CN103981266A - 一种检测乳制品中大肠菌群的方法及所用引物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测乳制品中大肠菌群的方法及所用引物，所述方法主要包括：从待测乳制品中提取总DNA；以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；对扩增结果进行分析判断。本发明的方法还可包括制作荧光定量PCR标准曲线，并将扩增结果和标准曲线比对计算出待测样品中大肠菌群细菌的活菌数。本发明的引物具有较高的特异性和灵敏性，本发明的方法可以快速、准确的完成乳制品中大肠菌群的定量测定。

Description

一种检测乳制品中大肠菌群的方法及所用引物
技术领域
本发明涉及一种检测乳制品中大肠菌群的方法及所用引物，具体是一种荧光定量PCR检测方法及该方法中所用的特异性引物，属于细菌检测技术领域。
背景技术
大肠菌群(Coliform bacteria)是一群在37℃24小时能发酵乳糖产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，主要包括肠杆菌科的四个属即大肠埃希氏菌属(Escherichia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、产气克雷伯氏菌属(Klebsiella)和阴沟肠杆菌属(Enterobacter)。大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。大肠菌群广泛存在于人和温血动物的肠道，并随粪便分布于自然界。大肠菌群既是粪便污染的指示菌，又是肠道致病菌污染食品的指示菌，是世界上大多数国家和组织评价食品卫生质量的重要安全性指标之一，在食品微生物指标体系中占有举足轻重的地位。
我国的食品卫生微生物标准体系主要由菌落总数、大肠菌群和致病菌三大类构成。大肠菌群的传统检测和计数方法有多管发酵法(MTF)和滤膜法(MF)。MTF是食品大肠菌群检测公认的传统方法，其原理是依据大肠菌群能够发酵乳糖，产酸产气的特点，将样品进行系列倍比稀释，接种到含有乳糖的培养基中，进行初发酵试验，观察产气情况，产气者进行复发酵试验。MTF优点是不需昂贵的仪器设备，经过基本微生物学培训的技术员即可操作；缺点是耗时费力，样品需要作系列稀释，加上复发酵试验大约需要96h。MF已在许多国家作为水质微生物检测的标准方法，核心是使用0.45μm的过滤膜过滤水样，将细菌截流在膜上，然后把膜放在选择性培养基中培养，计数膜上生长出的典型细菌集落。MF主要用于测定水中大肠菌群，虽然较MTF快，总需约48～72h，但仅适用于杂质较少的水体。
乳制品富含蛋白质、脂肪等营养物质，在生产、运输、加工和贮藏过程中，如果操作不当，极易受到大肠菌群的污染。统计显示，在影响中国食品安全的诸因素中，微生物污染高居首位。世界各国普遍将大肠菌群作为食品的细菌学常规检验指标之一，并且都对此卫生标准有明确规定，其检测结果的准确性直接关系到产品的品质和食品企业的经济效益，更关系到所有消费者的健康。乳制品企业大肠菌群的通用检测方法是国标方法，经过系列稀释、初发酵试验、复发酵验证等步骤，得出检验结果至少需要3-5天时间，对于货架期较短的食品非常不便。因此，提高大肠菌群检测的精确度和缩短检测时间是控制和保障食品安全的重要手段。
自1985年聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术问世以来，这一技术逐渐推广应用于生命科学的各个领域。因其具备快速、特异、灵敏、操作简便的特性，目前已被广泛应用于各种致病微生物的检测领域。但是常规PCR只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量，必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，费时费事，无法对扩增反应实时检测，因此常规PCR难以用于微生物的定量分析。实时荧光定量PCR技术是一种新型的核酸扩增技术，是DNA定量技术的一次飞跃，其主要是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术具有检测精度、灵敏度高，检测重复性好和线性范围广，操作简单、安全、自动化程度高，检测速度快、效率高等明显的优越性，是目前世界上公认的用于医学临床及生物学研究的最先进的核酸分子检测手段，已被世界各国研究机构承认并推崇。
然而，对于乳制品而言，通常成分复杂，其中可能含有多种抑制PCR反应的成分，且乳制品中大肠菌群限量指标较低，如何设计具有较高特异性和灵敏性的引物成为分子生物学技术检测乳制品中大肠菌群的一个关键。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种利用分子生物学技术检测乳制品中大肠菌群的方法，以缩短乳制品中大肠菌群的检测时间，提高检测准确性，且可以定量地检测乳制品中大肠菌群。
