CN101570783B - 水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；该PCR反应液含10mM Tris·HCl、50mMKCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM及9种致病性微生物的引物对。本发明可同时检测水产品中9种致病微生物，并可检至沙门氏菌11CFU/mL，金葡菌2000CFU/mL，单增120CFU/mL，肠出血性大肠杆菌O157：H7 6CFU/mL，霍乱弧菌220CFU/mL，副溶血性弧菌60CFU/mL，创伤弧菌9CFU/mL及溶藻弧菌230CFU/mL。并且检侧耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。

Description

水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及食品中病原微生物的检测方法，尤其涉及利用多重PCR及变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测水产品中多种致病性微生物的方法。还涉及检测所使用的组合物，即试剂盒。

背景技术

随着生活水平的提高以及我国加入WTO后市场逐步开放，人们对水产品的需求不断增大，同时水产品的进出口贸易也在扩大。水产品中可能存在多种能够引起人类肠道疾病的细菌，弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌等都是水产品中常见的致病菌菌。种类多、数量少、难于富集和体外培养是食源性致病菌的特点，也决定它们一直是微生物检测中的难点和空白点。现有的检测技术如微生物培养和生化鉴定、免疫学技术、PCR技术等均存在一些问题：常规的生化鉴定方法操作复杂，耗时长，往往一次检测实验只能鉴定一种或少数几种细菌；免疫学技术虽灵敏性高，但易污染，经常出现假阳性现象；PCR技术一般要与凝胶电泳技术联用，而电泳结果不能作为最终结论，还需要进行其他探针杂交实验。目前对食源性微生物的检测还主要依靠传统的增菌、分离、生化鉴定方法。这类方法普遍费时费力、检测周期长、灵敏度低。比如沙门氏菌传统检测方法要用12种培养基，20多个大小步骤，操作比较复杂，工作量很大，从取样到出检验报告耗时至少6～8个工作日。而对于一些生化特性复杂的细菌，如单增李斯特氏菌，由于其对培养条件要求高，生长缓慢，检测和鉴定周期长，并且传统培养生化检测方法检出率不高，最长的检测周期可达20天之久。此外，长期以来由于弧菌属细菌的生化特征不稳定，食品中的弧菌检测也是食源性微生物检测的一大难点。目前对食品中常见致病性弧菌的检测，主要应用生化反应进行鉴定。丁茂文等在研究中发现，API 20E和20NE生化鉴定方法对副溶血弧菌、拟态弧菌、非O1群霍乱弧菌等某些细菌的鉴定易产生错误结果。PCR-凝胶电泳检测方法虽然检测成本低，但反应产物电泳处理极易造成污染；特异性强，灵敏度高的实时荧光PCR方法，存在检测成本较高，荧光探针保存时间较短等问题。

食源性微生物检测所面临的另一个问题是高通量检测的问题。由于水产品中往往存在多种致病菌。因此同时检测多种致病菌的技术也急需发展。上文中述及的微生物检测方法均难以实现此目的。目前国内外关于食品中微生物高通量检测技术，有RiboPrinter全自动细菌鉴别系统(BAX系统)和基因芯片检测技术。前者及其所使用的试剂和耗材均极其昂贵，不易推广应用；后者需要特殊实验室条件来完成，并且检测结果受多种因素影响，重复性和稳定性较差。变性高效液相色谱(DHPLC)采用离子对反相高效液相色谱的原理，是通过使用特殊的耐高温液相色谱分离柱同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段分子进行分析分离的方法。该技术的发明为生命科学领域里的核酸分析提供了方便实用的技术平台。其快速高通量、全自动化操作、准确度高、重复性好及敏感性高的优点使其在核酸分析中具有无可替代的优势。该技术在已知和未知基因突变的检测和筛选、基因分型、基因定量和长度多态性分析等领域已经得到广泛应用。

本发明即旨在利用mPCR和DHPCL技术，建立可快速、灵敏、高通亮检测水产品中9种常见的病源性微生物的快速检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于灵敏快速检测水产品中9种常见的病源性微生物，即霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌的mPCR-DHPLC检测试剂盒。

