CN1934268A - 检测微生物的质量保证体系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测可繁殖的微生物的质量保证体系,其包括a)按国际药典(例如欧洲药典)、食品法规、化妆品规定或按市场通用的间接方法,在标准条件下经相当于8-24小时的“过夜培养”以浓集在样品中的微生物,b)用于检测可过滤的和/或不可过滤的产品中存活的、受损的或死亡的微生物的试剂盒,其包括:i)至少一种试剂,其含有诱导体和在活细胞情况下导致形成特异性酶的荧光剂,该酶通过与特异性荧光染色剂反应释放出可被检测的荧光色素,ii)至少一种经就地杂交的用于检测微生物的核酸探针,其中该核酸探针结合在荧光标记物上,其对可繁殖的微生物的检出极限<10CFU/g。本发明还涉及本发明的质量保证体系的应用和使用本发明的质量保证体系来检测可过滤的和/或不可过滤的样品或产品中的活的、受损的或死亡的微生物的方法。
Description
发明领域
本发明涉及微生物的检测的领域和可过滤的和/或不可过滤的产品的定性检查以及生产装置的卫生状态的评定。
背景技术
仅通过耗时的培养和随之而来的扩增来鉴定产品中的微生物需花费长时间,其中所需结果要在1-2周后才得出。例如对细菌、真菌和单细胞藻类要在各有利的营养介质中进行培养。
在监控中要检查在成品中每单位体积有多少微生物和哪种微生物。这时特别关注的是会引起中间产品或成品有害污染的可繁殖的微生物。
经典的方法例如是膜滤法,其中该样品经培养和过滤,并且微生物保留在膜上。在该膜上繁殖和鉴定该微生物。其它方法是载体样品法(Standprobe)和有时也是PCR(聚合酶链反应)法。但因为PCR法对”裸”DNA会呈阳性,所以这时常会导致错误的阳性结果。
所有这些方法的缺点在于,样品的处理非常耗时,并且最快也得几天至几周后才能知结果。
己知方法的继续研究例如导致一些方法,这些方法通过所谓的“直接表面荧光过滤器技术(DEFT)”可直接鉴定可过滤的产品如饮料中的活细胞,方法中将可连结在DNA上并阻断RNA合成的荧光染料引入细胞中,并通过表面荧光显微镜术检测该细胞(Kroll,R.;Methods in Molecular Biology;1995;46;S 113-121)。在EP 386051或DE 19841588中例如描述如何可通过应用诱导体以在存活的微生物中形成某些酶并接着加入可通过与所形成的酶反应而发生荧光的荧光剂并然后可进行检测而改型DEFT方法。但这种方法仅针对大肠菌或乳杆菌的检测进行描述的。此外,在所有己知的变型中的DEFT-方法仅应用于可过滤的产品,这是一个大的缺点。在该方法中还存在检出极限问题。每单位表面积必须至少数出10-1000个细菌。但在样品中这样高的微生物数不符合现今的卫生要求,以致需要一种能快速而又无需高耗费地检测出样品中较少量的微生物的体系。
对不可过滤的产品,在现有技术中存在一种方法,该方法通过就地与发荧光的核酸探针相杂交以检测特定的微生物。称为“FISH-荧光就地杂交法”的这种方法可用于检测和定位细胞中的各类核酸。借助于标记的RNA-探针或DNA-探针进行与染色体中存在的DNA/RNA的分子杂交。(FISH;Amann,R.L.,W.Ludwig und K.-H.Schleifer,1995.Phylogenetic identificationand in situ detection of individual microbial cells without cultivation.Microbial.Rev.59,S.143-169;也可参看DE 10160666)。该探针的特定杂交是通过荧光显微镜技术证实,如描述于DE 19936875中。
该FISH-技术基于在细菌细胞中存在某种分子,该分子由于其在进化过程中的极其重要的功能仅很少突变:16S和23S核蛋白体核糖核酸(rRNS)。该两者是核糖体的成分,即蛋白生物合成的位点,并且由于其到处生长的蔓延、其大小和其结构和功能性常数可用作特异性标记。因此可应用rRNA数据库来构建种类特异和种属特异的基因探针。这时可相互比较所有可用的rRNA序列,并拟定某些序列位置探针,其特异地检测一种细菌类、细菌种属或细菌族。