本发明的另一目的在于提供一种用于分子生物学技术检测乳制品中大肠菌群的特异性引物。
本发明的另一目的在于提供了一种用于分子生物学技术检测乳制品中大肠菌群的试剂盒，其中包含本发明所述的引物。
为达上述目的，一方面，本发明提供了一种利用分子生物学技术检测乳制品中大肠菌群的方法，该方法主要包括：
从待测乳制品样品中提取总DNA；
以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物为SEQ ID No.1与SEQ ID No.2；
对上述扩增结果进行分析判断。
如前所述，通常，乳制品中成分复杂，可能含有多种抑制PCR反应的成分，且乳制品中大肠菌群限量指标较低，设计大肠菌群特异性引物是本发明的分子生物学检测技术的关键之一。
根据本发明的具体实施方案，本案发明人研究了乳制品大肠菌群的污染状况，对乳制品中大肠菌群进行鉴定和分类，将从大量常见乳制品大肠菌群阳性样品中分离到的菌株进行菌落形态、革兰氏染色、生理生化及16S rRNA基因序列分析分类鉴定，最终设计了本发明的大肠菌群特异性引物。所设计的大肠菌群特异性引物为：
E.coli F：5'-CACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3'(SEQ ID No.1)；
E.coli R：5'-GAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID No.2)。
本发明所设计的引物对SEQ ID No.1与SEQ ID No.2，具有较高的特异性。在本发明的一具体实施例中，利用本发明所设计的引物对，以大肠菌群四个菌属标准株基因组DNA为模板，同时以肠炎沙门氏菌和痢疾志贺氏菌基因组DNA为阴性对照，另以活性菌乳制品中常见的益生菌动物双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌基因组DNA为阴性对照，进行PCR扩增。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳观察，结果表明，本发明所设计的引物对只能扩增出大肠菌群四个菌属标准株，不能扩增出对比菌株，表明该引物特异性非常好。
根据本发明的具体实施方案，由于通常乳制品成分复杂，其中可能含有多种抑制PCR反应的成分，乳制品中大肠菌群限量指标较低，为有效提取乳制品中大肠菌群DNA，本发明进一步对相关提取方法进行了优化。根据本发明的具体实施方案，本发明的检测乳制品中大肠菌群的方法中，所述从待测乳制品样品提取总DNA的过程包括如下步骤：
将待测乳制品样品进行増菌培养；
増菌培养后的样品离心，收集沉淀，加入TE缓冲液重悬，液氮冻融；加入SDS和蛋白酶K，37℃摇床4h以上；
加入CTAB提取缓冲液消化；
用酚仿法抽提；
加入异丙醇沉淀富集DNA。
根据本发明的更具体实施方案，本发明的检测乳制品中大肠菌群的方法中，样品经增菌培养后，才能有效提取到样品中可能存在的大肠菌群DNA模板并进行荧光定量PCR扩增，适宜的培养时间是提高检测准确性、有效判别样品是否符合相关卫生标准的关键。本案发明人对多种常见的需检测大肠菌群的乳制品包括奶粉、液态中性乳及乳饮料、酸奶、酸乳饮料、含乳蛋白的冷冻饮品等进行了摸索性实验，最终确定了以下适宜的增菌培养条件：
对于液态的待测乳制品样品(例如，液态中性乳及乳饮料、酸性乳及乳饮料、含乳蛋白的冷冻饮品料液)，可按照30～50mL待测乳制品样品：250～350mL营养肉汤的比例进行混合，于37±1℃生化培养箱中増菌培养4～6h；
固态的乳制品样品(例如，奶粉)，可按照30～50g待测乳制品样品：250～350mL营养肉汤的比例进行混合，于37±1℃生化培养箱中増菌培养4～6h。
上述增菌培养条件对于目前常见乳制品中大肠菌群的存在范围是适用的，特别是，按照上述条件增菌培养后并按照本发明的方法进行定量检测时，检测结果具有较高的检测准确性。
例如，在本发明的一具体实施方案中，待测乳制品为含乳蛋白的冷冻饮品，在该方案中，增菌培养时可按照30mL含乳蛋白的冷冻饮品料液：300mL营养肉汤的比例进行混合，于37℃生化培养箱中増菌培养5h；之后按照本发明的方法提取DNA进行PCR扩增检测。如果待测样品中大肠菌群数量超过相关卫生标准的最高限量指标(GB2759.1-2003中大肠菌群限量指标为450MPN/100mL)，则经过上述增菌培养后可有效提取到DNA模板并经后续PCR扩增被检测出来。即，在该实施方案中，如果按照该方法增菌培养并提取DNA经PCR扩增检测后，当低于荧光定量PCR检测限时，则含乳蛋白的冷冻饮品中大肠菌群数＜450MPN/100mL，符合相关卫生标准。
