CN103866035B - 一种检测大肠杆菌o157:h7核苷酸片段的引物和探针序列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸片段的引物和探针序列，属于生物和食品检测技术领域。引物包括：由序列为gccaggcaaatatgtttgtga的上游引物pZF和序列为catttggcatttgaacgatgaa的下游引物pZR组成的引物对。探针pZP序列为cctggataccgctactcaaattctgtcaaaat。该套引物和探针根据GenBank上大肠杆菌O157:H7 EDL933（登录号：AE005174）设计，具有较高的灵敏度和特异性。
Description
一、技术领域
本发明属于生物和食品检测技术领域。具体涉及一种用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸的引物和探针序列。
二、背景技术
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)O157:H7是常见的肠道致病菌，感染该菌可引起腹泻、出血性结肠炎，溶血性尿毒综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发症，严重者可导致死亡，致死率达5%～10%。
1982年，Riley等报道了由EHECO157:H7引起的出血性结肠炎的暴发流行，这也是把EHECO157:H7确认为严重致病菌的首次报道。随后在加拿大、日本、英国、澳大利亚等地发生了多起该菌的感染流行。1999年，在我国安徽、江苏两省曾暴发流行O157:H7感染性腹泻，患者超过2万人，死亡177人，流行时间7个月，可能是迄今为止世界上流行规模最大的一次。我国已将EHEC列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。
目前，目前检测EHECO157:H7的方法主要有常规的细菌分离鉴定、基因芯片技术、噬菌体分型技术、脉冲场凝胶电泳分析技术、生物传感器技术、利用单克隆抗体建立的ELISA、乳胶凝集实验、免疫磁分离技术以及胶体金免疫层析试纸条等，但存在操作复杂费时、仪器要求高、灵敏度或特异性不强等缺点。随着分子生物学技术的发展，PCR也被广泛的用到EHECO157:H7疾病的快速诊断中，此方法简单、方便、快速、敏感，但存在假阳性和PCR污染等弊端。而荧光PCR方法技术则是在普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一堆特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测核苷酸的技术，除了具有普通PCR的有点外，还具有更多的优点：其特异性更高，灵敏性更高；全封闭反应，无需PCR产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性；可实现单管双检或多检；不接触有毒试剂，操作简单；有利于规模化、自动化。
我们在前期研究中发现，在不同的产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin E.coli,STEC）菌株中，含有一个共有的ORF编码大肠杆菌O157:H7的标签性基因。
基于以上的研究和当前的需求，申请人根据大肠杆菌O157:H7的特异性基因序列，设计了用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸的引物和探针。
三、发现内容
发明内容
技术问题
本发明目的是提供一种专一性检测大肠杆菌O157:H7核苷酸的引物和探针。
技术方案
本方法采用以下技术方案：
1、一种用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸的引物对，所述的引物对为：由序列为gccaggcaaatatgtttgtga的上游引物pZF和序列为catttggcatttgaacgatgaa的下游引物pZR组成的引物对。
2、一种用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸的探针，所述的探针pZP序列为cctggataccgctactcaaattctgtcaaaat。
上述引物和探针序列用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸片段的方法，该方法不适于疾病诊断检测，包括：
1）待检模板的制备：
粪便或者食物样品10克，加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中;如待检样品为液体，则直接取1mL液体样品加入到9mL心脑浸出液培养基中，培养基中再加入100uL浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco进口分装），37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA；
2）大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR反应体系：
将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪中，按下列反应程序进行扩增，反应过程为：95℃10min，预变性；95℃10s，60℃1min，40个循环，实验结果实时监测。
3）大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR的检测结果判定：经检测，若待检样品中含有大肠杆菌O157:H7，则显示阳性扩增曲线；若待检样品中不含有大肠杆菌O157:H7，则无扩增信号。
4）敏感性试验：选用模拟制备的大肠杆菌O157:H7污染样品分析引物和探针的敏感性。
有益效果
本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶，核苷酸单体等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针两端分别标记荧光报告基团（FAM）和荧光淬灭基团（BHQ1）的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异性结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样品中靶核苷酸序列的存在。
