CN1967234A - 食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的pcr检测方法 - Google Patents
食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的pcr检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,其特征在于:其检测步骤为:待检测的样品经二次增菌后,采用水煮法提取弧菌基因组DNA,然后经PCR反应后,再经电泳、染色、漂洗,最后用凝胶成像仪观察结果并拍照,最后经过谱图分析即可得出检测结果。本发明的优点在于:可同时检测食品中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌,可以在不影响检出率的条件下加快检测速度,减少工作量和检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法。
背景技术
目前,国内关于致病性弧菌的检测方法还是传统的微生物学检测方法,尚不够完善,每种检测方法仅能检测一种致病性弧菌,而国外的传统微生物学检测方法(如FDA、AOAO、ISO等)也是以单一或少数目标菌为目的设计的程序。因此,几乎每检测一种致病性弧菌都需配制不同的培养基和试剂,耗时又耗力。在分子生物学检测方法方面,FDA2004标准仍是以检测一种致病性弧菌为目的设计PCR程序,检测不同的弧菌需要不同的反应条件。国内的检测人员设计PCR检测方法时也是以毒力基因为待扩增序列,而且关注的大都是O1型和O139型霍乱弧菌与副溶血弧菌,PCR方法检测创伤弧菌的报道只有2000年有过1例,拟态弧菌、至今仍未见到过。
除了常见的霍乱弧菌和副溶血弧菌外,许多国家已开始关注其它致病性弧菌在食物中的存在。目前,由于在水产品检测中经常是一份样品同时检测几种致病性弧菌,因此,有必要研究一种方法,可同时检测多个致病性弧菌。这样,可以在不影响检出率的条件下加快检测速度,减少工作量和检测成本,以适应加入WTO后的新的形势需求,与国际方法接轨。
发明内容
本发明提供了一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,其优点在于:可同时检测以上三种致病性弧菌,在不影响检出率的条件下加快检测速度,减少工作量和检测成本。
本发明所提供的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,其特征在于:其检测步骤为:待检测的样品经二次增菌后,采用水煮法提取弧菌基因组DNA,然后经PCR反应后,再经电泳、染色、漂洗,最后用凝胶成像仪观察结果并拍照,最后经过谱图分析即可得出检测结果。
本发明所提供的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,采用霍乱弧菌的胶原酶基因(vcc,AE004243)、拟态弧菌的溶血素基因(vmh,VMU68271)和副溶血弧菌的不耐热溶血毒素基因(tlh)为一组检测霍乱弧菌、拟态弧菌和副溶血弧菌(三重PCR),检测出霍乱弧菌后再以vcc、霍乱肠毒素基因(ctx,AF516349)为一组确定霍乱弧菌是否具有霍乱肠毒素基因(V.c二重PCR)。其优点在于:可同时检测以上三种致病性弧菌,可以在不影响检出率的条件下加快检测速度,减少工作量和检测成本。
附图说明
图1为本发明的流程图。
图2为本发明的引物序列表图。
图3为本发明的V.c、V.m和V.p三重PCR检测结果示意图。
图4为本发明的V.c.的二重PCR检测结果示意图。
图5为本发明两份实施例的PCR检测结果图。
其中,图3中,1:从上到下三个条带依次为:副溶血弧菌产生的450bp的条带、拟态弧菌产生的243bp的条带和霍乱弧菌产生的155bp的条带;2:霍乱弧菌产生的155bp的条带;3:拟态弧菌产生的243bp的条带;4:副溶血弧菌产生的450bp的条带;5:阴性对照;6:Marker(100bp-1000bp)。
图4中,1:非O1/非O139群霍乱弧菌产生的155bp的条带;2:从上到下依次为O1/O139群霍乱弧菌产生的708bp的条带和155bp的条带;3:溶藻弧菌没有产生条带;4:阴性对照;5:Marker(100bp-1000bp)。
图5中,1:第一份甲鱼蛋,2:第二份甲鱼蛋,3:第三份甲鱼蛋,4:第四份甲鱼蛋,5:第一份墨鱼,6:第二份墨鱼,7:第三份墨鱼,8:霍乱弧菌、拟态弧菌和副溶血弧菌,9:阴性对照,10:100bp Marker。
具体实施方式
本发明所提供的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,其特征在于:其检测步骤为:待检测的样品经二次增菌后,采用水煮法提取弧菌基因组DNA,然后经PCR反应后,再经电泳、染色、漂洗,接着用凝胶成像仪观察结果并拍照,最后经过谱图分析即可得出检测结果。
所述的二次增菌,包括第一次增菌和第二次增菌,所述的第一次增菌,其操作步骤为:在无菌条件下,取充分剪碎的样品,加入盛有9倍量的3%的NaCl碱性蛋白胨水的灭菌容器内,在37℃±3℃条件下培养4h~15h,所述的第二次增菌,其操作步骤为:吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3%NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内,在37℃±3℃条件下培养4h~15h。
所述的水煮法提取弧菌基因组DNA,其操作步骤为:取培养的菌液加入离心管中,以13000rpm离心1min,弃上清液,然后加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀,振荡混匀后,96-100℃水浴10min,12000rpm离心5min,取上清液作为DNA模板,-20℃环境下储存备用。
所述的PCR反应为先做三重PCR反应,检出霍乱弧菌后再做V.c二重PCR反应。其中,三重PCR反应反应体系为:H2O:12.3μl,Buffer:2.6μl,dNTP:0.5μl,引物Pn:(0.4*6)μl,Taq酶:0.2μl,模板DNA:2.0μl,总体积为20μl,所述的V.c二重PCR反应,其反应体系为:H2O:12.5μl,Buffer:2.6μl,dNTP:0.5μl,Pvcc:(0.4*2)μl,Pctx:(0.7*2)μl,Taq酶:0.2μl,模板DNA:2.0μl,总体积为20μl。PCR反应循环参数为:94℃预变性3min;然后94℃变性1min,60℃退火1min,72℃复性1min循环35次,最后72℃延伸7min。
所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳,其操作步骤为:PCR反应结束后以98V电压2.5%凝胶电泳90min。
所述的染色为在溴化乙锭溶液中染色20min。