对于不同种类的乳制品样品，相关卫生标准中大肠菌群限量指标不同，如仅需简单的定性或半定量检测，可先用大肠菌群数为卫生标准中大肠菌群限量指标的标准品进行增菌培养并提取DNA经PCR扩增检测，确定能够达到荧光定量PCR检测限的最短培养时间。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测乳制品中大肠菌群的方法中，増菌培养后的样品离心、重悬、加入SDS和蛋白酶K破裂细胞降解蛋白质的过程可以参照所属领域的常规操作进行。本发明中优选的具体操作可以为：取増菌培养的样品1mL，12000g，4℃离心10min，收集菌体沉淀；加入500μL TE缓冲液，重悬菌体沉淀，液氮冻融4次；加入80μL10％SDS和10μL20mg/mL蛋白酶K，37℃摇床4h以上。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测乳制品中大肠菌群的方法中，加入CTAB提取缓冲液消化的过程也可参照所属领域的常规操作进行。本发明中优选的具体操作可以为：加入100μL5M NaCl溶液及80μL10mol/L CTAB溶液，65℃水浴20min。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测乳制品中大肠菌群的方法中，用酚仿法抽提的过程也可参照所属领域的常规操作进行。本发明中优选的具体操作可以为：用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，12000g，4℃离心10min，取上清；之后再用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测乳制品中大肠菌群的方法中，酚仿法抽提后的样品加入异丙醇沉淀富集DNA。该操作也可参照本领域的常规操作进行。本发明中优选的具体操作可以为：采用异丙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤，自然干燥，50μL TE溶解备用。
根据本发明的更具体实施方案，本发明的检测乳制品中大肠菌群的方法中，所述从待测乳制品样品提取总DNA的过程包括如下步骤：
按照30～50mL待测乳制品液态样品：250～350mL营养肉汤的比例，或者30～50g待测乳制品固态样品：250～350mL营养肉汤的比例进行混合，于37±1℃生化培养箱中増菌培养4～6h；更优选地，是按照30mL待测乳制品液态样品：300mL营养肉汤的比例，或者30g待测乳制品固态样品：300mL营养肉汤的比例进行混合，于37℃生化培养箱中増菌培养5h；
取増菌培养5h的样品1mL，12000g，4℃离心10min，收集菌体沉淀；
加入500μL TE缓冲液，重悬菌体沉淀，液氮冻融4次；
加入80μL10％SDS和10μL20mg/mL蛋白酶K，37℃摇床4h以上；
加入100μL5M NaCl溶液及80μL10mol/L CTAB溶液，65℃水浴20min；
用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，12000g，4℃离心10min，取上清；
用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清；
采用异丙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤，自然干燥，50μL TE溶解备用。
本发明的上述方法特别适合于从乳制品中提取大肠杆菌DNA，采用ND-1000微量紫外/可见分光光度计测定提取的基因组DNA的浓度，结果260nm/280nm的比值在1.8～2.0之间，表明提取的基因组DNA质量非常好。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测乳制品中大肠菌群的方法中，是需要定量测定乳制品样品中的大肠菌群。在该实施方案中，所述PCR为荧光定量PCR，优选的扩增反应条件如下：
反应体系：10μmol/L上下游引物各0.4μL，DNA模板2μL，Passive Reference Dye：0.4μL，2×TransStart Green qPCR SuperMix：10μL，ddH2O补足至20μL；
扩增程序：95℃预变性20s；40个循环，95℃变性5s，62℃退火30s，72℃延伸40s。
本发明的方法，可适用于检测液态乳制品(例如中性液态乳、中性乳饮料、酸性乳及乳饮料等)、奶粉、冷饮、酸奶等乳制品。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测乳制品中大肠菌群的方法中，所述PCR为荧光定量PCR，该方法还包括制作荧光定量PCR标准曲线、并将扩增结果与标准曲线进行比对计算出待测样品中大肠菌群细菌的活菌数的过程。