本发明的优点
1、本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达1CFU/mL(g)，说明其具有非常良好的灵敏度。
2、本发明提供的引物和探针对于不含有大肠杆菌O157:H7的样品均无扩增信号，说明具有良好的特异性。
3、由于本发明对已知的大肠杆菌O157:H7基因特有序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的产生。
4、由于本发明采用荧光PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了普通PCR检测常出现假阳性结果的现象。由于对PCR产物进行实时检测，大大节省了检测时间，节约了人力物力。大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR的检测结果证明：经检测，若待检样品中含有大肠杆菌O157:H7则显示阳性扩增曲线（图1），其检测灵敏度可达1CFU/mL；若待检样品中不含有大肠杆菌O157:H7则无扩增信号，提示本发明引物和探针具有良好的灵敏度和特异性。
附图说明
图1是利用引物对pZF/pZR和探针pZP检测大肠杆菌O157:H7阳性牛肉样品的荧光PCR扩增图。
具体实施方式
1、引物和探针设计：通过对大肠杆菌O157:H7特有ORF的基因序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，设计长度一般为20-30个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下：
上游引物pZF：gccaggcaaatatgtttgtga
下游引物pZR：catttggcatttgaacgatgaa
探针pZP：cctggataccgctactcaaattctgtcaaaat
2、反应体系的建立和优化：按照上述煮沸方法提取大肠杆菌O157:H7（购自上海三踏生物科技有限公司）模板DNA，分装后储存于-20℃备用。
2.1引物浓度的优化：在反应体系中其他条件相同的情况下，将大肠杆菌O157:H7的引物分别从0.1μmol/L至1.0μmol/L做连续倍比稀释，通过实验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.4μmol/L。
2.2探针浓度的优化：在反应体系中其他条件相同的情况下，将大肠杆菌O157:H7的探针分别从0.1μmol/L至1.0μmol/L做连续倍比稀释，通过实验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.2μmol/L。
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定大肠杆菌O157:H7实时荧光
PCR反应体系为25μL，反应体系所需各组分及相应浓度：
备注：以上试剂均购买自TaKaRa公司
3.仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所使用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针两端所标记的荧光报告基团相一致，本发明所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团（FAM）和荧光淬灭基团（BHQ1）的寡核苷酸，参照仪器使用说明书设置。
4.PCR反应条件选择如下：95℃10min，预变性；95℃10s，60℃1min，40个循环。
5.检测步骤
5.1选取引物和探针；
5.2制备待测模板，采用常规提取DNA方法提取各种来源样品中的核酸；
5.3反应体系的建立；
5.4上机检测。
6.实施例：
将上述引物和探针用于检测模拟制备O157:H7阳性样品进行验证。
下面所有模拟制备O157:H7阳性样品都是经过免疫磁珠富集（Dynabeads anti-E.coliO157免疫磁珠，购自Invitrogen公司），显色培养基细菌分离（方法参照：牛源O157:H7的分离及毒力因子分析，中国兽医学报，2012，32(8):1148-1153。）证实为O157:H7阴性才可以选用。
6.1污水样品制备：从养殖场采集污水，分装10mL/管，依次加入大肠杆菌O157:H7培养物，终细菌浓度分别为106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、10CFU/mL和1CFU/mL。
6.2牛肉样品制备：从超市购买牛肉泥样品200g，分装10g/管，依次加入大肠杆菌O157:H7培养物，使细菌终浓度分别为106CFU/g、105CFU/g、104CFU/g、103CFU/g、102CFU/g、10CFU/g和1CFU/g。
6.3待检模板的制备：
将上述制备的阳性牛肉样品10g，分别加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h，而后取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中，培养基中再加入100uL浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco进口分装），37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA。
取上述1mL污水样品，加入到9mL心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中，培养基中再加入100uL浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco进口分装），37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000r离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA。