在FISH-技术中,将在核糖体的靶序列上的某区域进行互补的基因探针引入该细胞中。该基因探针通常是小的即16-20个碱基长度的单股脱氧核糖核酸段,并对准对细菌类或细菌族是典型的靶区。如果荧光标记的基因探针在细菌细胞中找到靶序列,则在其上结合,并该细胞由于其荧光就可在荧光显微镜中检测。
但研究证明,在此方法中会由于大的种群波动出现取样时的统计学问题。这里还存在检出极限的困难,因为这里每单位面积必须至少数出10-1000个细菌,以得到有说服力的结果。但在样品中这样高的微生物数目不符合现今的卫生标准。
虽然按国际药典(欧洲药典)<100CFU/g的检出极限还是合格的并对产品销售是足够的,但现今工业生产商和用户期望低得多的检出极限或现今对产品的卫生要求是如此高,以使检出极限<10CFU/g是不可避免的,并应力求检出极限为<1CFU/g。
用于检测和定量微生物的方法必需是越来越灵敏和操作更合意,以对尽可能多的不同微生物满足其具有高效的、低检出极限和低耗费的快速检测方法的要求。如果首先仅进行“筛除检验(Abwesenheitstest)”(是/否-检验)和在确定分类前检验在样品中是否含有主要微生物,则这常常是足够的。如果对不同的微生物必需应用许多检测方法或必需从市场上提供的不同方法中选用各最有效的,则就太耗时和要求太多的实验室工作量。
本发明的目的在于提供一种体系,其既可检验可过滤的也可检验不可过滤的样品和产品,并可通过快速方法定量检测不同的存活的和死亡的微生物。本体系在所选的样品量中以<10CFU/g的检出极限检测微生物。该体系不仅应特异地用于生物,也对样品和产品中的微生物提供一般检测,用这体系也可检测生产设备的卫生状态。
发明内容
本发明提供一种用于检测可繁殖的微生物的质量保证体系,其包括:
a)一种按国际药典(例如欧洲药典)、食品法规、化妆品规定或按市场通用的间接方法如测定微生物生长时产生的CO2的间接方法,在标准条件下经相当于8-24小时的“过夜培养”以在样品中浓集微生物的体系,
b)用于检测可过滤的和/或不可过滤的产品中的存活的、受损的或死亡的微生物的试剂盒(来自英语=组装合,组装套),其包括:
i)至少一种试刘,其含有一种诱导体和一种在活细胞情况下导致形成某种酶的荧光剂,该酶通过与特异性荧光剂反应释放出可检测的荧光色素,
ii)至少一种经就地杂交的用于检测微生物的核酸探针,其中该核酸探针结合在荧光标记物上,
其对可繁殖的微生物的检出极限达到<10CFU/g。
在通常的检验方法中,一般取样为0.1g和最大为1g,并进行检验。这时出现极限的统计问题,并在理想情况下应检验尽可能大的试样体积。但通常的检验方法仅可取上述数量级的样品量。
以“过夜培养”的培养相应于在国际药典、食品法、化妆品规定所规定的标准方法之一。过夜培养特别是指将样品培养8-24小时,优选10-20小时,尤其是12-15小时。该培养的标准条件取自有关法律文本。但用于培养的标准方法的微小偏差例如在营养介质成分的浓度、温度或其它参数方面的偏差应包括在本发明的质量保证体系中。在法律文本中的可能改变也可用于本发明的体系。但该条件必需各以文件证明,由此可确定可繁殖微生物的检出极限。因此使用的样品量是很重要的。
作为代替国际药典、食品法、化妆品规定所规定方法的标准方法本发明也可应用市场通用的间接浓集方法。一种示例性的间接方法是通过在膜上吸附和在培养盒中的比色测定来测定微生物在生长时产生的CO2。该方法例如由BioMerieux公司以牌号BacT/ALERT市售。
该方法是非常灵敏的,并至迟在过夜培养后表明可能的污染,因此使分析结果最迟在24小时后得出。
在此方法中,在营养介质安瓿中加入经消毒的待检验(需要时经稀释)的材料。该安瓿置于可加热的培养盒内的样品槽中。
该安瓿配有通过与检测盒相连接的透气膜。在检测盒中存在有指示剂,该指示剂通过膜吸附细胞生长时形成的CO2,并用比色法测定在培养盒中该指示剂的突变。
对每个样品槽所得的测量信号以电子学方法记录并转换成“生长曲线”(时间与CO2含量的关系)。