另一方面，本发明还提供了一种用于实现本发明所述检测乳制品中大肠菌群的方法的引物，该引物如SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示。
另一方面，本发明还提供了一种检测乳制品中大肠菌群的试剂盒，该试剂盒包含本发明所述的引物(SEQ ID No.1与SEQ ID No.2)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测乳制品中大肠菌群的试剂盒还包括Passive Reference Dye以及TransStart Green qPCR SuperMix。
综上所述，本发明从待测乳制品样品中提取了总DNA，设计了大肠菌群特异性引物，提供一种乳制品中大肠菌群的荧光定量PCR检测方法，该方法可以快速、准确定量检测样品的大肠菌群，大大缩短了样品大肠菌群的检测时间，提高了乳制品中大肠菌群检测灵敏度和准确度，对企业生产及品控微生物安全具有重要意义。
附图说明
图1为PCR(SEQ ID No.1；SEQ ID No.2)产物电泳图，泳道1为大肠埃希氏菌，泳道2为柠檬酸杆菌，泳道3为产气克雷伯氏菌，泳道4为阴沟肠杆菌，泳道5为肠炎沙门氏菌，泳道6为痢疾志贺氏菌，泳道7为动物双歧杆菌，泳道8为鼠李糖乳杆菌，泳道M为DNA Marker2000。
图2为PCR(SEQ ID No.3；SEQ ID No.4)产物电泳图，泳道1为大肠埃希氏菌，泳道2为柠檬酸杆菌，泳道3为产气克雷伯氏菌，泳道4为阴沟肠杆菌，泳道5为肠炎沙门氏菌，泳道6为痢疾志贺氏菌，泳道7为动物双歧杆菌，泳道8为鼠李糖乳杆菌，泳道M为DNA Marker2000。
图3为PCR(SEQ ID No.5；SEQ ID No.6)产物电泳图，泳道1为大肠埃希氏菌，泳道2为柠檬酸杆菌，泳道3为产气克雷伯氏菌，泳道4为阴沟肠杆菌，泳道5为肠炎沙门氏菌，泳道6为痢疾志贺氏菌，泳道7为动物双歧杆菌，泳道8为鼠李糖乳杆菌，泳道M为DNA Marker2000。
图4为引物(SEQ ID No.1；SEQ ID No.2)灵敏性验证，PCR产物电泳图，泳道1模板DNA浓度为105pg/μL，泳道2模板DNA浓度为104pg/μL，泳道3模板DNA浓度为103pg/μL，泳道4模板DNA浓度为102pg/μL，泳道5模板DNA浓度为10pg/μL，泳道6模板DNA浓度为1pg/μL，泳道7模板DNA浓度为0.1pg/μL，泳道8为无菌水(阴性对照)，泳道M为DNA Marker2000。
图5为大肠菌群基因组DNA电泳图，泳道1为大肠埃希氏菌，泳道2为柠檬酸杆菌，泳道3为产气克雷伯氏菌，泳道4为阴沟肠杆菌，泳道M为DNA Marker。
图6为FQ-PCR标准曲线，R值为0.998，精确度较高，可以作为待测样品中大肠菌群细菌数量测定的参考依据。
图7为样品FQ-PCR扩增曲线，灰度较深标记为标准品，灰度较浅标记为样品，从左到右依次为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。
实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例中所用到的各种化学试剂均可商购获得，例如：
乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇等化学试剂购自天津市化学试剂三厂；
蛋白酶K、Tris碱、EDTA(乙二胺四乙酸)购自Sigma公司；
Tris饱和酚、SDS(十二烷基硫酸钠)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)购自生工生物工程(上海)有限公司；
TransStart Green qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；
使用的荧光定量PCR仪为美国ABI公司的ABI-StepOne荧光定量PCR仪；
所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；
大肠埃希氏菌(1.2463)、柠檬酸杆菌(1.1732)、产气克雷伯氏菌(1.1736)、阴沟肠杆菌(1.181)、肠炎沙门氏菌(1.1859)以及痢疾志贺氏菌(1.1869)等标准菌株均购自中国普通微生物菌种保藏中心，动物双歧杆菌(bb12)、鼠李糖乳杆菌(LGG)由伊利集团技术中心保存。
实施例1
1、引物的设计、合成、特异性检测及灵敏性验证
本发明所设计的大肠菌群特异性引物为：
F：5'-CACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3'(SEQ ID No.1)；
R：5'-GAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID No.2)。
