KR20240034310A - 살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카의 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트 및 상기 균의 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카의 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트 및 상기 균의 검출 방법에 대한 것이다.
Description
본 발명은, 살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카의 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트 및 상기 균의 검출 방법에 대한 것이다.
살모넬라는 그람 음성, 통성 혐기성, 비포자 형성 박테리아이며 미국에서 식중독의 가장 흔한 박테리아 원인이다(Kim & Kim, 2021a). 살모넬라 속은 살모넬라 본가리(Salmonella bongori)와 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)의 2종으로 구성되며, 이는 다시 enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae 및 indica의 6개 아종(ssp.)으로 분류된다(Lee et al., 2009). 보다 구체적으로, ssp. Enterica에는 Enteritidis, Montevideo, Senftenberg, Typhi 및 Typhimurium과 같은 몇 가지 잘 알려진 혈청형이 있다(Jeong, Baik, & Kang, 2017). 오랫동안 장티푸스 살모넬라는 식인성 발병의 원인으로 여겨져 왔으며 연구는 장티푸스 살모넬라의 검출 및 비활성화에 중점을 두었다. 장티푸스 살모넬라균과 병행하여 비장티푸스성 살모넬라균은 많은 식인성 질병과 관련이 있는 것으로 보고되었다(Majowicz et al., 2010; Scallan et al., 2011).
다양한 혈청형 중에서 살모넬라 몬테비데오(Salmonella Montevideo)는 악명 높은 식품 매개 병원체로 알려져 있다. 특히, 살모넬라 몬테비데오 감염에 의한 발병은 오염된 고추 및 후추(Gieraltowski et al., 2013), 타히니(Unicomb et al., 2005), 토마토(Lin & Wei, 1997), 피스타치오(Harris et al., 2013)와 관련이 있다. 이와 관련하여 식품에서 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 살모넬라 몬테비데오를 빠르고 안정적으로 검출하는 것이 중요하다.
종래에는 식품에서 살모넬라 균을 검출하기 위해 선택적 배지가 사용되었다. 종래의 방법과 병행하여 실시간 중합효소연쇄반응(PCR), 등온 증폭, 효소 결합 면역 흡착 분석, 박테리오파지 증폭 및 금 나노입자 응집 기반 방법을 포함하여 식품 내 병원체를 검출하기 위한 몇 가지 빠른 검출 방법이 제안되었다. (Kim and Kim, 2021b). 이러한 대체 검출 방법 중 real-time PCR은 높은 감도와 선택성을 통해 식품 매개 병원체의 검출에 널리 사용되었다.
프라이머 세트를 설계하는 것은 Real-Time PCR 분석에 의한 검출의 감도와 선택성을 결정하는 가장 중요한 단계이다. Realtime PCR 분석의 한계 중 하나는 잘못 설계된 프라이머-프로브 서열을 사용할 경우 검출 감도/선택성이 크게 감소한다는 것이다. 일반적으로 invA를 표적으로 하는 유전자 마커는 미국 식품의약국 Bacteriological Analytical Manual(Gonzlez-Escalona., 2009)에서 제안한 바와 같이 PCR 분석을 통해 살모넬라균을 검출하는 데 널리 사용되었다. 그러나 유전자 마커 invA는 다양한 살모넬라균 및 비-살모넬라균 종에 대해 위양성 및 음성 결과를 나타내는 것으로 보고되었다 (Buehler, Wiedmann, Kassaify, & Cheng, 2019). 따라서 식품에서 살모넬라 엔테리카 또는 살모넬라 몬테비데오를 안정적으로 검출하려면 대체 프라이머 서열을 결정해야 한다.
최근 비교 유전체학은 의학, 보건의료, 식품산업 등 다양한 분야에서 응용되고 있다(Kim, Gu, Kim, & Lee, 2020). 차세대 염기서열분석의 급속한 발전으로 여러 박테리아 균주로부터 완전한 게놈 염기서열을 수일 내에 수집 및 분석할 수 있으며(Chin et al., 2011), 병원체의 위험평가(Im, Hwang, Kim, & Choi, 2021) 및 프라이머 디자인(Kwon, Lee, Park, & Kim, 2021)과 같은 다양한 분야의 연구에 적용될 수 있다. 모든 균주가 공유하는 병원체의 핵심 게놈은 민감하고 선택적인, 프라이머 서열을 설계하는 데 유용하다. 범 게놈 분석을 통해 특정 병원체의 모든 균주가 다른 병원체에서 발견되지 않는 서열을 공유하는 유전 영역을 결정할 수 있다. 이전에 비교 유전체학을 사용하여 여러 살모넬라 혈청형을 검출하기 위한 프라이머 설계와 관련한 여러 시도가 보고되었다. 예를 들어, Kim 등(2006)은 비교 유전체학으로 얻은 특정 PCR 프라이머를 사용하여 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)을 확인했다. 마찬가지로, Ye 등은 (2021) S. Hadar 및 S. Albany의 PCR 검출을 위한 특정 표적을 조사했다. 이전 연구에서는 살모넬라 몬테비데오의 비교 유전체학을 적용하여 식인성 질병 식별에 효과적인 계통 특이적 유전자 차이를 식별했지만(Nguyen et al., 2018), 식품 샘플 중 악명 높은 살모넬라 엔테리카 또는 살모넬라 몬테비데오 균주의 검출을 위한 비교 유전체학은 제한되어 있었다.
