CN1726286A - 鉴定微生物的方法和设备 - Google Patents

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斯特凡·施通佩
弗里德黑尔姆·西普曼
安德烈亚斯·图恩舍
弗兰克·温豪森
安德烈亚斯·凯特肯佩
麦克尔·海因策尔
罗兰德·布里福斯
米尔科·魏德
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Abstract

本发明公开定量和/或定性鉴定样品中微生物的方法。所述方法包括样品制备的步骤(a)和进行检测和/或评估的步骤(b)。样品中所含的至少一部分微生物通过至少一种荧光标记物在步骤(a)中标记，而定量和/或定性检测和/或评估通过荧光反射光度测量方法在步骤(b)中完成。同时还公开实施上述方法的相应设备。

Description

鉴定微生物的方法和设备
本发明涉及根据权利要求1前序部分的定量和/或定性测定微生物的方法。本发明还涉及根据权利要求27前序部分的定量和/或定性测定微生物的设备，尤其是用于实施上述方法的设备，和该设备的用途，尤其优选用于自动化生产和/或质量控制。
工业、贸易、家居、健康、食品等多个领域对大量的物质、原材料和产品需要保证其微生物安全性。
就此而论，例如细菌和真菌的各种微生物的性质和数量，必须监控在一个窄的界限内。
定量微生物分析技术用于质量保证已有一段时间。这些方法的基础是扩增存在于待研究材料中的单独微生物，以使其以划线或菌落的形式为肉眼所见。为实现这一目的，在固体营养底物或液体营养溶液或培养基中增殖这些微生物的培养方法是标准的操作。取决于方法和微生物的类型，用于检测细菌和真菌的常规培养方法须进行长至数天。
根据现有技术，培养方法的步骤通常是将样品接种到营养培养基(常见为带有基于琼脂的营养培养基的培养皿)，然后在适合各自微生物的温度(通常是升高的温度)下培养长达一周(如在培养箱中)。根据得到的培养物的生长和形态，本领域技术人员能推断样品中存在的细菌的性质和含量。
该技术的严重不足之处在于只有样品中含有的未确定部分的微生物可以被培养，而该信息直到一周后才能知道。
为解决上述问题，过去开发了一系列加快微生物检测和增强灵敏度的方法。这些方法包括非选择性或选择性将微生物染色并相应地检测的显微镜方法，以及基于免疫分析的方法和扩增微生物的遗传物质并通过凝胶电泳检测的直接的分子生物学方法。
为将检测时间从数天降低数小时，甚至更少，使用新的称作“快速检测方法”进行了一段时间的努力。“快速检测方法”部分已经在使用(电阻，生物发光等)，由于“快速检测方法”建立在时间依赖性的生物材料的富集基础上，24到48小时仍然是分析所必需的，于是存在对更快和更直接的方法的需求。
最近，荧光光学方法更多地取代了传统的“快速检测方法”和培养方法。直接的落射荧光过滤技术(DEFT)，例如，首次使“死/活”微生物的定量检测的直接方法在小于一小时内完成。这种非特异的光学荧光方法在学术基础研究中作为定性的方法已有超过25年(参见例如Pettipher等，Appl.Environ.Microbiol.44(4)：809-13，1982)，并且自20世纪90年代早期以来建立于越来越多的工业应用中(如酿酒、乳品、食品工业等)作为定量研究的方法(Hermida等，J.AOAC Int.83(6)：1345-1348，2000和Nitzsche等，Brauwelt，No.5，177-178，2000)。使用DEFT筛选方法检测辐射的食品有欧洲专利说明书(EN 13783：2001“使用落射荧光过滤技术/有氧噬温微生物计数(DEFT/APC)筛选方法检测食品的辐射(Detection of irradiation of foods using epifluorescencefilter technology/aerobic mesophilic germ count(DEFT/APC)screeningmethod)”。