该方法现今己在医学中用于血库样品、保存的血液、骨、组织件和其它与医学相关的材料的消毒监控。
对本发明样品的微生物的质量保证的应用尚未描述和按本发明检验。
该方法适用于所有水可混溶和水不可混溶的液体以及适于乳状液、含蜡的珠光剂、油、膏和固体中。
将通常1g定义量的待检样品在消毒条件下放入液体盒中,并在15--40℃,优选在30℃下培养。只要该样品含有细菌,则发育繁殖并释放CO2。在1-100个细菌/ml的侵袭情况下,经约10个增殖周期后和约自2小时起可记录形成的气体。在阳性情况下,借助于b i)或b ii)的试剂和相应的方法可立刻继续分析该材料。一旦出现有污染的阳性指示,就可证实该污染的类型。
按本发明,将1-10g,优选5g待检样品或待检产品悬浮于100-1000ml标准溶液中,并经过夜培养进行浓集。这种处理常常是需要的,因为该样品本身有时可具有对微生物的阻碍作用。为能检测在较长贮存时会有损于产品在卫生要求方面的所需质量的非常少的细菌种群,需要一种在样品经稀释后仍可检测该细菌的方法。但这时存在检出极限的问题,因为稀释后该微生物的总数对立即应用检验方法DEFT或FISH是太少了,以致不可进行筛除检测。对质量保证体系的第一要求即提供一种适于可繁殖的微生物的筛除检测或换句话说提供一种进行适于可繁殖的微生物的是/否-测定方法它是通过过夜培养达到检出极限<10CFU/g而给出的。特别是通过应用由在100-1000ml标准溶液中的5-10g样品的样品制备而达到<1CFU/g或<1CFU/5g的检出极限。这明显低于国际药典中所要求的<100CFU/g的最小检出极限。所以符合用户和工业生产的许多产品所要求的现今的卫生标准,因为研发了一种可快速检测可繁殖微生物的最少种群的质量保证体系。
通过在试剂盒中组合两种检测方法,应用者可直接和同时检验不同的样品、中间产品和成品。因此在生产过程中可在每一阶段对不涉及浓度的中间产品检测微生物的存在。
在本发明中微生物的检测一方面意指“是/否-测定”以回答在待检验的样品或产品中是否存在有害的微生物,另一方面意指接着对各检验的样品或产品准确鉴定该待检测的微生物。提供何种检测,与该样品或产品的浓度有关,并由此与其中要应用的试剂和待应用的核酸探针有关。
本发明中的术语样品和产品意指中间产品和成品。此外,术语“样品”也可意指中间产品或成品的分额或部分,例如按各限定的反应时间取的非均相产品或中间产品的液态或固态部分特别用于监控整个制备过程。本发明中的“样品”例如也可意指对生产装置清洗过程的残余物。本发明中的成品意指适于用户的成品和用于销售和用于制备适于用户的成品的粗制产品。
样品也可来自工业装置经消毒后检查其有效性。工业装置通常用蒸汽或化学介质(次氯酸盐或过氧化氢)进行消毒。该有效性检查至今主要由经典方法进行。但有效性常基于经验值,因为经典检查太耗费。用本发明的体系和方法可快速和高效地检查消毒的结果。
在本发明中“可过滤的”样品或产品意指可通过0.45μm孔径的过滤器的样品或产品。其不应含有油滴或固体颗粒等。
在本发明的一个特别的实施方案中,使用由本发明的试剂盒的b i)试剂用于可过滤的液态样品和产品或待检验样品和产品的可过滤的液态组成部分以检测存活的微生物。也可间接检测死亡的微生物。在此检测方法中,通过吸收特异性物质可研究从诱导到形成一种酶的代谢途径。该诱导通过包含诱导剂的试剂和荧光试剂而发生,该试剂可穿过细胞膜,由此在细胞内该诱导酶可形成高荧光性化合物。没有完整细胞膜的细胞或有效的代谢不能形成荧光性反应产品,并不显示荧光。通过应用其它着色试剂,该试剂在死亡细胞上浓集,因通过诱导酶不能发生反应,就可区分死亡细胞和存活细胞。
首先在通过荧光反应产品形成酶时的检测是确证的,这是这种代谢途径起作用,并由此将这种细胞归因于可起作用的代谢和可繁殖性的。经约1小时就可出结果。为从可过滤的样品或产品中分离该细胞,优选利用膜过滤器,特别是孔大小为0.2-1.20μm,优选0.45μm的聚碳酸酯膜。如有可能,可将待检验的样品和产品用合适方法进行液化。将需求的酶的诱导剂加到该样品中,并接着加入一种荧光试剂,它在与待测的和诱导的酶反应而显示出荧光。