본 발명에서는 비교 유전체학을 기반으로 살모넬라 엔테리카 또는 살모넬라 몬테비데오의 검출을 위한 DNA 프로브를 설계하였다. 설계된 DNA 프로브의 감도와 선택성을 다양한 균주로 검증하고 간섭 물질의 영향을 확인했다. 마지막으로 토마토, 생닭고기, 고추, 및 후추 샘플들로 하여 식품 샘플에서 설계된 DNA 프로브의 적용 가능성을 확인하였다.
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본 발명의 일 목적은 비교 유전체학을 기반으로 살모넬라 엔테리카 또는 살모넬라 몬테비데오의 신속하고 정확한 검출을 위한 프라이머 세트, 키트 또는 이의 검출 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 양태는, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는, 살모넬라 몬테비데오(Salmonella Montevideo) 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는, 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머를 포함하는 살모넬라 엔테리카(Salmonella Enterica) 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 전술한 프라이머 세트와 증폭 반응 수행을 위한 시약을 포함하는, 살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는,
대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 전술한 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 대상 시료에서 살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카를 검출하는 방법에 대한 것이다.
본 발명의 프라이머 세트 또는 키트를 이용하면 살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카를 정확하고 신속하게 검출할 수 있다.
도 1은 PanX 분석을 기반으로 한 살모넬라 몬테비데오의 가시화된 계통수이다.
도 2는 살모넬라 에테리카의 검출을 위한 ssaG의 표준 곡선으로, 각각 세균 군집(1og CFU/ml)의 상대 형광 단위(RFU) 100(도 2A), 150(도 2B) 및 200(도 2C)의 임계치에서의 표준 곡선을 나타낸다.
도 3는 살모넬라 몬테비데오의 검출을 위한 salM의 표준 곡선으로, 각각 세균 군집(1og CFU/ml)의 상대 형광 단위(RFU) 100(도 3A), 150(도 3B) 및 200(도 3C)의 임계치에서의 표준 곡선을 나타낸다.
도 4는 다양한 농도의 병원체(2.5-6.5 log CFU/g)를 토마토(도 2A)와 생닭고기 시료(도 2B), 고춧가루(도 2C) 및 후춧가루(도 2D)에 각각 접종했을 때, salM 및 ssaG 프라이머-프로브 세트를 사용하여 살모넬라 몬테비데오(Salmonella Montevideo) 또는 살모넬라 엔테리카(Salmonella Enterica)의 검출 효능 비교하는 그래프이다.
도 2는 살모넬라 에테리카의 검출을 위한 ssaG의 표준 곡선으로, 각각 세균 군집(1og CFU/ml)의 상대 형광 단위(RFU) 100(도 2A), 150(도 2B) 및 200(도 2C)의 임계치에서의 표준 곡선을 나타낸다.
도 3는 살모넬라 몬테비데오의 검출을 위한 salM의 표준 곡선으로, 각각 세균 군집(1og CFU/ml)의 상대 형광 단위(RFU) 100(도 3A), 150(도 3B) 및 200(도 3C)의 임계치에서의 표준 곡선을 나타낸다.
도 4는 다양한 농도의 병원체(2.5-6.5 log CFU/g)를 토마토(도 2A)와 생닭고기 시료(도 2B), 고춧가루(도 2C) 및 후춧가루(도 2D)에 각각 접종했을 때, salM 및 ssaG 프라이머-프로브 세트를 사용하여 살모넬라 몬테비데오(Salmonella Montevideo) 또는 살모넬라 엔테리카(Salmonella Enterica)의 검출 효능 비교하는 그래프이다.
본 발명의 일 양태는, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머 세트를 포함하는, 살모넬라 몬테비데오 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다. 상기 프라이머 세트는 살모넬라 몬테비데오(Salmonella Montevideo)의 특징적 유전자인 salM를 표적으로 하며, 따라서 상기 균을 정확하고 신속하게 검출할 수 있다. 상기 프라이머 세트는 서열번호 3의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 상기 프라이머 세트는 살모넬라 엔테리카의 특징적 유전자인 ssaG를 표적으로 한다. 상기 프라이머 세트는 추가로 서열번호 6의 프로브를 포함할 수 있다. 살모넬라 몬테비데오는 살모넬라 엔테리카의 혈청형 중 하나이며, 이에 ssaG를 표적으로 하는 프라이머를 사용한 경우 살모넬라 몬테비데오 및 살모넬라 엔테리카가 각각 양성이 나오는 반면, salM를 표적으로 하는 프라이머를 사용한 경우 살모넬라 몬테비데오만이 양성이 나오고 살모넬라 엔테리카는 음성이 나오므로 서열번호 1 및 2의 프로브 세트를 이용하면 살모넬라 몬테비데오를 특이적으로 검출할 수 있다.