本发明所述的试剂盒包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；其中的PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM及9种致病性微生物的引物对，所述的引物序列及其浓度如下：

试剂盒保存条件：-20℃保存。

本发明还提供了利用上述试剂盒检测上述这9种致病性微生物的方法，包括如下步骤：

①取2μl待测样品DNA溶液，加入10μl试剂盒中的PCR反应液、0.2μLTaq DNA聚合酶及灭菌超纯水7.8μL，总体积20μL；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行多重PCR扩增：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；

终止延伸：72℃，7min；

PCR产物4℃保存；

②将多重PCR产物进行DHPLC分析，DHPLC分析条件如下：

色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相(体积比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B，

                3.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B，

                6.2min，41.8％缓冲溶液A，58.2％缓冲溶液B，

                8.4min，38.2％缓冲溶液A，61.8％缓冲溶液B，

                10.4min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B，

                12.4min，35.0％缓冲溶液A，65.0％缓冲溶液B，

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物10μL。

检测结束后，检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品结果为阴性，直接报告未检出相对应的致病菌；检测样品出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3mV时，可判定该样品结果为可疑阳性；检测样品出现典型的PCR产物吸收峰，但吸收峰值小于3mV时，建议样本重做。重做结果峰吸收值仍小于3mV则为阴性，否则为可疑阳性。

本发明采用mPCR-DHPLC技术，针对水产品中9种致病性微生物建立灵敏便捷的检测方法，并建立应用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测水产品中9种常见的病源性微生物，即霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌，并且检侧耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。

附图说明

本发明附图6幅，分别是：

图1是实施例1的mPCR-DHPLC检测结果；

图2是灵敏度试验结果谱图；

图3是精密度试验结果谱图，不同批次培养物；

图4是精密度试验结果谱图，同一批次培养物；

图5是应用于霍乱弧菌和副溶血性弧菌阳性样品检测结果谱图；

图6是应用于单增李氏菌和沙门氏菌阳性样品检测结果谱图；

上述附图中，横坐标均为保留时间(单位：分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度(单位：毫伏mV)。

具体实施方式

下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。

若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器及其商品来源为：细菌基因组DNA小量纯化试剂盒(TakaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extractionkit)、Taq酶及PCR缓冲液等试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；三乙胺乙酰盐(TEAA，色谱纯)购自Transgenomic公司；乙腈(色谱纯)购自Fisher公司；普通PCR仪PE24000(PerkinElmer公司，美国)；变性高效液相色谱仪NAV-99-4500(Transgenomic公司，美国)；高速离心机centrifuge 5804(Eppendorf公司，德国)。

本专利研究所用标准菌株均购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)，见表1。各菌株使用菌种保存管-80℃保存，活化培养等均按照相关的国家标准(GB)、检验检疫行业标准(SN)或国际权威标准方法进行。

表1、试验菌种及其编号

实施例1、水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及其检测方法

(1)引物的设计、合成与试剂盒的组装：

本实施例确定用于检测的引物序列及扩增片段长度如表2所示：

表2

在此基础上设计用于mPCR-DHPLC检测的试剂盒。该试剂盒中包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；其中的PCR反应液中含10mMTris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM及上述9种致病性微生物的引物对(浓度如表2所示)。

(2)mPCR-DHPLC检测方法的建立：

本检测方法使用本实施例建立的检测试剂盒，包括如下步骤：

①待检样品的制备：采用试剂盒提取法制备待测样品DNA基因组：

a、食品样品：

以无菌操作取水产品2个25g(剪取样品的部位参照国标方法)，粉碎后加入装有225mL双料BPW和双料3％NaCl蛋白胨水的无菌三角瓶或拍击式均质袋中，摇晃3～5min或拍击1min，将三角瓶或均质袋封口后在36℃培养4～6h(水产品在冷藏或冷冻条件下保存10天之内的需要培养4h；保存时间在10天以上的需要培养6h)。从增菌肉汤中取出10mL加入到装有10mL双料BPW和双料3％NaCl蛋白胨水的试管中，混匀后在36℃培养18～24h。