不同的生产商以实验室试剂盒提供替代的选择性作用的荧光染料用于体内检测(如Molecular Probes和EasyProof Laborbedarf GmbH)。一些供应商(如Chemunex公司)出售成套设备；例如Chemunex提供的设备，基于流式细胞计数原理(L.Philippe，SFW-Journal 126，28-31，2000)，其对低水平的微生物需要富集24小时，或基于显微镜过滤方法，其不能区分“活的/死的”微生物(Wallner等，PDA J.Pharm.Sci.Technol.53(2)：70-74，1999)。
称作膜滤器微菌落荧光(MMCF)的方法(参见例如，J.Baumgart，Microbiological inVestigation of foods，Behr′s...Verlag 1993，3rd edition，pp.98 ff.)提供了在膜滤器上样品制备或样品中的微生物。不足之处是必须首先进行耗时的微生物预先富集，膜滤器必须预处理(用特定的培养基湿润、量度和干燥)然后进行落射荧光显微镜，微生物计数必须在落射荧光显微镜或紫外灯下通过计数荧光标记的菌落来完成。
尽管上述的一些技术在数小时内得到结果，它们通常需要非常复杂的检测设备和必需的用户知识。因此，这些方法迄今没有达到足以适合常规使用的程度。此外，个别的方法在特异性和灵敏度上存在限制。一些上述的方法对微生物检测上限过高，以至不可避免需要前述的培养过程。
此外，传统培养方法和具有相应的富集步骤的“快速检测方法”的操作原理意味着存在一些基本的不足之处：
营养培养基的选择在何种微生物能被增殖方面起着决定性作用。选择性营养培养基在此具有优势。即使这些培养基还是只能增殖那些具有某种生理能力的微生物。根据最近的发现，只有5％的微生物能够被培养。因此使用传统方法经常产生假-阴性的结果，尽管这些样品中确实含有微生物。
此外，分析方法提供信息的能力受可利用的时间限制。在富集时间结束后，所有微生物必须增殖到可以看见的程度。由于不利的取样条件或饲养条件产生延迟的生长可导致错误的阴性结果。因此，传统的培养方法检测细菌和真菌需要数天；以致微生物学结果对生产过程中的任何调控干预过程而言都太迟。
利用基于微生物培养的检测方法，只有能增殖的活微生物能被检测。然而产品防腐剂常常已经杀死了污染物。产品中存在的“死的”微生物在这种方式中不能检测到，因此无法发现生产或包装中的可能的卫生问题，或只有在降解，即防腐剂失效后才能检测到。
因此本发明的目的是提供前述的适合定量和定性测定微生物和特别地，至少部分消除上述提到的不足的方法；和用于实施这种方法的设备。
因此，根据本发明的第一方面，本发明的主题是定量和/或定性测定样品中微生物的方法，该方法包括样品制备的步骤(a)和进行检测和/或评估的步骤(b)，利用至少一种荧光标记在步骤(a)中标记样品含有的至少一些微生物，而定量和/或定性检测和/或评估通过荧光反射光谱测定或荧光反射光度测定在步骤(b)中完成(两个术语“荧光反射光谱测定”和“荧光反射光度测定”在下文中是同义的，检测方法的原理在下文中更加详细地阐述)。
因此本发明的基本概念表现为下列事实：样品中的微生物首先被荧光标记，然后通过荧光反射光度测定完成定量和/或定性评估或检测。下文中将更详细解释，由于荧光标记的微生物为此目的基本不需要进一步的准备，荧光反射光度测定提供了几乎没有复杂性的相对简单的检测或评估的巨大优点。尤其是，省去了耗时耗力的(预先)富集微生物的步骤，即，根据本发明通过荧光反射光度测定检测或评估直接提供“真正的”微生物计数，或样品中存在的数量。
因此本发明的一个特别的方面是使用合适的荧光标记物标记微生物，与随后使用简化的检测或评估方法，即通过荧光反射光度测定，和相应的设备检测荧光标记物的微生物的组合。由于在荧光反射光度测定方法中样品只是短暂地暴露给辐射，荧光标记物的漂白，及由此产生的检测结果的失真可以被有效防止。
通过荧光反射光谱分析或荧光反射光度测定检测或评估来自动检测由荧光标记的微生物在相应的波长照射下反射发出的辐射，或其强度，该照射与样品中存在的微生物数量相关。(与反射光度测定或反射光度测定方法相关的进一步细节，可以参考，例如Rmpp，化学字典(Chemical dictionary)，Thieme Verlag，第十版，Vol.5，pp.3756-3757的相关讨论，条目为“反射”和“反射光谱学”，和Vol.4，pp.3312-3314，条目为“光度测定”，每个情形中包括此处引用的文献，在此引入其全部内容作为参考)。因此可以避免相对繁重的菌落计数和计数之前的微生物富集，而这些工作在落射荧光显微方法，例如在膜滤器微菌落荧光(MMCF)方法是必须进行的。