| 항목 | 염기서열 | 서열 번호 | 표적 유전자 |
| 살모넬라 몬테비데오(Salmonella Montevideo) | Forward primer : GGA TTT ATC RGA CGC TAA GGA AGT AA (R은 A 또는 G) | 서열 번호 1 | salM |
| Reverse primer : GCG TGG GTG GAG GAA TA | 서열 번호 2 | ||
| Probe : CGC AGG CAG CCG ATC ATC | 서열 번호 3 | ||
| 살모넬라 엔테리카(Salmonella Enterica) | Forward primer : ATG GAT ATT GCA CAA TTA GTG G | 서열 번호 4 | ssaG |
| Reverse primer : AGC AAT GAT TCC ACT AAG CAT | 서열 번호 5 | ||
| Probe : ATG GCG CAY CAG GC | 서열 번호 6 |
ssaG를 표적으로 하는 프라이머 세트를 사용한 경우 살모넬라 몬테비데오 및 살모넬라 엔테리카가 각각 양성이 나오는 반면, salM를 표적으로 하는 프라이머 세트를 사용한 경우 살모넬라 몬테비데오만이 양성이 나오고 살모넬라 엔테리카는 음성이 나오므로 살모넬라 몬테비데오를 특이적으로 검출할 수 있다. 또한, salM를 표적으로 하는 프라이머 세트를 사용한 경우, 예컨대 E. coli O157 균주가 위양성 결과를 나타낼 수 있다. 위양성 결과를 배제하기 위해 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 검출용 프라이머 세트를 추가로 포함함으로써 살모넬라 몬테비데오 검출의 정확도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 전술한 프라이머 세트와 증폭 반응 수행을 위한 시약을 포함하는, 살모넬라 몬테비데오(Salmonella Montevideo) 또는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 검출용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 살모넬라 몬테비데오 검출용일 수 있고, 서열번호 1 내지 2의 프라이머 세트를 포함할 수 있고, 임의로 서열번호 4 내지 5의 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 또는 상기 키트는 살모넬라 엔테리카 검출용일 수 있고, 서열번호 4 내지 5의 프라이머 프로브 세트를 포함할 수 있다. 상기 각각의 키트는 서열번호 3 또는 서열번호 6의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
상기 증폭 반응 수행을 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트는 식품 중 살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카를 검출하기 위한 용도일 수 있다. 상기 식품은 예컨대 고추, 후추, 토마토, 파스타치오, 치킨 등일 수 있으나, 살모넬라 몬테비데오나 살모넬라 엔테리카로 감염되었을 것으로 의심되는 식품이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태는,
대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 2의 프라이머 세트 및/또는 서열번호 4 내지 5의 프라이머 프로브 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 대상 시료에서 살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카를 검출하는 방법에 대한 것이다.
상기 방법은 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 대상 시료는 식품, 예컨대 고추, 후추, 토마토, 파스타치오, 치킨 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, wizard prep 키트(Promega사)를 이용할 수 있다. 상기 게놈 DNA 분리는 여과를 추가로 포함할 수 있다. 여과를 추가로 포함함으로써 검출 효율을 개선시킬 수 있다.
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 양태에 따른 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 서열은 살모넬라 몬테비데오의 salM 유전자이다. 또는 서열번호 4 및 5의 프라이머 세트를 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 서열은 살모넬라 엔테리카의 ssaG 유전자이다.
표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 실시간 PCR을 통해 정량적으로 수행할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 형광 프로브, SYBR Green I, Cy-5 또는 Cy-3이다. 형광 프로브의 경우에는 PCR 전에 프로브를 주형에 혼성화시키고, PCR이 진행되면서 프로브가 주형에서 떨어져 나오면서 형광을 발하게 되는 것이다. 형광 리포터 dye는 5' 끝부분엔 FAM(carboxyfluorescein), 헥사클로로플루오레세인(HEX), 비형광 물질인 quencher 3' 끝부분엔 MGB(minor groove binder), BHQ1 또는 BHQ2가 표지되어 있다. SYBR Green I의 경우에는 PCR 반응 혼합물에 상기 dye를 혼합하여 PCR을 실시하면 PCR이 진행되면서 SYBR Green I이 PCR 산물에 삽입되면서 형광을 띄게 된다. Cy-5 또는 Cy-3의 경우에는 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.