例如用于检测通过半乳糖作为诱导剂诱导的半乳糖苷酶的双半乳糖苷荧光素属此种特异性荧光试剂。用这种诱导剂和荧光试剂可检测乳杆菌素和大肠杆菌类如大肠杆菌、气单胞菌属、柠檬酸杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏杆菌属、假单胞菌类和其它与工艺水相关的细菌。
按本发明,4-甲基伞形酮-衍生物属荧光剂,其是特别用于测定某些酶而衍生的。例如为检测脂酶或酯酶应用4-甲基伞形酮庚酸酯。为检测半乳糖苷酶也可应用4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷。然后该溶液经所述微过滤器过滤,并用表面荧光显微镜进行荧光光学检验。
在另一实施方案中,将指示剂和荧光剂加到过滤器的残渣中。
在另一实施方案中,使用试剂盒中的b ii)的核酸探针不仅对可过滤的液态样品和产品以及不可过滤的样品和产品以及可滤的和不可过滤的样品和产品的混合物进行检测存活的微生物。
本发明中的核酸探针可以是DNA-探针或RNA-探针,其通常包含12-1000个核苷酸,优选12-500,更优选12-200,特别优选12-50-和15-40,最优选17-25个核苷酸。该核酸探针的选择是根据在待检测的微生物中是否存在互补序列为要点。通过选择一个限定的序列可由此检测包括细菌类、细菌属或整个细菌族。对15个核苷酸的探针互补应超过100%的序列。在有多于15个核苷酸的低聚核苷酸的情况下,允许1至多个缺失成对位置(Fehlpaarungsstellen)。
本发明试剂盒的核酸探针的情况是可以通过非特异性的核酸探针检测非特异性的微生物。由此可以说明常提及的在样品或产品中是否存在有害微生物,而不准确地鉴定该微生物。
杂交条件和杂交的时间长短各根据产品并取决于核酸探针对待检验的样品的适配。
作为适于核酸探针的可检测标记物可应用例如产生荧光的基团如CY2(由Amersham Life Sciences公司得到,Arlington Heights,USA)、CY3(也可由Amersham Life Sciences公司得到)、CY5(也可由Amersham Life Sciences公司购得)、FITC(Molecular Probes公司,Eugene,USA)、FLUOS(由RocheDiagnostics GmbH公司得到,Mannheim,德国)、TRITC(由Molecular Probes公司得到,Eugene,USA)、6-FAM或FLUOS-PRIME。
本发明的质量保证体系可用于检测革兰氏阳性细菌和/或革兰氏阴性细菌和/或酵母和/或霉菌和/或藻类。
除与环境相关的细菌外,与医学相关的细菌如葡萄球菌、链球菌、炭疽病菌、破伤风菌、乳酸菌、白喉菌、猪丹毒菌或枯草杆菌也属革兰氏阳性菌。同样除与环境相关的细菌外,医学相关的细菌如淋球菌、脑膜炎球菌、军团菌、大肠菌、斑疹伤寒菌、Rurbakterien和鼠疫菌也属革兰氏阴性菌。特别是工艺废水特有的细菌如假单胞菌、伯克霍尔德氏菌、Raoultellen、克雷白氏杆菌、棒状糖菌和芽孢杆菌属属环境相关和与人类有关的细菌。
在成品的微生物释放中,通过本发明方法用试剂盒的b i)试剂可得出在按需接种过疫苗的产品中微生物的重新检出率。除细菌外,通过应用本发明方法也可检出酵母和霉菌。作为常用的用于按需接种疫苗的标准细菌,其部分也在国际药典中提及并检测:假单胞菌铜绿菌素、大肠杆菌、阴沟肠杆菌属、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、沙门氏菌属、枯草芽孢杆菌。
本发明的另一目的是应用本发明的质量保证体系以检测微生物和并以定性检查可过滤的和/或不可过滤的样品或产品以及用于评价生产装置的卫生状态。待检验的可过滤的和/或不可过滤的样品或产品选自粗制产品、化妆产品、药物制剂、食品、食品补充剂、纺织助剂、洗涤剂及清洁剂以及颜料和漆。
