明提供了用于筛查黄杆菌属的分子靶标，所述分子靶标为核苷酸片段，所述核苷酸片段的序列如SEQ ID NO：1所示，还提供了用于检测所述分子靶标的一对引物，以及对应的PCR检测方法。本发明的检测方法可检测到更多的黄杆菌属，覆盖率更大，增强了实用性；本发明的检测方法针对黄杆菌检测具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本低、稳定性好的优点。

Description

用于筛查黄杆菌属的分子靶标及其定量检测方法

技术领域

本发明属于微生物检验技术领域，涉及鉴别黄杆菌属的方法，具体涉及一种用于筛查黄杆菌属的分子靶标及其定量检测方法。

背景技术

黄杆菌属于黄杆菌科，是一类革兰氏阴性杆菌，菌体呈长弯状、无动力、无荚膜、无芽胞。常见黄杆菌包括：柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)、水生黄杆菌(Flavobacterium hydatis)、水栖黄杆菌(Flavobacterium aquatile)、沙上黄杆菌(Flavobacterium sasangense)、琥珀酸黄杆菌(Flavobacterium succinicans)、中华耐冷黄杆菌(Flavobacteriumsinopsychrotolerans)、脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningitidis)、短黄杆菌(Flavobacterium breve)、嗜盐黄杆菌(Flavobacterium halophilus)、嗜冷黄杆菌(Flavobacterium psychrophilum)。黄杆菌属广泛存在于水体、土壤中，与假单胞菌属、微球菌属、产碱菌属、乳杆菌属、芽袍杆菌属、梭状芽抱杆菌属、肠球菌属、大肠埃希氏菌属、变形杆菌属以及霉菌和酵母菌等共作为食品优势腐败菌，其主要污染食品为鱼及鱼肉制品，市售蔬菜、生肉、乳制品也有检出。黄杆菌腐败食品引起色、香、味等感官性状变化，破坏食物的营养组分，也可能产生有毒性的多种代谢产物，影响食品安全质量。黄杆菌属是一类条件致病菌，感染脑黄杆菌后，轻则引发呕吐、腹胀、发热，重则导致脑膜炎、肺炎、败血症等疾病，一般感染人群为婴儿、老人及免疫力低患者。有研究报道，在对某医院18271份各种临床标本中分离鉴定，分离得到黄杆菌370株，分离率为2.03％，其中脑膜炎脓毒性黄杆菌占比最大。通过临床耐药实验分析发现，分离出的黄杆菌属对多种常用的抗菌药物表现出较高的耐药性,其中对青霉素类、氨基糖甙类、喹诺酮类及碳青霉烯类(亚胺培南)抗菌药物的耐药率在50％以上。此外，黄杆菌是公认的水产类重要致病菌，在水产养殖业中，鱼类(海水鱼、淡水鱼)感染黄杆菌属(主要是柱状黄杆菌)后易导致柱形病，表现为鱼烂鳃、烂尾以及内脏充血等症状，感染过程中可产生溶血素等毒力因子，严重危害机体健康。因此，在食品安全、水产养殖及临床治疗过程中，精确定量黄杆菌从而预防其污染尤为重要。

黄杆菌属的检测主要利用传统分离培养法，根据《SN/T 4827-2017》技术标准中操作进行实验，该方法操作繁琐、费时费力。随着分子生物学的发展，以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代常用黄杆菌属检测方法最具潜力的技术之一，其中最常用定量检测方法为qPCR技术。特异性分子检测靶标是保证PCR方法特异性、灵敏度的关键。目前，国内外PCR检测方法只报道针对黄杆菌属内检测的分子检测靶标，如只针对柱状黄杆菌检测分子靶标有16S rRNA基因、cacL等；只针对嗜冷黄杆菌分子靶标16S rRNA基因、parE等，还未有针对黄杆菌属的分子检测靶标报道。而且黄杆菌污染过程中常常是属内多种病原菌共同参与，单独检测某一种黄杆菌对于预防其污染依然存在一定的困难。随着黄杆菌新种不断发现，基于现有黄杆菌种分子靶标的精准鉴定面临了巨大的挑战。因此，寻找新型特异性靶标分子用于黄杆菌属快速、精确定量具有重要意义。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了用于鉴别黄杆菌属包括柱状黄杆菌、约氏黄杆菌、水生黄杆菌、水栖黄杆菌、琥珀酸黄杆菌、中华耐冷黄杆菌、脑膜炎脓毒性黄杆菌、短黄杆菌、嗜盐黄杆菌、嗜冷黄杆菌等常见黄杆菌常见黄杆菌的特异性分子靶标及相应的定量检测方法。