또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용되는 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
1.재료 및 방법
1.1. panX 분석을 사용한 프라이머-프로브 설계
살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카의 검출을 위한 DNA 프로브를 설계하기 위해 비교 유전체학을 적용했다. 23개의 살모넬라 몬테비데오 균주를 포함하여 706개의 살모넬라 엔테리카 균주의 완전한 게놈 서열 데이터에 관한 정보는 NCBI RefSeq 데이터베이스(2021년 3월 12일 액세스)에서 검색되었다. Pan-genome 분석 및 시각화를 위한 강력한 대화형 플랫폼인 panX를 사용하여 기본 매개변수와 함께 비교 게놈 분석을 수행하여 살모넬라 엔테리카 균주의 핵심 게놈을 구성했다. PanX 분석 파이프라인은 단백질 정렬을 위한 차세대 시퀀싱 데이터(DIAMOND)의 Double Index Alignment(Buchfink, Xie, & Huson, 2015) 및 클러스터링을 위한 Markov 클러스터 알고리즘 (MCL)(Enright, Van Dongen, & Ouzounis, 2002)을 기반으로 한다. Interactive Tree of Life(Letunic & Bork, 2019)를 사용한 계통수를 기반으로 핵심 게놈 단일 염기 다형성(SNP)을 시각화했다. 23개의 살모넬라 몬테비데오 균주 중 Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR, 버전 1.1.1)(Yoshida et al., 2016) 및 SeqSero2(버전 1.2.1)(Zhang et al., 2019)(Sup. 3)을 이용하여 살모넬라 혈청형 예측을 수행한 결과, 3개의 균주(American Type Culture Collection(ATCC) 8387, ATCC 10729, USDA-ARS-USMARC-1913)가 비-몬테비데오 혈청형으로 확인되었다. SISTR 및 SeqSero2는 각각 -f tsv -p -qc 매개변수 및 -m k -t 4 매개변수로 수행되었다. 살모넬라 엔테리카의 프라이머 서열을 설계하기 위해 SPI-2 Type III 분비 관련 유전자와 이펙터를 후보로 사용했는데, 이는 이것이 살모넬라 엔테리카와 살모넬라 본고리의 분화에 사용되는 영역으로 알려져 있기 때문이다(Fookes et al., 2011). 46개 후보 중 ssaG, ssaS 및 ssaM만이 살모넬라 엔테리카의 706개 균주를 모두 커버하였다. 이 3가지 후보 중 type III 분비계 바늘 필라멘트 단백질 SsaG로 주석이 달린 ssaG 유전자는 다양성이 낮기 때문에 표적 유전자로 선택되었다. 이와 관련하여 ssaG를 표적으로 하는 프라이머 세트를 설계하고, 설계된 프라이머 세트의 효능을 조사하였다(표 1).
정의된 오르소로그(ortholog)에서 22개의 살모넬라 엔테리카 하위종, 살모넬라 엔테리카 Pathogenicity Island(SPI)-2 Type III 분비 관련 유전자와 SPI-2 T3SS의 26개 이펙터가 확인되었다. 살모넬라 몬테비데오에 대한 프라이머 세트를 개발하기 위해 ATCC(ATCC 8387 및 BAA 1735)의 추가 정보가 분류에 사용되었다. 살모넬라 몬테비데오의 경우 10개의 특정 유전자 클러스터가 확인되었다. 또한, PHAge 검색 도구 강화 릴리스(PHASTER) 웹서버를 사용하여 기본 매개변수를 사용하여 박테리아 게놈에서 추정되는 프로파지 서열을 예측했다(Arndt et al., 2016).
1.2. 세균 배양 및 세포 현탁액
살모넬라 엔테리카 균주 및 기타 병원성 또는 비병원성 미생물을 PCR 분석의 민감도 및 선택성 시험에 사용하였다. 미생물은 Sanigen(Sanigen Co., Ltd., 안양, 한국)에 의해 제공된 KVCC 균주(Korea Veterinary Culture Collection strains)를 제외하고는 서울대학교(대한민국, 서울)의 박테리아 배양 기관에 의해 제공되었다. 민감도 및 선택성 테스트에 사용된 미생물 목록은 아래의 표 3, 표 4에 나타내었다. 각 균주는 DNA 추출 전에 24시간 동안 37°C의 농축 완충액에서 배양되었다.
1.3. 실시간 PCR 분석
다양한 DNA 추출 방법에 대한 실험을 제외하고 Genelix™Bacterial Extraction kit(bead type, Sanigen Co., Ltd., 대한민국, 안양)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 배양액에서 DNA를 추출하였다. 미생물 균주에서 정제된 DNA의 10ng/μL 농도를 사용했다. ssaG 및 salM을 표적으로 하는 프라이머 및 프로브 세트는 AlleID7 프로그램을 사용하여 설계되었다(표 1).
블랙홀 소광제-2(BHQ2)가 있는 형광 염료 헥사클로로플루오레세인(HEX)과 블랙홀 소광제-1(BHQ1)이 있는 카르복시플루오레세인(FAM)을 각각 살모넬라 엔테리카 및 살모넬라 몬테비데오의 검출에 사용했다. ssaG 또는 salM을 표적으로 하는 마커에 대해 각각 0.2μL의 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브를 추가했다. 10 μL의 마스터믹스 및 5 μL의 DNA 템플릿을 물과 함께 첨가하여 20 μL의 최종 부피를 만들었다. PCR 분석은 CFX96 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. 50℃에서 2분간 전처리하고 95℃에서 10분간 초기 변성 후 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분 동안 변성 및 어닐링을 하는, 40 사이클을 각각 수행했다. PCR 분석 결과는 형광 신호의 증가로 평가하였고 정량 사이클(Cq) 값으로 나타내었다. 살모넬라 몬테비데오 NCCP 10140의 DNA 표준 곡선은 100, 150 및 200 상대 형광 단위(RFU)의 임계값과 기울기 R2로 플로팅되어, 효율성이 측정되었다(도 2 및 도 3, 표 2).