使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-20℃保存。

b、标准菌株：挑取单个菌落于营养肉汤中培养18～24h，使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-20℃保存。；

②PCR扩增：

取2μl待测样品DNA溶液，加入10μl试剂盒中的PCR反应液、0.2μL TaqDNA聚合酶及灭菌超纯水7.8μL，总体积20μL；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；

终止延伸：72℃，7min；

PCR产物4℃保存待测；

③将PCR产物进行DHPLC分析，DHPLC分析条件如下：

色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相(体积比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B，

                3.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B，

                6.2min，41.8％缓冲溶液A，58.2％缓冲溶液B，

                8.4min，38.2％缓冲溶液A，61.8％缓冲溶液B，

                10.4min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B，

                12.4min，35.0％缓冲溶液A，65.0％缓冲溶液B，

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物10μL。

本实施例的mPCR-DHPLC检测结果如附图1所示。

实施例2、特异性试验

取表1中所有参考菌株按照实施例1所述的方法提取基因组DNA，建立模板库。然后以这些基因组DNA为模板，按照实施例1所述的方法进行mPCR扩增及DHPLC检测。结果显示：采用实施例1的检测试剂盒及检测方法一次性mPCR-DHPLC检测水产品中9种致病性微生物，特异性强，没有假阳性和假阴性结果。

实施例3、灵敏度试验

按照实施例1所建立的方法增菌方法，用比浊法定量所培养的复合增菌的菌液浓度：首先用麦氏比色管试剂盒制作OD550值——每mL菌液里的细菌个数的标准曲线，再测定所培养菌液的OD550值，将OD550值代入标准曲线，得到所培养菌液的浓度，单位为CFU/mL。将致病菌的增菌肉汤进行系列稀释得到10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10的菌液，然后按照复合增菌方法进行增菌。按照实施例1所建立的方法提取不同梯度的复合增菌的菌液DNA，各取2μL做为模板，按照实施例1所建立的方法进行mPCR-DHPLC检测，将检测结果与稀释梯度结果比较，确定检测灵敏度。表3为致病菌在不同稀释度下的细菌数量。

表3、复合增菌液梯度稀释细菌数量表

使用实施例1所建立的方法，分别加入2μL的模板DNA依然能经PCR-DHPLC检测出典型的阳性吸收峰，结果如附图2所示。该结果表明，本方法的灵敏度非常高，可以检测到沙门氏菌11CFU/mL，金葡菌2000CFU/mL，单增120CFU/mL，肠出血性大肠杆菌O157:H7可检测到6CFU/mL，霍乱弧菌220CFU/mL，副溶血性弧菌60CFU/mL，创伤弧菌9CFU/mL，溶藻弧菌230CFU/mL。

实施例4、精密度试验

在不同批次培养的增菌液之间，取表3中制备的L04和L07浓度的菌液，按照实施例1所建立的方法进行10次重复DNA提取及PCR-DHPLC检测，确定检测精密度。精密度试验结果如附图3所示。

在同批次培养的复合增菌液不同批次提取的DNA之间，取表3中制备的L04和L07浓度的复合增菌液，按照实施例1所建立的方法进行10次重复DNA提取，及PCR-DHPLC检测，确定检测精密度。精密度试验结果如附图4所示。

精密度试验结果表明，在不同批次培养的菌液之间和同批次培养的菌液不同批次提取的DNA之间用本发明的检测试剂盒进行PCR-DHPLC检测结果无统计差异，灵敏度和检测稳定性都能很好的保证。

实施例5、应用于实际样品检测试验

自2007年12月至2008年10月的7个月期间，采用实施例1所建立的水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及其检测方法、同时采用检验检疫行业标准的培养鉴定方法、PCR法和实时荧光PCR法进行验证比较，同时检测实际样品。共检测水产品4356种样品，其中包括鳕鱼、马哈鱼、鲽鱼等各种鱼类3071种样品，杂色蛤、扇贝、贻贝等753种贝类样品，虾蟹、水样等532种样品。结果表明，采用实施例1的方法筛选检出的81份阳性样本，其中检出金黄色葡萄球菌64份，5份样品检出副溶血弧菌，3份样品检出单核细胞增生李斯特氏菌，1份样品检出霍乱弧菌，1份样品检创伤弧菌，7份样品检出沙门氏菌，采用经典的生化方法进行验证，均证实多重PCR-DHPLC标准方法检出为阳性。