本发明中的粗制产品意指用于制备适于用户的成品的产品。这里包括表面活性剂、油体、乳化剂、珠光蜡、增稠剂、增浓剂、涂脂剂、稳定剂、聚合物、硅化合物、油脂、蜡、卵磷脂、磷脂、UV-光防护因子、抗氧化剂、除臭剂、止汗剂、止屑剂、成膜剂、膨胀剂、杀虫剂、自成褐色剂(Selbstbraeuner)、酪氨酸酶抑止剂(去着色剂)、水溶助长剂、增溶剂、防腐剂、香料油、不可过滤的O/W乳化剂和W/O乳化剂。工艺水也视为粗制产品。
化妆产品可例如包括软膏、霜、洗液、香波、护发剂、淋浴凝胶、洗浴添加剂、装饰性化妆品如化妆油、眼睑膏、唇膏、指甲油等。该药物制剂可以汁、霜状、软膏、洗液、悬浮液、酊剂、滴剂等形式存在。
食品优选是乳或乳制品、烤制品或肉制品、饮料如矿泉水、啤酒、汽水或果汁。作为食品补充剂优选是维生素溶液、不饱和脂肪酸将别是共轭的亚油酸、防腐剂或抗氧化剂。
本发明的另一目的是提供一种应用本发明的质量保证体系来检测可过滤的和/或不可过滤的产品中的微生物的方法,其中:
a)在按国际药典、食品法规、化妆品规定的标准条件下经相当于8-24小时的“过夜培养”以浓集微生物,
b)应用试剂盒以检测可过滤的和/或不可过滤的样品或产品中的存活的、受损的或死亡的微生物,其中,使经浓集的样品
i)用含诱导体和荧光剂的试剂培养,该试剂在细胞中诱导形成特定的酶,并因此由荧光剂形成产生荧光的化合物,和/或
ii)细菌固定后,该细菌和加有荧光标记物的核酸探针共培养,以导致杂交,和
c)检测样品的荧光,并与细胞的数目相关联,这时细胞的数目是可测定的,并在使用b)i)时可区分死亡细胞和存活细胞。
在本发明中,细菌的“固定”意指一种使细菌壳适于核酸探针穿透的处理。通常应用乙醇来固定。但也可使用甲醇、醇的混合物、低百分数的低聚甲醛溶液或稀释的甲醛溶液、酶处理等。
本发明中,“杂交”是指经固定的细菌用荧光标记的核酸探针培养。由低聚核苷酸和其上结合的标记物组成的核酸探针可穿透细胞壳,并在细胞内结合在与核酸探针相当的靶序列上。本发明的核酸探针可以使用各种杂交溶液。各种有机溶剂可以0-80%的浓度使用。通过保持严格的杂交条件,可确保该核酸探针实际上也与靶序列杂交。本发明中的中等条件是例如在杂交缓冲液中的0%的甲酰胺,如下面所述的。本发明中的严格条件是如在杂交缓冲液中的20-80%的甲酰胺。
典型的杂交溶液含0-80%的甲酰胺,优选含20-60%的甲酰胺,特别优选含35%的甲酰胺。此外,该杂交溶液的盐浓度为0.1-1.5mol/l,优选为0.5-1.0mol/l,更优选为0.7-0.9mol/l,特别优选为0.9mol/l,其中,盐优选为氯化钠。该杂交溶液通常还含有洗涤剂如十二烷基硫酸钠(SDS),其浓度为0.001-0.2%,优选浓度为0.005-0.05%,更优选为0.01-0.03%,特别优选浓度为0.01%。为缓冲该杂交溶液,可应用各种化合物如Tris-HCl、柠檬酸钠、PIPES或HEPES,其通常的浓度为0.01-0.1mol/l,优选为0.01-0.08mol/l,pH-值范围为6.0-9.0,优选7.0-8.0。本发明特别优选的杂交溶液的实施方案含有0.02mol/l Tris-HCl,pH为8.0。
探针的浓度可按标记和所预计的靶结构的数目而有很大波动。为进行快速而有效地杂交,该探针量应超过靶结构的数目几个数量级、但在荧光就地-杂交(FISH)情况下要注意,经荧光标记的杂交探针的量太高会导致本底荧光增加。因此探针量应为0.5ng/l-500ng/l,优选为1.0ng/l-100ng/l,特别优选为1.0-50ng/l。
杂交的时间通常尚10分钟-12小时;优选该杂交进行约1.5小时。该杂交温度优选为44--48℃,特别优选46℃,这时杂交温度的参数以及在杂交溶液中的盐和洗涤剂的浓度可依据核酸探针,特别是其与在待检测的细胞中的靶序列的互补性的长度和程度而进行最佳化。实现杂交后,将该未经杂交的和过量的核酸探针分子用通常的洗涤溶液去除或洗去。需要时该洗涤溶液可含0.001-0.1%,优选浓度为0.01%的洗涤剂如SDS,以及浓度为0.001-0.1mol/l,优选0.01-0.05mol/l,特别优选0.02mol/l的Tris-HCl。该洗涤溶液通常还含有NaCl,其浓夜按所需严格条件为0.003-0.9mol/l,优送0.01-0.9mol/l。该洗涤溶液还可含浓度不大于0.01mol/l的EDTA,该浓度优选为0.005mol/l。此外,在洗涤溶液中还可加入缓冲溶液,该缓冲溶液相应于在较小盐浓度下的杂交缓冲液。