[표 2]
100, 150 및 200 상대 형광 단위(RFU)의 CFX96 PCR 시스템(Bio-Rad)을 이용한 표준 곡선에 기초한 ssaG 및 salM의 검증, 살모텔라 몬테비데오 NCCP 10149이 상기 검증에 사용되었음
1.4. 간섭 테스트
영양배지(Luria-Bertani(LB) 배지, 완충 펩톤수(BPW), 트립신계 소이 브로쓰(TSB), 인산완충식염수(PBS), 토마토, 닭고기, 양 혈액)를 간섭물질로 선정하였다. 버퍼(25% 및 50% PBS), 증균 배지(LB, BPW, TSB 각각 25% 및 50% 및 양 혈액 5%) 및 식품 시료(토마토 10% 및 닭고기 시료 25%)에 의한 간섭을, 상기 물질을 직접 약한 양성 DNA 주형 컨트롤과 혼합하여 측정하였다. 식품 시료의 경우 25g의 토마토와 닭고기 시료를 225ml의 펩톤수(PW)로 스토머를 이용하여 균질화한 후 이 균질액을 사용하였다. 각 간섭 물질을 5μl의 2log CFU/ml 살모넬라 몬테비데오 NCCP 10140과 혼합하여 최종 혼합물을 구성하였다. 변이계수(CV)는 간섭물질을 첨가하지 않은 시료와 간섭물질을 첨가한 시료의 Cq 값을 비교하여 계산하였으며, CV 값은 복제물 군의 평균 양으로 표준편차 양을 나누어 구하였다. CV는 정밀도의 척도이며 5% 미만의 CV 값은 동일한 값을 나타낸다.
1.5. 식품 적용 후 다양한 DNA 추출 방법
토마토, 생 닭고기, 후추, 고춧가루는 식료품점(서울, 한국)에서 구입했다. 토마토 및 생닭고기 실험을 위해 각 병원균 100μl를 스팟 접종(9 스팟)으로 샘플 25g에 접종하였다. 후추 및 고추가루 실험을 위해 각 병원균 1ml를 시료 25g에 접종하고 균질화를 위해 손으로 마사지하였다. 접종된 후추와 고추 가루를 맞춤형 항온항습기를 사용하여 30°C 및 40% 상대습도에서 24시간 동안 건조시켰다. 병원균이 VBNC(viable but non-culturable) 상태로 진입할 수 있다고 보고된 바 있으며(Ramamurthy, Ghosh, Pazhani, & Shinoda, 2014), 분말 식품에서 낮은 수준의 병원균 검출 효율이 크게 감소했다(Hyun, Park , Choi, Holt, & Seo, 2010). 따라서 2분 동안 스토마커(Easy Mix; AES Chemunex, Rennes, France)를 사용하여 샘플에서 병원체를 분리하였다. 균질액에서 분리된 병원체의 DNA를 Genelix 추출 키트(bead type)로 추출하였다. 종래 방법의 효율성을 확인하기 위해 분리된 병원체를 XLD에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하고 Kim 및 Kang(2017)의 설명대로 검은색 집락을 나타내는 세포를 계수했다. 식품 시료에 접종한 살모넬라 엔테리카와 살모넬라 몬테비데오의 검출 효능을 종래의 선택적 방법(xylose lysine desoxycholate (XLD)) 및 Real-time PCR 분석과 비교하였다. 24시간 건조 후 고추가루 시료와 후추가루 시료에서 DNA 추출 처리의 효과를 확인하기 위하여 5μm pore-size Syringe filter(GVS filter technology, IN, USA)) 유무에 관계없이 Genelix 추출 키트(bead type)와 가열(PBS로 세척한 후 100℃에서 10분간)하여 균질액에서 분리된 병원균의 DNA를 추출하였다. PCR 분석을 위한 실험 조건은 앞의 섹션 1.3에서 보고된 것과 다르지 않았다.
1.6. 통계 분석
이 연구의 실험은 3번 반복되었으며 결과는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시된다. 간섭 및 추출 실험에 대한 값은 Statistical Analysis System(SAS Institute, Cary, NC)의 분산 분석 절차에 의해 분석되었으며, 평균값은 Duncan의 다중 범위 검정을 사용하여 분리되었다. 유의한 차이는 p = 0.05의 유의 수준에서 결정되었다.
2. 결과
2.1. 살모넬라 엔테리카 균주의 팬 게놈 분석
본 연구에서는 NCBI Genebank(2021년 3월 12일 액세스)에서 입수할 수 있는 살모넬라 엔테리카 균주의 게놈 컬렉션을 PanX 분석에 사용했다. 23개의 살모넬라 몬테비데오 균주에 대한 데이터를 포함하여 모든 706개의 살모넬라 엔테리카 균주에 대한 완전한 게놈 데이터가 분석에 사용되었다. 분석 결과, 1.00 cutoff(모든 균주가 공유하는 유전자)를 사용했을 때 전체 유전자 클러스터의 수는 16,257개임을 확인했다. panX 분석 후, 모든 핵심 유전자에서 추출된 SNP를 사용하여 핵심 게놈 계통수를 구축했다. 3개의 균주는 비-몬테비데오 균주로부터 명확하게 분리되지 않아 검증 단계가 필요하였다. 밀접하게 관련된 균주 및 예측 프로그램으로 ATCC 데이터를 검증한 후, 핵심 게놈 계통수 토폴로지에서 볼 수 있듯이 살모넬라 몬테비데오의 20개 균주가 비-몬테비데오 살모넬라 엔테리카 spp.로부터 명확하게 분리되었다(도 1). 이러한 결과는 살모넬라 몬테비데오가 밀접하게 관련된 미생물과 구별되는 진화적 특성을 가지고 있으며 살모넬라 몬테비데오 검출에 특이적인 프라이머 세트를 설계하는 것이 가능함을 나타낸다.