所述的谱图分析包括阳性对照和阴性对照,对于谱图中是否有相应特征位置条带的出现,即可判别被检测对象中是否有霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的存在。
以下结合具体实施例子说明:
实施例一:墨鱼的检测
1.无菌操作,取25g面包虾样品,充分剪碎,加入盛有225ml 3%NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内,37℃±1℃条件下培养4h~15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3%NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内,37℃±1℃条件下培养4h~15h。
3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液,加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min,弃上清。
4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀,振荡混匀,100℃水浴10min。
5.12000rpm离心5min,取上清作为DNA模板,-20℃备用。
6.加样,做PCR
7.取10μl PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。
8.EB染色20min,漂洗,拍照。
9.分析谱图:
实施例二:甲鱼蛋的检测
1.无菌操作,取25g文蛤样品,充分剪碎,加入盛有225ml 3%NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内,37℃±1℃条件下培养4h~15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3%NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内,37℃±1℃条件下培养4h~15h。
3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液,加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min,弃上清。
4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀,振荡混匀,100℃水浴10min。
5.12000rpm离心5min,取上清作为DNA模板,-20℃备用。
6.加样,做PCR
7.取10μl PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。
8.EB染色20min,漂洗,拍照。
9.分析谱图:
针对上述两个实施例的谱图分析:根据图5可见,在四份甲鱼蛋中,只有第三份产生了155bp的特征条带,说明第三份含霍乱弧菌,三份墨鱼全部产生了450bp的特征条带,说明三份墨鱼中全部含有副溶血弧菌。
Claims (9)
1.一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,其特征在于:其检测步骤为:待检测的样品经二次增菌后,采用水煮法提取弧菌基因组DNA,然后经PCR反应后,再经电泳、染色、漂洗,接着用凝胶成像仪观察结果并拍照,最后经过谱图分析即可得出检测结果。
2.根据权利要求1所述的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的二次增菌,包括第一次增菌和第二次增菌,所述的第一次增菌,其操作步骤为:在无菌条件下,取充分剪碎的样品,加入盛有9倍量的3%的NaCl碱性蛋白胨水的灭菌容器内,在37℃±3℃条件下培养4h~15h,所述的第二次增菌,其操作步骤为:吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3%NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内,在37℃±3℃条件下培养4h~15h。
3.根据权利要求1所述的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的水煮法提取弧菌基因组DNA,其操作步骤为:取培养的菌液加入离心管中,以13000rpm离心1min,弃上清液,然后加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀,振荡混匀后,96-100℃水浴10min,12000rpm离心5min,取上清液作为DNA模板,-20℃环境下储存备用。
4.根据权利要求1所述的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的PCR反应为先做三重PCR反应,检出霍乱弧菌后再做V.c二重PCR反应。
5.根据权利要求4所述的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的三重PCR反应,其反应体系为:H2O:12.3μl,Buffer:2.6μl,dNTP:0.5μl,引物Pn:(0.4*6)μl,Taq酶:0.2μl,模板DNA:2.0μl,总体积为20μl,所述的V.c二重PCR反应,其反应体系为:H2O:12.5μl,Buffer:2.6μl,dNTP:0.5μl,Pvcc:(0.4*2)μl,Pctx:(0.7*2)μl,Taq酶:0.2μl,模板DNA:2.0μl,总体积为20μl。
6.根据权利要求4所述的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的PCR反应循环参数为:94℃预变性3min;然后94℃变性1min,60℃退火1min,72℃复性1min循环35次,最后72℃延伸7min。
7.根据权利要求1所述的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳,其操作步骤为:PCR反应结束后以98V电压2.5%凝胶电泳90min。
8.根据权利要求1所述的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的染色为在溴化乙锭溶液中染色20min。
9.根据权利要求1所述的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的谱图分析包括阳性对照和阴性对照,对于谱图中是否有相应特征位置条带的出现,即可判别被检测对象中是否有霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的存在。
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