本发明采取以下技术方案实现本发明的目的：

第一个方面：本发明提供了用于筛查黄杆菌属的分子靶标，所述分子靶标为核苷酸片段，所述核苷酸片段的序列如SEQ ID NO：1所示。通过泛基因组分析得到黄杆菌属中含有如SEQ ID NO：1所示的特异性序列片段，该片段均作为鉴别黄杆菌属的特异性分子靶标。

优选地，所述黄杆菌属包括柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)、水生黄杆菌(Flavobacterium hydatis)、水栖黄杆菌(Flavobacterium aquatile)、沙上黄杆菌(Flavobacterium sasangense)、琥珀酸黄杆菌(Flavobacterium succinicans)、中华耐冷黄杆菌(Flavobacteriumsinopsychrotolerans)、脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningitidis)、短黄杆菌(Flavobacterium breve)、嗜盐黄杆菌(Flavobacterium halophilus)、嗜冷黄杆菌(Flavobacterium psychrophilum)。

第二个方面：本发明提供了一组用于扩增上述分子靶标的一对引物，所述引物序列如SEQ ID NO：2～3所示。本发明设计了能够扩增上述分子靶标的引物，通过该引物可扩增出多种黄杆菌属的目的条带，且灵敏度为均为10³CFU/mL。

第三个方面：本发明提供了上述分子靶标或如上述引物在筛查或检测黄杆菌试剂中的应用。通过本发明的分子靶标和引物，能够精确的检测出多种不同的黄杆菌，特异性较好，精确度较高。

第四个方面：本发明提供了一种鉴定黄杆菌的方法，包括如下步骤：

S1使用如上所述的引物组对样品或待测菌的基因组DNA进行PCR扩增；

S2观察扩增产物是否出现目的条带，如果出现目的条带则判定该样品含有黄杆菌，或该待测菌株为黄杆菌。

本发明通过PCR反应，对分子靶标使用检测引物进行扩增，通过观察扩增产物是否在预期位置即可判断是否存在所述黄杆菌属。

优选地，所述PCR扩增体系为：PCR反应缓冲液、MgCl₂、dNTP、模板DNA、引物组、Tag酶和灭菌双蒸水。

优选地，所述PCR扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸45s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10min。

第五个方面：本发明提供了一种定量检测黄杆菌的方法，包括如下步骤：

S1使用上所述的引物组对待测样品的基因组DNA在Roche

96荧光定量扩增仪上进行qPCR扩增；

S2以标准品的菌株纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为黄杆菌属的标准曲线；

S3利用软件

96SW 1.1分析扩增结果，通过荧光信号值与标准曲线进行比对，确定待测样品中黄杆菌的含量。

本发明通过qPCR体系，对分子靶标使用检测引物进行扩增，通过判断体系中荧光信号强度定量检测体系中黄杆菌属浓度。

优选地，所述qPCR扩增体系为：2×TB Green Premix反应液10μL，模板DNA 100ng，10μmol/L引物各1μL，灭菌双蒸水补足体积至20μL。

优选地，所述qPCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，变性、退火共进行45个循环。

与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明提供了用于鉴别黄杆菌属(柱状黄杆菌、约氏黄杆菌、水生黄杆菌、水栖黄杆菌、沙上黄杆菌等)的特异性分子靶标，并提供了相关的引物，以及对应的PCR检测方法。本发明的检测方法有能力检测到更多的黄杆菌，黄杆菌属覆盖率更大，增强了实用性；本发明的检测方法针对黄杆菌检测具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本低、稳定性好的优点。

附图说明

图1为实施例2中黄杆菌PCR鉴定方法特异性评价电泳结果示意图。

图2为实施例5中黄杆菌纯培养液qPCR定量检测方法建立的结果示意图。

图3为实施例6中人工加标样本黄杆菌qPCR定量检测方法建立的结果示意图。

图4为实施例6中人工加标样本黄杆菌qPCR定量检测方法qPCR的实时Ct值示意图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1筛选获得黄杆菌属的特异性分子靶标

根据NCBI网站中271株黄杆菌和40株非黄杆菌基因组数据，进行泛基因组分析；筛选得到黄杆菌(柱状黄杆菌、约氏黄杆菌、水生黄杆菌、水栖黄杆菌、琥珀酸黄杆菌、中华耐冷黄杆菌、脑膜炎脓毒性黄杆菌、短黄杆菌、嗜盐黄杆菌、嗜冷黄杆菌等常见黄杆菌)的特异性基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