2.2. 팬 게놈 분석을 기반으로 한 프라이머-프로브 설계
16,257개의 유전자 클러스터 중 22개의 살모넬라 엔테리카 subsp. enterica SPI-2 Type III 분비 관련 유전자와 SPI-2 T3SS의 26개 이펙터를 살모넬라 엔테리카의 프라이머 후보로 선택했다. 이 46개의 유전자 클러스터에서 ssaG로 알려진 type III 분비계 침상 단백질이, 보존적 유전자 영역을 의미하는 0.002의 낮은 다양성 때문에 S. enterica 검출을 위한 표적으로 사용되었다. 살모넬라 몬테비데오의 경우, 테일 어셈블리 샤페론으로 분류된 유전자가 표적으로 선택되었는데, 이는 살모넬라의 다른 혈청형에는 존재하지 않았기 때문이다. 이 유전자는 본 연구에서 salM으로 지정되었으며 후속 실험에서 살모넬라 몬테비데오의 검출에 사용되었다. salM 유전자가 E. coli 균주에서 발견되었음에도 불구하고 우리는 위양성 문제가 ssaG를 표적으로 하는 프라이머의 동시 사용으로 간단히 해결될 것이라고 가정했다. 이어서, AlleID7 프로그램을 사용하여 ssaG 및 salM을 표적으로 하는 프라이머 및 프로브 세트를 설계했다(표 1 참조).
2.3. 개발된 프라이머 세트를 이용한 PCR 분석의 민감도 및 특이도
민감도 및 특이도 검사에 앞서 표준곡선을 확인하고, 그래프의 기울기, R2, 효율성을 분석하였다(표 2). ssaG를 표적으로 하는 프라이머를 사용했을 때 100, 150, 200 RFU에 대해 각각 95.9, 95.6, 95.8의 분석 효율을 보였다. salM을 표적으로 하는 프라이머를 사용했을 때 100, 150, 200 RFU에 대해 각각 96.0, 97.3, 97.4의 분석 효율을 보였다. 이후 살모넬라 엔테리카 및 살모넬라 몬테비데오의 검출을 위한 개발된 프라이머의 민감도와 선택성을 확인하였다(표 3, 표 4).
[표 3]
살모넬라 엔테리카에 대한 ssaG 및 salM의 민감도 및 선택성
[표 4]
비-살모넬라 엔테리카에 대한 ssaG 및 salM의 민감도 및 선택성 테스트
프라이머 세트가 광범위한 살모넬라 엔테리카 균주를 선택적으로 검출할 수 있는지 확인하는 것이 중요하다. 살모넬라 엔테리카의 86개 균주(살모넬라 몬테비데오 8개 포함)와 24개의 비-살모넬라 엔테리카 균주를 포함한 총 110개 균주는 10ng/μl DNA 농도로 민감도 및 특이성 테스트에 사용되었다. ssaG를 표적으로 하는 프라이머를 사용한 경우 모든 살모넬라 엔테리카 균주에서 양성 결과를 보인 반면, 모든 비-살모넬라 엔테리카 균주는 음성 결과를 나타내어 위음성 또는 위양성 결과가 없음을 나타낸다. 이로써 상기 프라이머 세트가 위양성 또는 위음성 결과 없이 살모넬라 엔테리카를 선택적으로 검출함을 확인하였다(표 3, 표 4).
상기 결과는 설계된 프라이머 세트가 살모넬라 엔테리카의 정성적 분석 뿐만 아니라 정량적 분석에도 사용될 수 있음을 나타낸다.
또한 프라이머 세트가 광범위한 살모넬라 몬테비데오 균주를 선택적으로 감지할 수 있는지 확인하는 것이 중요하다. salM을 표적으로 하는 프라이머를 사용한 경우 86개의 살모넬라 엔테리카 균주 중 8개의 살모넬라 몬테비데오 균주만이 양성 결과를 보였다. 24개의 비-살모넬라 엔테리카 균주를 검사한 결과 E. coli O157 균주를 제외한 모든 균주가 음성 결과를 보였다. E. coli O157 균주는 salM을 표적으로 하는 프라이머에 대해 위양성 결과를 보였다. 표준곡선 실험을 통해 100, 150, 200 RFU에서 각각 96.0, 97.3, 97.4%의 분석효율을 보임을 확인하였다(표 2). 이러한 결과는 설계된 프라이머 세트가 살모넬라 몬테비데오의 정성적 분석 뿐만 아니라 정량적 분석에도 사용될 수 있음을 나타낸다.