为验证本发明所设计的引物的特异性，与采用Primer Premier5.0软件设计的以下引物对(这些引物均是在GenBank中查找大肠菌群四个菌属标准株大肠埃希氏菌(AB548582.1)、柠檬酸杆菌(AB548577.1)、产气克雷伯氏菌(Y17656.1)和阴沟肠杆菌(EF551364.1)的16S rRNA基因，找出其共同保守序列，利用软件设计)进行了对比试验：
F：5'-GACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATG-3'(SEQ ID No.3)；
R：5'-CGGACCGCTGGCAACAAAGGATAAGG-3'(SEQ ID No.4)。
F：5'-GGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAAC-3'(SEQ ID No.5)；
R：5'-CGGACCGCTGGCAACAAAGGATAAGG-3'(SEQ ID No.6)。
引物特异性验证：
取大肠埃希氏菌(1.2463)、柠檬酸杆菌(1.1732)、产气克雷伯氏菌(1.1736)和阴沟肠杆菌(1.181)标准菌株菌液，采用蛋白酶K法提取宏基因组DNA，作为模板。选取与大肠菌群四个菌属亲缘性较近，也是食品污染的主要致病菌，同为肠杆菌科的肠炎沙门氏菌(1.1859)以及痢疾志贺氏菌(1.1869)菌液，采用蛋白酶K法提取宏基因组DNA，以肠炎沙门氏菌(1.1859)及痢疾志贺氏菌(1.1869)基因组DNA为阴性对照，另以活性菌乳制品中常见的动物双歧杆菌(bb12)和鼠李糖乳杆菌(LGG)，采用蛋白酶K法提取基因组DNA为阴性对照，采用3对引物(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2；SEQ ID No.3、SEQ ID No.4；SEQ ID No.5、SEQ ID No.6)进行普通PCR扩增。PCR体系25μL：10×PCRBuffer：2.5μL；2.5mmol/L dNTPs：2.0μL；5μmol/L上游引物：1.0μL；5μmol/L下游引物：1.0μL；5U/μL Taq DNA聚合酶：0.3μL；100ng/μLDNA模板：1.0μL；ddH20：17.2μL。PCR循环程序：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min10s，35个循环；72℃终端延伸7min，4℃→∞。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳观察，结果表明：引物(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2)只能扩增出大肠菌群四个菌属标准株，不能扩增出对比菌株(见图1)；引物(SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4)只能扩增出大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌及产气克雷伯氏菌，不能扩增出阴沟肠杆菌(见图2)；引物(SEQ ID No.5、SEQ ID No.6)能扩增出大肠菌群四个菌属标准株，但是也能扩增出肠炎沙门氏菌和动物双歧杆菌(见图3)；表明引物(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2)不但灵敏度高(扩增目的条带非常亮)，而且特异性也非常好。
引物灵敏性验证：
采用蛋白酶K法提取大肠菌群标准菌株的基因组DNA，微量核酸蛋白分析仪测定其浓度，无菌水作10倍梯度稀释，使基因组DNA浓度分别为105pg/μL、104pg/μL、103pg/μL、102pg/μL、10pg/μL、1pg/μL，0.1pg/μL，分别取不同浓度的基因组DNA1.0μL为模板，无菌水作为阴性对照，采用引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2进行PCR扩增。PCR体系25μL：10×PCRBuffer：2.5μL；2.5mmol/L dNTPs：2.0μL；5μmol/L上游引物：1.0μL；5μmol/L下游引物：1.0μL；5U/μL Taq DNA聚合酶：0.3μL；DNA模板：1.0μL；ddH2O：17.2μL。PCR循环程序：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min10s，35个循环；72℃终端延伸7min，4℃→∞。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳观察，结果当模板浓度为105pg/μL～102pg/μL时，可见清晰的目的条带，当模板浓度为10pg/μL时，可见微弱的目的条带，当模板浓度降低至1pg/μL时，无目的条带出现，表明引物对SEQ ID No.1与SEQ ID No.2的灵敏度较高，检测限为模板DNA浓度10pg/μL(见图4)。