筛选所获得黄杆菌属的特异性分子靶标均来自柱状黄杆菌94-081，靶标基因片段序列对应基因位点如下表1。

表1黄杆菌属的特异性分子靶标基因组位点

实施例2鉴定黄杆菌的PCR方法

1)引物设计

根据实施例1中的所述序列SEQ ID NO：1设计特异性PCR扩增引物(包括正向引物和反向引物)，引物组序列如下表2。

表2特异性PCR检测引物组

2)鉴别黄杆菌属的方法，步骤如下：

S1 DNA模板制备：将待测菌株分别在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；

S2 PCR扩增：使用所述的引物组1对待测样品DNA进行PCR扩增

①PCR检测体系：

②PCR扩增程序：

S3：取PCR扩增产物进行凝胶电泳；

S4：观察各引物组对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带。如果存在，说明样品中含有黄杆菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有对应的黄杆菌。

实施例3黄杆菌PCR检测方法的特异性评价

取黄杆菌5株，非目标黄杆菌44株，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组1。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。

所用各细菌的菌株及检测结果如下表3所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图1所示；图中编号1～5为5种黄杆菌；编号6～49为非目标黄杆菌；M为2000Maker。

表3本发明黄杆菌属鉴定特异性评价试验结果

由图1和表3可得，引物组的检测结果均只有黄杆菌显示出特异性扩增条带，非目标黄杆菌株均无特异性条带，说明本发明鉴定方法特异性高。

实施例4鉴定黄杆菌的qPCR定量检测方法

1)引物设计

根据实施例1中的所述序列SEQ ID NO：1设计特异性qPCR扩增引物组(包括正向引物和反向引物)，引物序列同上表2。

2)鉴别黄杆菌属的方法，步骤如下：

S1 DNA模板制备：将黄杆菌属在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；

S2 PCR扩增：使用所述的引物组1对待测样品DNA进行PCR扩增

③qPCR检测体系：

④qPCR扩增程序：

S3：取qPCR扩增体系于Roche

96荧光定量扩增仪上进行；

S4：利用软件

96SW 1.1分析扩增结果是否符合预期。在空白对照不存在荧光信号前提下，如果产生荧光信号，说明样品中含有黄杆菌；如果不产生荧光信号，则样品中不含有对应的黄杆菌。

实施例5黄杆菌纯培养液qPCR定量检测方法灵敏度评价

将培养至浓度为10⁸CFU/mL的标准菌株约氏黄杆菌ATCC17061和水生黄杆菌ATCC29551菌株混合，使用去离子水按照10倍梯度稀释，得浓度为10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸CFU/mL的菌株纯培养物，按照实施例4进行DNA模板的提取，即为黄杆菌属qPCR的检测标准品，按照实施例4进行qPCR反应，每个模板分别进行三次平行实验。

绘制标准曲线：以标准品的菌株纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为黄杆菌属的标准曲线。

标准曲线如图2所示，本发明引物的检测限为10³CFU/mL，所述黄杆菌属的拟合标准曲线为y＝-3.5023x+41.653，相关系数R²为0.9995。

实施例6人工加标样本黄杆菌qPCR定量检测方法灵敏度评价

新鲜鱼肉采用酒精消毒后切除样品表层的方法制备无菌样品，经NA营养琼脂平板培养后结果显示处理后的新鲜鱼肉样品中无微生物存在，保证后续实验中鱼肉样品中的微生物均来源于人工污染。

NA计数平板结果显示人工污染样品的黄杆菌初始菌液浓度为3.3×10⁸CFU/mL。使用0.85％的无菌生理盐水对人工污染样品的均质液进行10倍梯度稀释，以制备含黄杆菌菌浓度为10²CFU/mL～10⁸CFU/mL的人工污染模拟样品。以各梯度均质液中提取的细菌基因组DNA为模板，以无菌蒸馏水为空白对照，按照实施例4进行qPCR反应，每个模板分别进行三次平行实验。按照实例5中曲线拟合方式建立对应的人工加标样本标准曲线。

标准曲线如图3所示，引物对1检测限为3.3×10⁴CFU/g，所述黄杆菌属的拟合标准曲线为y＝-3.5095x+42.903，相关系数R²为0.98276。

实施例6实际样本中黄杆菌qPCR定量检测结果

从广州当地三个超市及肉菜市场采集的鲜活鲈鱼、鲟鱼、鲳鱼、石斑鱼、草鱼5种鱼类样品装于无菌均质袋中运回实验室。在洁净工作台中，无菌操作下将鱼肉样品进一步分割称重，每个样品5组，每组2份，每份100g，共50份。然后分别用聚乙烯保鲜膜(其中，氧气透过率：18500cm3/(m2·24h·atm)，二氧化碳透过率：89500cm3/(m2·24h·atm)，透湿性：34.6/(m2·24h))进行包装，然后放于4℃冰箱储存9天，模拟鱼肉储存环境。为了保证检测结果的客观性及准确性，随机选取鲳鱼样品10份，按照实施例5中人工污染样本操作进行加标黄杆菌属实验。所有60份样本分别储存第1、3、5、7、9天，然后从各样品中取样，分别提取各样本的基因组DNA利用实例4中qPCR方法进行检测，使用引物组1进行实验。并利用传统培养法进行对照检测。检测结果如表4，表中“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。