该未结合的核酸探针分子的“洗去”通常在30--50℃,优选44--50℃,特别优选46℃下进行10-40分钟,优选15分钟。应用本发明试剂盒时的结果在24-48小时后得出。接着借助于显微镜,优选表面荧光显微镜以光学检测各经荧光试剂或荧光标记物处理过的样品或产品。
实施例
实施例1:用所述组合方法对可过滤产品的定性分析
分析时间通常为10-24小时。
1.样品制备
所有工作必需在消毒/无菌条件下进行。
在无菌条件下称取10g待检验的样品,并按欧洲药典2.6.12或2.6.13将该样品均匀混合在90ml的THLCL-肉汤中。该溶液经0.45μm的膜过滤器无菌过滤,弃去滤液。该过滤器经200ml的无菌缓冲溶液再冲洗。在该过滤器上滞留了所有的在10g产品中所含的细菌。
接着取下过滤器并将其完全转移到含20ml CASO-肉汤(用于细菌浓集)或Sabouraud肉汤(用于酵母和霉菌的浓集)的无菌容器中(典型的过夜培养)或转移到BacT/ALERT瓶(含20ml各自肉汤的Lym-瓶)中。该BacT/ALERT体系不适合于众所周知的易于自催化释放CO2同时不存在微生物相互作用的样品。在大部分化妆品原料和工业上使用的原料情况下均非这种情况。
这样制备的样品在30±5℃下培养过夜。有怀疑有缓慢生长的有机体污染时一般可先富集8小时也可持续24小时。
2.浓集培养的光学检查或Bact Alert体系的评价
只要通过在浓集肉汤中的微生物-生长出现混浊或在Bact/ALERT体系中测到有CO2释出,则该样品再经FISH技术分析,并开始粗略分类成革兰氏阳性和革兰氏阴性有机体,也许直到能分析到细菌的种类(参看实施例2:不可过滤的产品)。当在浓集中未发现生长或在Bact/ALERT-体系中无CO2释出,则用DEFT方法验证结果。
3.DEFT检查微生物的存在
用无菌注射器由浓集培养物中取出10ml,其相当于5g原始产品量,并经0.45μm的聚碳酸酯过滤器过滤。将其上存在有浓集的细胞的聚碳酸酯过滤器置于含荧光色素的DEFT-垫上,并在20--37℃下于湿腔中培养8-15分钟。这时色素从垫转移到细胞上,而该聚碳酸酯过滤器的本底并未着色。
经培养后,从垫上取下该过滤器,并置于载片上。接着用固定液体停止该着色反应。
接着在100倍放大的荧光显微镜中检查该标本的经着色的细胞的存在。这时完全扫描该过滤器。该过滤器的背景必需是暗的。该得出的阳性对照和阴性对照必需提供明确的结果。
4.结果:
如果检测到红细胞,则该标本混入有己死亡的细胞。通常这种细胞来自环境,并对标本的质量不重要。对肠胃外-应用的产品除外。这时该标本应不含红的也不含绿的产生荧光的细胞体。
如果检测到绿细胞,则涉及在产品中存在可繁殖的细胞。该产品是定级为微生物污染。
因为绿细胞存在时通过前面的浓集步骤不能推断在原始产品中的细菌数,所以该方法应列为是/否法或按现有的相应的统计数据列为半定量法。这通常对定性评定是足够的,因为更重要的目的是“证实没有可繁殖的细菌”。
5.在DEFT方法中用菌种检查
·样品制备类似于1进行(产品样品Texapon NSO,IMQ 418935)
·一起进行所应用的浓集-介质的阴性对照
·在产品中存在下放入用于检测菌种的1个样品系列-加0.2ml菌种溶液(相当于10-100KBE/10ml的稀释液)到20ml样品溶液中-产品或阴性对照,并均匀混合
·用过滤法(HIPCO-法)将用于经典检测细菌数的10ml和该过滤器在CASO-介质中于30--35℃下培养3-5天
·放入用于浓集的其余的量并DEFT24小时
·类似于第1点进行浓集和评定试验
·无生长浑浊或CO2形成-DEFT检查
5.1结果-浓集后菌种的检测
样品名称 | 过滤方法中所用菌种的细菌数测定KBE/每膜过滤器或每5g浓集的产品 | 在浓集中生长并需要时在浓集后的DEFT-检查结果KBE/每膜过滤器或每5g浓集的产品 |