4개 계통군(clades) 모두의 살모넬라 몬테비데오가 검증을 위해 검사되었다는 점은 주목할 만하다. 24개 비-살모넬라 엔테리카 균주를 조사한 결과, E. coli O157:H7 균주만이 예상대로 설계된 프라이머 세트에서 위양성을 나타내었다. 그러나 EHEC에서 선택적으로 살모넬라 몬테비데오를 검출하는 것은 어렵지 않다. 예를 들어, ssaG 및 salM을 표적으로 하는 프라이머 세트를 사용하는 다중 PCR을 확인에 사용할 수 있다. 결과는 살모넬라 몬테비데오 균주가 존재하는 경우 ssaG 및 salM 모두에 대해 양성인 반면, E. coli O157:H7 균주의 경우, salM에 대해서만 양성일 것이다.
식품에서 살모넬라 엔테리카의 검출에 관심이 있는 경우 ssaG를 대상으로 하는 프라이머를 사용하여 민감하고 선택적인 검출을 할 수 있다. 때때로 혈청형을 살모넬라 몬테비데오로 확인하는 것이 필요하다. 이 경우 ssaG 및 salM을 표적으로 하는 프라이머를 동시에 사용하여 혈청형을 선택적으로 검출할 수 있다. 또한, salM은 식품에 대장균이 포함되어 있지 않은 것으로 확인된 경우에만 사용할 수 있다.
2.4. 간섭 물질의 영향 및 식품 시료의 적용 가능성
본원 발명에서 조사된 병원체(살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카)는 잘 알려진 식품 매개 병원체이다. 따라서 이러한 병원체를 식품에서 검출할 수 있는지 확인하는 것이 중요하다. 식품에서 표적 병원체 및 영양/비영양 물질 이외의 다른 미생물이 검출 효능을 방해할 수 있다(Hedman & Rdstrm, 2013). 이와 관련하여 LB, BPW, TSB, PBS, 양 혈액, 토마토 및 닭고기와 같은 간섭 화합물의 효과를 조사했다(표 5).
즉, Luria-Bertani(LB) 배지, 완충 펩톤수(BPW), 트립신 소이 브로쓰(TSB), 인산 완충 식염수(PBS), 양 혈액 및 식품 재료(토마토 및 닭)은 PCR 분석을 방해할 수 있다. 따라서, 살모넬라 엔테리카 및 살모넬라 몬테비데오의 검출에 대한 이들 화합물의 효과는 식품 적용 전에 확인되었다(표 5).
[표 5] 개발된 프라이머-프로브 서열에 의한 살모넬라 엔테리카 또는 살모넬라 몬테비데오의 검출에 대한 간섭 물질의 영향
상기 결과는 LB, BPW, TSB 및 PBS와 같은 완충액 및 농축 용액이 검출 효능을 유의하게 억제하지 않았음을 나타낸다. 이러한 간섭물질이 최대 50% 포함된 시료에서 살모넬라 엔테리카 또는 살모넬라 몬테비데오의 검출이 가능했다. 반면, 양 혈액의 검출 효능은 양 혈액의 5% 이상이 검출 효능을 억제하여 양 혈액에 더 민감하였다. 혈액 시료에 당류, 이온, 지방 등의 성분이 많이 함유되어 있으면 검출 효율에 영향을 미치는 것으로 가정하였다. 식품 샘플을 테스트했을 때 검출 효능에 영향을 미치지 않는 임계값 수준은 토마토 및 닭고기 샘플에 대해 각각 10% 및 25%였다. 이러한 결과는 식품 또는 혈액 샘플의 검출이 이상적인 조건과 다를 수 있음을 나타낸다. 우리의 이전 연구는 또한 50% Enterobacteriaceae Enrichment(EE)가 병원체의 검출을 방해한다고 밝혔다(Lee, Kim, & Kang, 2022). 이와 관련하여 본 출원에서는 토마토, 생닭고기, 후추 및 고추가루 시료에 접종한 검출을 조사하였다(도 2). 토마토와 생 닭고기 샘플에 접종된 병원체는 기존에 사용된 선택적 배지(XLD)와 제안된 프라이머 세트를 사용한 PCR 분석 모두에서 효과적으로 검출되었다. 반면, 고춧가루 및 후추가루는 저농도(2-2.5 log CFU/g)의 병원균을 접종했을 때 검출 효율이 크게 떨어졌다. 따라서 건조시간(24시간)이 더 긴 고춧가루 및 후추가루에 병원균을 접종하여 추가 연구를 진행하였다. 병원균을 고춧가루 및 후추가루에 접종하고 24시간 건조했을 때, 기존에 사용하던 선택배지(XLD)로는 검출하기 어려웠다(표 6). 복구 방법(오버레이 방법, OV)을 사용하여 병원체를 감지할 수 있지만 시간과 노력이 많이 든다.
제안된 프라이머 세트를 기반으로 한 PCR 분석에서는 고춧가루 및 후추가루 시료에서 병원균 검출에 대해 높은 검출효율을 보였다. DNA 추출은 PCR 분석에서 중요한 단계 중 하나이며, DNA 추출 방법이 식품에서 실시간 PCR 분석의 효능에 영향을 미칠 수 있다고 보고된 바 있다(Junior et al., 2016; Pirondini, Maestri, Visioli, Marmiroli, & Marmiroli, 2010).