表4实际样本中黄杆菌检测的结果

由表4可得，与传统培养金标准方法比较，在检测的60份鱼肉样本中，利用本发明qPCR方法进行黄杆菌检测，所有阳性、阴性样本检出准确率为100％。本发明的黄杆菌qPCR分子检测方法针对模拟鱼肉储存品质的监测，无需对样本富集处理，只需提取样本DNA，配置对应qPCR体系进行反应及后续检测，整个过程只需3h，检测成本大约6元。而且实验发现，针对较高浓度黄杆菌污染样本时，无需DNA提取，只需要在PCR过程中增加10分钟预变性过程，即可完成快速检测，检测时间1.5h，检测成本可进一步降低(1元左右)。反之，传统培养金标准方法一般都需要预增菌、分离纯化、生化鉴定等步骤，检测时间为3-5天，操作相对复杂、检测成本也较高。相比之下，本发明的黄杆菌qPCR分子检测方法具有检测成本低、操作简单、检测时间短、准确度高、可靠性好等特点，能有效识别实际样本中目标变形杆菌。后续通过设计多重PCR体系并结合微流控芯片等生物传感器，有望实现高通量检测。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

广东环凯生物科技有限公司

<120> 用于筛查黄杆菌属的分子靶标及其定量检测方法

<130> 5.18

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 345

<212> DNA

<213> 黄杆菌

<400> 1

atgccaagat cggtaaattc agttgctaaa agagcaagaa gaaaaaaaat aatgaagcaa 60

gccaaaggtt tctttggtag acgtaaaaac gtttggacag ttgctaagaa tgcggtagag 120

aaagcgatga gctacgctta ccgtgacaga aaacagaata aaagaaattt ccgtgcttta 180

tggattcaac gtatcaacgc tggagctaga ttagaaggaa tgtcttattc tcaattcatg 240

gggaaagtaa aagctaacgg aatcgaattg aaccgtaaag ttcttgcaga tttagcgatg 300

aaccaccctg aagctttcaa agcaatactt aataaagtaa aataa 345

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

<400> 2

aaataatgaa gcaagccaaa gg 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 3

tgaatccata aagcacggaa a 21

Claims

1.核苷酸片段作为被检测靶标在制备筛查或检测黄杆菌试剂中的应用，其特征在于，所述应用为非疾病诊断目的的应用；所述核苷酸片段的序列如SEQ ID NO：1所示；所述黄杆菌为柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）、约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae）、水生黄杆菌（Flavobacterium hydatis）、水栖黄杆菌（Flavobacterium aquatile）或沙上黄杆菌（Flavobacterium sasangense）。

2.一种引物组在制备筛查或检测黄杆菌试剂中的应用，其特征在于，所述应用为非疾病诊断目的的应用；所述引物序列如SEQ ID NO：2~3所示；所述黄杆菌为柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）、约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae）、水生黄杆菌（Flavobacterium hydatis）、水栖黄杆菌（Flavobacterium aquatile）或沙上黄杆菌（Flavobacterium sasangense）。

3.一种非疾病诊断目的的鉴定黄杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1使用如权利要求2所述的引物组对样品的基因组DNA进行PCR扩增；

S2观察扩增产物是否出现目的条带，如果出现目的条带则判定该样品含有所述黄杆菌；

所述黄杆菌为柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）、约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae）、水生黄杆菌（Flavobacterium hydatis）、水栖黄杆菌（Flavobacterium aquatile）或沙上黄杆菌（Flavobacterium sasangense）。

4.如权利要求3所述的的方法，其特征在于，PCR扩增体系为：PCR反应缓冲液、MgCl₂、dNTP、模板DNA、引物组、Tag酶和灭菌双蒸水。

5.如权利要求3所述的的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：95℃预变性10 min；95℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸45 s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10 min。

6.一种非疾病诊断目的的定量检测黄杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1使用权利要求2所述的引物组对待测样品的基因组DNA进行 qPCR扩增；

S2以所述黄杆菌的标准品的菌株纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合获得所述黄杆菌的标准曲线；

S3分析待测样品的qPCR扩增结果，通过荧光信号Ct值与所述标准曲线进行比对，确定待测样品中所述黄杆菌的含量；

7.如权利要求6所述的的方法，其特征在于，qPCR扩增体系为：2× Premix 反应液10 μL，模板DNA 100 ng，10μmol/L上下游引物各1 μL，灭菌双蒸水补足体积至20 μL。

8.如权利要求6所述的的方法，其特征在于，qPCR扩增程序为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，变性、退火共进行45个循环。