2、待测样品中细菌宏基因组DNA提取
随机选取6份待测乳制品样品(含乳蛋白的冷冻饮品料液)，各取30mL分别接种到300mL营养肉汤中，于37℃生化培养箱中増菌培养5h；
取増菌培养5h的样品1mL，12000g，4℃离心10min，收集菌体沉淀；
加入500μL TE缓冲液，重悬菌体沉淀，液氮冻融4次；
加入80μL10％SDS和10μL20mg/mL蛋白酶K，37℃摇床4h以上；
加入100μL5M NaCl溶液及80μL10mol/L CTAB溶液，65℃水浴20min；
用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，12000g，4℃离心10min，取上清；
用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清；
采用异丙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤，自然干燥，50μL TE溶解，得到DNA模板，备用。
按照上述方法提取得到的DNA模板，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，可见明显的目的条带(见图5)，表明该法可以提取到大肠菌群的基因组DNA，而且收率很高。
3、采用荧光定量PCR检测样品中大肠菌群的数量：
标准品的制备：
将过夜活化的大肠菌群菌液，10倍系列稀释，平板计数法计数并计算菌液浓度。取1mL已测定浓度的菌液，提取细菌的基因组DNA，应用微量紫外分光光度计测定DNA浓度，计算单位浓度的基因组DNA中所包含的大肠菌群细菌的个数，将此单位浓度的基因组DNA进行10倍系列稀释，并以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应。
标准曲线的绘制：
以含有梯度稀释个数大肠菌群细菌基因组DNA阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标扩增得到大肠菌群的定量扩增标准曲线(见图6)，以此作为待测样品中大肠菌群数量测定的参照标准。
待测样品中大肠菌群的测定：
取2μL提取的待测样品基因组DNA作为模板进行FQ-PCR扩增，FQ-PCR反应体系：上游引物：0.4μL；下游引物：0.4μL；DNA模板：2μL；Passive Reference DyeI：0.4μL；2×TransStart Green qPCR SuperMix：10μL；ddH2O：Up to20μL。FQ-PCR扩增程序：95℃20s；40个循环，95℃5s，62℃30s，72℃40s。将扩增结果和标准曲线比对计算出每毫升样品中大肠菌群细菌的活菌数(见图7)。
待测样品中大肠菌群的定量结果见表1：
表1样品中大肠菌群数量。
样品编号 大肠菌群菌数(CFU/mL)
1 4.0×102
2 1.3×103
3 1.0×104
4 1.1×104
5 3.5×104
6 1.5×106
FQ-PCR检测灵敏度：标准大肠菌群菌株储备液按比例稀释为107、106、105、104、103、102、10CFU/mL，按照上述方法提取基因组DNA，应用本发明设计的特异性引物，对已知数量的大肠菌群进行FQ-PCR扩增，扩增结果显示，当大肠菌群的数量在103CFU/mL以上时，大肠菌群的定量结果线性关系良好，可以准确定量。

Claims (10)

1.一种检测乳制品中大肠菌群的方法，该方法主要包括：
从待测乳制品样品中提取总DNA；
以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物为SEQ ID No.1与SEQ ID No.2；
对上述扩增结果进行分析判断。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述从待测乳制品样品提取总DNA的过程包括如下步骤：
将待测乳制品样品进行増菌培养；
増菌培养后的样品离心，收集沉淀，加入TE缓冲液重悬，液氮冻融；加入SDS和蛋白酶K，37℃摇床4h以上；
加入CTAB提取缓冲液消化；
用酚仿法抽提；
加入异丙醇沉淀富集DNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述从待测乳制品样品提取总DNA的过程包括如下步骤：
按照30～50mL待测乳制品液态样品：250～350mL营养肉汤的比例，或者30～50g待测乳制品固态样品：250～350mL营养肉汤的比例进行混合，于37±1℃生化培养箱中増菌培养4～6h；
取増菌培养5h的样品1mL，12000g，4℃离心10min，收集菌体沉淀；
加入500μL TE缓冲液，重悬菌体沉淀，液氮冻融4次；