반면, 후추 시료에 저농도(2.1-4.0 log CFU/g)의 병원균을 접종하면 검출 효율이 떨어졌다. 추가 연구를 위해 추출 방법(가열 및 Genelix 추출 키트) 및 여과가 병원체 검출에 미치는 영향을 확인했다(표 6).
[표 6]
개발된 프라이머 프로브 세트에 기초한 보통의 선택/회수 배지 및 실시간 PCR 분석에서 고춧가루 및 후추(24시간 건조) 중 살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카의 검출
추출 전 여과는 후추 및 고춧가루에서 살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카를 검출하는데 효과적이었다. 여과 없이 가열법으로 DNA를 추출한 경우 개발된 ssaG를 표적으로 하는 프라이머 프로브 세트에서는 살모넬라 엔테리카가 검출되지 않았다. salM을 표적으로 하는 프라이머-프로브 세트의 경우, 살모넬라 몬테비데오는 3건의 시험 중 2건에서 검출되지 않았다. 5μm 필터를 적용했을 때 후추와 고춧가루를 접종한 살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카 모두 PCR 분석에서 검출되었다. 또한, 이 여과는 Genelix 키트로 DNA를 추출할 때 Cq 값을 감소시켜 보다 효율적인 검출을 나타낸다. 예를 들어, 후추에서 살모넬라 몬테비데오를 검출하기 위해 PCR 분석을 통해 얻은 Cq 값은 여과를 적용하여 26.02에서 22.78로 감소했다. 이러한 결과는 후추 및 고춧가루에서 살모넬라 몬테비데오 또는 살모넬라 엔테리카의 DNA를 가열법으로 추출할 때 여과가 필요함을 나타내며, Genelix kit에 의한 DNA 추출에도 권장된다.
위 결과로부터 고춧가루와 후추에 접종한 살모넬라 몬테비데오 및 살모넬라 엔테리카를 모두 검출할 수 있는 중요한 단계가 여과임을 밝혔다. 보다 구체적으로, 여과 후 Genelix 키트를 이용한 DNA를 추출하는 것이 병원체 검출에 가장 효과적이었다. 따라서 설계된 프라이머 세트는 기존에 사용되는 선택적 배지에 비해 고춧가루 및 후추 가루에서 살모넬라 몬테비데오 및 살모넬라 엔테리카를 보다 효과적으로 검출하는 데 사용할 수 있다.
결론적으로, 본 발명의 비교 유전체학을 기반으로 ssaG 및 salM 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트는 각각 살모넬라 엔테리카 및 살모넬라 몬테비데오를 검출하도록 설계되었다. 설계된 프라이머 세트는 특정 병원체의 검출에 대해 높은 감도와 선택성을 가지고 있음을 확인했다. 검출 효능은 LB, BPW, TSB 및 PBS에 의해 유의한 영향을 미치지 않는 반면, 양 혈액, 토마토 및 닭 샘플은 검출 효능을 억제하였다. 또한 제안된 프라이머 세트를 사용하여 토마토, 생닭고기, 고춧가루 및 후추 가루 샘플과 같은 식품의 병원체를 검출할 수 있다. 따라서 본 연구에서 제안한 프라이머 세트는 악명 높은 살모넬라 몬테비데오 및 살모넬라 엔테리카 균주를 선택적으로 검출하기 위해 다양한 분야에 적용될 수 있다.
Claims (18)
- 서열번호 1의 정방향 프라이머, 및
서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는, 살모넬라 몬테비데오(Salmonella Montevideo) 검출용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서, 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향
프라이머를 추가로 포함하는, 프라이머 세트. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 식품 중 살모넬라 몬테비데오(Salmonella Montevideo) 검출에 이용되는, 프라이머 세트.
- 제3항에 있어서, 상기 식품이 고추, 후추, 토마토, 파스타치오 또는 치킨인, 프라이머 세트.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 프라이머 세트가 서열번호 3의 프로브를 추가로 포함하는, 프라이머 세트.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 프라이머 세트가 서열번호 6의 프로브를 추가로 포함하는, 프라이머 세트.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응 수행을 위한 시약을 포함하는, 살모넬라 몬테비데오(Salmonella Montevideo) 검출용 키트.
- 제7항에 있어서, 상기 키트는 식품 중 살모넬라 몬테비데오(Salmonella Montevideo)을 검출하기 위한 키트.
- 서열번호 4의 정방향 프라이머; 및
서열번호 5의 역방향 프라이머를 포함하는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 검출용 프라이머 세트. - 제9항에 있어서, 서열번호 6의 프로브를 추가로 포함하는 프라이머 세트.
- 제9항 또는 제10항에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응 수행을 위한 시약을 포함하는, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 검출용 키트.
- 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 대상 시료에서 살모넬라 몬테비데오(Salmonella Montevideo)를 검출하는 방법. - 제12항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 실시간 PCR을 통해 수행되는, 검출 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 게놈 DNA 분리는 여과를 추가로 포함하는, 검출 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 게놈 DNA 분리는 여과 후 Genelix 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하는 것인, 검출 방법.
- 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제9항 또는 제10항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 대상 시료에서 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)를 검출하는 방법. - 제16항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 실시간 PCR을 통해 수행되는, 검출 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 게놈 DNA 분리는 여과를 추가로 포함하는, 검출 방법.
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