产品样品-经浓集 | 未加 | 浓集:无浑浊DEFT:个别绿色晶体,无微生物细胞 |
阴性对照样品-经介质浓集 | 未加 | 浓集:无浑浊DEFT:个别绿色晶体,无微生物细胞 |
产品样品+E.coli菌种溶液 | 50 | 浓集:强的生长浑浊,不可能DEFT检查 |
对照样品+E.coli菌种溶液 | 51 | 浓集:强生长浑浊,不可能DEFT检查 |
产品样品+Ps.铜绿色菌种溶液 | 46 | 浓集:无生长浑浊DEFT:>1000绿细胞 |
对照样品+Ps.铜绿色菌种溶液 | 50 | 浓集:强生长浑浊,不可能过滤并DEFT检查 |
产品样品+白色念珠菌 | 21 | 浓集:无生长浑浊DEFT:>1000(绿细胞) |
对照样品+白色念珠菌 | 23 | 浓集:无生长浑浊DEFT:>1000(绿细胞) |
实施例2:用所述组合方法对不可过滤产品的定性分析
1.样品制备
所有工作必需在消毒/无菌条件下进行。
在无菌条件下称取10g待检验的样品,并按欧洲药典2.6.12或2.6.13将该样品用合适辅助工具,优选一种市售的细菌分离器(Stomacher Gerat)均匀混入90ml的THLCL-肉汤中。从该悬浮粉中移取相当于1g待检验样品的10ml样品到100ml CASO或Sabouraud-肉汤中。
也可将10ml悬浮物转移到BacT/ALERT瓶(含20ml各自肉汤的Lym-瓶)中和只要该样品不易自催化释出CO2就加到该BacT/ALERT体系中。
该样品在30--35℃下培养过夜即最大至24小时,以使微生物生长。
2.浓集培养物的光学检查或Bact/ALERT体系的评定
只要检测到微生物污染(肉汤-浑浊或在Bact/ALERT体系中释出CO2),则进行定性的FISH-检验,并开始区分革兰氏-阳性细胞和革兰氏-阴性细胞,这已可给出污染源的首次证实。对细菌种类的另一种区分可用选择性介质涂片或以PCR方法进行。
3.实施用于检查革兰氏阳性微生物和革兰氏阴性微生物的存在的FISH检验(相应于制造商资料)
样品制备
·吸取100μl样品到Eppendor容器中
·滴入4滴溶液B2,并与样品混合(=固定)
·每次吸取10μl经固定的样品到载片上的5个反应腔中(区1,2,3以及阳性对照区和阴性对照区)
·在35--37℃下培养载片30-60分钟(干燥)
·吸取24μlBreaker溶液到反应区3中,并在室滥下培养5-10分钟
·滴1滴Breaker溶液4到区3中和滴1滴Breaker溶液2到区2中,并在室温下培养5-10分钟
·向VIT反应器充以去离子水,并洗涤载片
·在35--37℃下培养载片30-60分钟(干燥)
·滴入1滴溶液B2
·在35--37℃下培养载片30-60分钟
与探针接触
·在区1,2和3中滴入1滴“阳性对照”
·在阴性对照区滴入1滴“阴性对照”
·在阳性对照区滴入1商“阳性对照G”
·将载片推入VIT反应器中,并在44--46℃下培养1.5-2小时洗涤
·由反应器中取出载片
·向反应器充以温热洗涤缓冲液,推入载片并在44--46℃下洗涤15-30分钟
·弃去洗涤缓冲液
·向反应器充以去离子水,并再洗涤载片
·在44--46℃下干燥载片15-120分钟
显微镜评定
·用固定液体(停止剂)停止反应
·放上玻璃盖片,并在荧光灯中于放大100倍的显微镜下以SCAN方法检查
·背景必需是暗的,阳性对照和阴性对照必需提供明确结果,发红光的细胞表明是存活的细菌
结果
区1=检测红细胞=革兰氏阴性微生物(如假单胞菌属,肠杆菌)
区2=检测红细胞=革兰氏阳性微生物(如乳杆菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属)
区3=检测红细胞=革兰氏阳性微生物(如葡萄球菌属)
在样品中出现自发荧光时,必需重复该程序,并加入阳性对照D。然后该细胞着绿色,但其它方面未有改变。
结果的数据是按每g产品和按对产品特异的限值计算表示。
4.用FISH方法检测菌株
·样品制备类似第1点进行(产品样品化合物,IMQ 322015)