几种检测方法的检测结果比较如下表所示：

表4.4种方法验证检测的比较结果

丹东口岸国境外环境水体共采集水样检测中，其中有2份样品已证实同时检出霍乱弧菌和副溶血性弧菌。用实施例1所建立的检测试剂盒及检测方法检测这2份样品，检出2份样品霍乱弧菌和副溶血性弧菌阳性，DHPLC检测结果如附图5所示。留存样品中，其中有3份样品已证实同时检出单核细胞增生李氏菌和沙门氏菌。用实施例1的方法检测这3份样品，检出3份样品单核细胞增生李氏菌和沙门氏菌阳性。

取从样品中分离出的所留存的霍乱弧菌和副溶血性弧菌分离株，按照实施例1的方法试验。结果如附图5所示，霍乱弧菌和副溶血性弧菌均经DHPLC检测到了扩增吸收峰，且出峰时间和峰型重现性较好。

取从样品中分离出的所留存的单核细胞增生李氏菌和沙门氏菌分离株，按照实施例1的方法试验。结果如附图6所示，单核细胞增生李氏菌和沙门氏菌均经DHPLC检测到了扩增吸收峰，且出峰时间和峰型重现性较好。

本实施例中，使用的GB/T 4789.4，GB/T 4789.7，GB/T 4789.10，GB/T 4789.3，SN 0170，SN 0172，SN/T 0184.1，SN/T 0973，SN 0173，SN/T 1022，NMKLNo.156，方法，检测每个样品平均总耗时(包括样品制备)96h，检测耗时(不包括样品制备)94h；使用mPCR-DHPLC方法，检测每个样品平均总耗时(包括样品制备)25h，检测耗时(不包括样品制备)0.5h。

培养鉴定法参考的国标/行标号：

GB/T 4789.4食品微生物检验沙门氏菌检验；

GB/T 4789.7食品微生物检验  副溶血性弧菌检验；

GB/T 4789.10食品微生物检验  金黄色葡萄球菌检验；

GB/T 4789.30食品微生物检验  单核细胞增生李斯特氏菌检验；

SN 0170出口食品中沙门氏菌检验方法；

SN 0172出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法；

SN/T 0184.1进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法；

SN/T 0973进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌O157:H7检验方法；

SN 0173出口食品中副溶血性弧菌检验方法；

SN/T 1022出口食品中霍乱弧菌检验方法；

NMKL No.156食品中致病性弧菌的检测和计数。

SN/T 1870-2007食品中致病菌检测方法-实时PCR法；

SN/T 1869-2007食品中多种致病菌快速检测方法-PCR法。

SEQUENCE LISTING

<110>郑，秋月

<120>水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及检测方法

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<170>PatentIn version 3.3

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Claims (2)

1.水产品中9种致病性微生物检测试剂盒，其特征在于包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；其中的PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM及9种致病性微生物的引物对，所述的引物序列及其浓度如下：

试剂盒保存条件：-20℃保存。

2.水产品中9种致病性微生物的检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤：

①取2μl待测样品DNA溶液，加入10μl试剂盒中的PCR反应液、0.2μLTaq DNA聚合酶及灭菌超纯水7.8μL，总体积20μL；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；

终止延伸：72℃，7min；

PCR产物4℃保存；

②将PCR产物进行DHPLC分析，DHPLC分析条件如下：

色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

按照体积比，流动相的组成为：

0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B，

3.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B，

6.2min，41.8％缓冲溶液A，58.2％缓冲溶液B，

8.4min，38.2％缓冲溶液A，61.8％缓冲溶液B，

10.4min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B，

12.4min，35.0％缓冲溶液A，65.0％缓冲溶液B，

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物10μL。

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