6.4大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR反应的扩增条件：根据上述所需各组分及相应浓度加样，将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪（ABIPrism7500）时，按如下反应程序进行扩增，反应程序为：95℃10min，预变性；95℃10s，60℃1min，40个循环。按照荧光PCR仪（ABIPrism7500）使用程序，实验结果可以实时检测。
6.5大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR的检测结果：经检测，若待检样品中含有大肠杆菌O157:H7则显示阳性扩增曲线（图1），其检测灵敏度可达1CFU/mL（g）；若待检样品中不含有大肠杆菌O157:H7则无扩增信号，提示上述引物和探针具有良好的灵敏度和特异性。
实施例7
上述引物和探针检测临床样品，包括以下步骤：
7.1样品收集：采集牛粪便40份，25-30g/份；集贸市场购买牛肉6份，各250g；蔬菜和水果批发市场，购买菠菜、豆芽、韭菜、荸荠和生菜，各250g，共30份。所有采集和购买样品储存在样品收集袋（南京助研公司）中，密封冷藏保存。
7.2待检模板的制备：
从样品收集袋中取出粪便、牛肉或者蔬菜10克，分别加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基（杭州微生物试剂制品公司）中，培养基中再加入100uL浓度为50mg/mL新生霉素（Ameresco进口分装），37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000r离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA。
7.3大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR反应体系：
将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪中，按下列反应程序进行扩增，反应过程为：95℃10min，预变性；95℃10s，60℃1min，40个循环，实验结果实时监测。
7.4大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR的检测结果判定：经检测，若待检样品中含有大肠杆菌O157:H7则显示阳性扩增曲线；若待检样品不含有大肠杆菌O157:H7则无扩增信号。上述所有样品共计76份，大肠杆菌O157:H7阳性12份，其中粪便阳性9份，荸荠阳性1份，菠菜阳性2份。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种检测大肠杆菌O157:H7核苷酸片段的引物和探针序列
<130> 0
<160> 3
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 上游引物pZF
<222> (1)..(21)
<223>
<400> 1
gccaggcaaa tatgtttgtg a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 下游引物pZR
<222> (1)..(22)
<223>
<400> 2
catttggcat ttgaacgatg aa 22
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 探针pZP
<222> (1)..(32)
<223>
<400> 3
cctggatacc gctactcaaa ttctgtcaaa at 32
Claims (2)
1.一种用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸片段的引物和探针序列，引物包括：
上游引物pZF：gccaggcaaatatgtttgtga
下游引物pZR：catttggcatttgaacgatgaa；
探针pZP：cctggataccgctactcaaattctgtcaaaat。
2.权利要求1所述引物和探针序列用于检测大肠杆菌O157:H7核苷酸片段的方法，该方法不适用于疾病诊断检测，包括：
1）待检模板的制备：
取粪便或者食物10克，加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃震荡2h后，取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中；如待检样品为液体，则直接取1mL加入到9mL心脑浸出液培养基中，培养基中再加入100 uL 浓度为50mg/mL新生霉素，37℃继续培养18h，吸取1mL培养物，500 r离心15min，弃沉淀，吸取上清至新离心管，12000r离心10min，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10min，4℃12000转离心10min，吸取上清，即检测用模板DNA；
2）大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR反应体系：
组分 用量/终浓度
Premix EX Taq 2× 12.5μL
引物 0.4μmol/L
探针 0.2μmol/L
Rox II 0.5μL
模板 1μL
ddH2O 9.5μL
将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪中，按下列反应程序进行扩增，反应过程为：95℃ 10min，预变性；95℃ 10 s，60℃ 1min，40个循环，实验结果实时监测；
大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR的检测结果判定：经检测，显示阳性扩增曲线，则待检样品中含有大肠杆菌O157:H7；无扩增信号，则待检样品不含有大肠杆菌O157:H7。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 巢强国等.PCR法检测食品中大肠杆菌O157:H7.《食品科学》.2010,第31卷(第8期), * |
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