加入80μL10％SDS和10μL20mg/mL蛋白酶K，37℃摇床4h以上；
加入100μL5M NaCl溶液及80μL10mol/L CTAB溶液，65℃水浴20min；
用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，12000g，4℃离心10min，取上清；
用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清；
采用异丙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤，自然干燥，TE溶解备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PCR为荧光定量PCR，扩增反应条件如下：
反应体系：10μmol/L上下游引物各0.4μL，DNA模板2μL，Passive Reference Dye：0.4μL，2×TransStart Green qPCR SuperMix：10μL，ddH2O补足至20μL；
扩增程序：95℃预变性20s；40个循环，95℃变性5s，62℃退火30s，72℃延伸40s。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述乳制品为液态乳制品、奶粉、冷饮。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其中，所述乳制品为含乳蛋白的冷冻饮品，其中，增菌培养时按照30mL含乳蛋白的冷冻饮品料液：300mL营养肉汤的比例进行混合，于37℃生化培养箱中増菌培养5h；之后提取DNA进行荧光定量PCR扩增检测；当低于荧光定量PCR检测限时，则含乳蛋白的冷冻饮品中大肠菌群数＜450MPN/100mL，符合相关卫生标准。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PCR为荧光定量PCR，该方法还包括制作荧光定量PCR标准曲线、并将扩增结果与标准曲线进行比对计算出待测样品中大肠菌群细菌的活菌数的过程。
8.用于实现权利要求1～7任一项所述检测乳制品中大肠菌群的方法的引物，该引物如SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示。
9.一种检测乳制品中大肠菌群的试剂盒，该试剂盒包含权利要求8所述的引物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，该试剂盒还包括Passive Reference Dye以及TransStart Green qPCR SuperMix。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110527681A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种牛奶中总微生物dna的提取方法
CN113234844A (zh) * 2021-06-30 2021-08-10 中国海洋大学 检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的pcr引物对及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101705305A (zh) * 2009-12-14 2010-05-12 内蒙古农业大学 一种适合乳酸菌16S rRNA序列测定的引物设计

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101705305A (zh) * 2009-12-14 2010-05-12 内蒙古农业大学 一种适合乳酸菌16S rRNA序列测定的引物设计

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张雅君等: "乳制品中大肠菌群的鉴定与分类", 《农产品加工·学刊》, no. 8, 31 August 2010 (2010-08-31), pages 45 - 48 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110527681A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种牛奶中总微生物dna的提取方法
CN113234844A (zh) * 2021-06-30 2021-08-10 中国海洋大学 检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的pcr引物对及其应用

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