·在产品存在下加入1用于检测菌株的样品系列-加入菌株溶液(相当于10-100KBE/1g样品的稀释液)到100ml CASO-肉汤中-产品样品或阴性对照,并均匀混合
·试样的浓集和评定类似于第2点进行
样品名称 | 所用菌株的理论细菌数(计算)KBE/g产品 | 浓集后FISH检查的结果KBE/g浓集的产品 |
产品样品-经浓集 | 未加 | Fish:区1至3无微生物细胞可检出 |
阴性对照样品-经介质浓集 | 未加 | Fish:区1至3无微生物细胞可检出 |
产品样品+E.coli菌株溶液 | 78 | Fish:区1-红色细胞可检测区2至3无微生物细胞可检测 |
对照样品+E.coli菌株溶液 | 78 | Fish:区1-红色细胞可检测区2至3无微生物细胞可检测 |
产品样品+Ps.铜绿色菌种溶液 | 32 | Fish:区1-红色细胞可检测区2至3无微生物细胞可检测 |
对照样品+Ps.铜绿色菌种溶液 | 32 | Fish:区1-红色细胞可检测区2至3无微生物细胞可检测 |
产品样品+金黄色葡萄球菌 | 98 | Fish:区3-红色细胞可检测区1和2无微生物细胞可检测 |
对照样品+金黄色葡萄球菌 | 98 | Fish:区3-红色细胞可检测区1和2无微生物细胞可检测 |
5.评定
因为细胞存在时通过前面的浓集步骤不能推断在原始产品中的细菌数,所以该方法应列为是/否法。这通常对定性评定是足够的,因为更重要的目的是“证实可繁殖病菌的不存在”。
Claims (8)
1.一种用于检测可繁殖的微生物的质量保证体系,其包括
a)按国际药典(例如欧洲药典)、食品法规、化妆品规定或按市场通用的间接方法,在标准条件下经相当于8-24小时的“过夜培养”以浓集在样品中的微生物,
b)用于检测可过滤的和/或不可过滤的产品中的存活的、受损的或死亡的微生物的试剂盒,其包括:
i)至少一种试剂,其含有诱导体和在有存活细胞情况下导致形成某种酶的荧光剂,该酶通过与特异性荧光剂反应释放出可被检测的荧光色素,
ii)至少一种经就地杂交用于检测微生物的核酸探针,其中该核酸探针结合在荧光标记物上,
其对可繁殖的微生物的检出极限<10CFU/g。
2.权利要求1的质量保证体系,其特征在于,可繁殖的微生物的检出极限<1CFU/g。
3.权利要求1的试剂盒,其特征在于,由b i)的试剂可用于可过滤的液态样品和产品或待检验的样品和产品的可过滤的液态组成部分以检出存活的微生物和间接检测死亡的微生物。
4.权利要求1的试剂盒,其特征在于,由b ii)核探针可用于检测可过滤的液态样品和产品以及不可过滤的样品和产品以及可过滤和不可过滤的样品和产品的混合物的存活的微生物。
5.权利要求1-4之一的质量保证体系,其特征在于,用于检测革兰氏阳性细菌和/或革兰氏阴性细菌和/或酵母和/或霉菌和/或藻类。
6.权利要求1-5之一的质量保证体系的用途,其用于检测微生物和定性检查可过滤的和/或不可过滤的产品以及评定生产装置的卫生状态,其可检出极限<10CFU/g。
7.权利要求1-5之一的质量保证体系的用途,其用于检测微生物以定性检查可过滤的和/或不可过滤的产品,该产品选自粗制产品、化妆产品、药物制剂、食品、食品补充剂、饮料、纱织助剂、洗涤剂和净化剂以及颜料和漆。
8.一种应用权利要求1-5之一的质量保证体系来检测可过滤的和/或不可过滤的产品中的微生物的方法,其中:
a)在按国际药典、食品法规、化妆品规定或按市场通用的间接方法的标准条件下经相当于8-24小时的“过夜培养”以浓集微生物,
b)应用一种用于检测可过滤的和/或不可过滤的产品中的存活的、受损的或死亡的微生物的试剂盒,其中使经浓集的样品
i)与一种含诱导体和荧光剂的试剂一起培养,该试剂在细胞中诱导形成特定的酶,并由荧光剂形成产生荧光的化合物,和/或
ii)在细菌固定后,该细菌用配有荧光标记物的核酸探针培养,以导致杂交,和
c)检测样品的荧光,并与细胞数相关联,这时细胞数是可测定的,并在使用b)i)时可区分死亡细胞和存活细胞。
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