本发明的方法中可使用的荧光反射光度计或分光计可由本领域技术人员根据从商业获得的通常用于这一目的的组件方便地设计。
短语“标记样品中存在的至少一些微生物”指，尤其是下文：根据待确定的是否只是特定的微生物或微生物类型出现在样品中，或所有的微生物出现在样品中，前一情况下只有样品中出现的特定部分的微生物以受控的方式标记(通常使用微生物特异的荧光标记物)，而在后一种情况下，样品中所有微生物都被标记(通常使用非微生物特异性荧光标记物或不同微生物特异性荧光标记物的混合物)。
根据本发明的方法有可能基于荧光反射光度测定确定的测量值通过合适的校准曲线来决定样品中微生物的数量(在荧光标记样品中所有微生物的情况下，为样品中的全部微生物；而在只荧光标记特定的微生物的情况下，为标记微生物的总数)。下文中将进一步阐述，使用微生物特异的荧光标记物还有可能对样品中存在特定微生物进行定性的陈述。
通常，在方法的步骤(a)进行样品制备的情况下，将荧光标记的微生物施加到优选为多孔的膜滤器上(如，聚碳酸酯膜滤器)。膜滤器通常应以截留微生物和/或对微生物不透过的方式实施。为此，膜滤器的孔径应当选择以使其小于样品中存在的微生物。下文中将更详细阐述，膜滤器的部分或局部，通常其边缘，不应带有或聚集很多微生物，这可保证对各样品的参照和内部校准或标准。本发明合适的膜滤器材料除聚碳酸酯外为PTEF、聚酯和纤维素和纤维素衍生物，如醋酸纤维素、再生纤维素、硝酸纤维素或纤维素混合酯。本发明合适的膜滤器由例如Macherey-Nagel公司(如“PORAFIL”系列)销售。
使用膜滤器在膜滤器上直接完成为通过荧光反射光度测量的检测或评估提供了很大便利，特别是不需要进一步样品处理、制备、转移等(即，尤其不需要预先富集)。
根据本发明方法的特别优选的实施方案，在方法的步骤(a)中将荧光标记的微生物施用到硅微筛上。这是非常有利的，因为硅微筛具有非常平整的表面，可以更方便地检测在其上面的微生物。此外，这种筛相对容易清洁，它们可以重复使用。硅微筛进一步具有好的生物相容性和好的反射率。微筛的另外的益处在于它们的刚性结构，这在处理时提供相当的便利。特别均匀的孔径有另外的益处，其进一步增加选择性过滤操作的精确性。本发明方法使用的微筛的孔径在大约0.1和0.2μm之间是有利的。孔径从0.45μm到1.2μm的微筛是特别优选的。与上述不同孔径的筛当然也可以根据待检测的微生物的大小使用，即，包括孔径小于0.1μm或大于2μm的。
在本发明的范围内，还可以在使用膜滤器时使用硅微筛。根据本发明，具有膜滤器的方法或设备的有利的实施方案能移植到每个使用硅微筛的情形中。
有利地，本发明的方法使用的荧光标记物以这样的方式选择：对方法的步骤(a)中进行的样品制备使用的膜滤器而言，其是可透过膜的。其有利之处在于就通过荧光反射光度测量进行检测或评估而论，没有由过多的荧光标记物产生的背景噪声和干扰信号，因此可以达到有利的信号-背景比例或信号-噪声比例。
本发明方法步骤(a)的样品中出现的微生物的荧光标记以原本已知的方法进行。这是本领域技术人员的常识。为此，例如，待标记的微生物与以相对微生物过量存在的荧光标记物的溶液或分散体接触，接触时间必须足以保证在这种方法的步骤中所有待标记的微生物都被荧光标记(根据荧光标记物的选择，例如，样品中的所有微生物或一种或多种微生物类型的所有微生物)。在实际荧光标记后，多余的荧光标记物可以除去或与荧光标记的微生物分离。这可以例如在使用对荧光标记物是膜透过性但对微生物不透过的膜滤器的情形中，通过去除(例如，施用超压或真空)该溶液或将多余的荧光标记物从多孔膜滤器中分散掉，和任选地然后用水、缓冲液或其他液体淋洗所有东西，使最终留在膜滤器上的只有荧光标记的微生物(如果可行，还可以含有故意未标记的微生物)。这使随后在本发明方法的步骤(b)通过荧光反射光度测量检测或评估变得非常方便。
如果可行，方法的步骤(a)的样品制备还可以包括灭活和/或去除样品中存在的抑制微生物的和/或杀微生物的物质或组分(例如，防腐剂、表面活性剂等)。这使随后的测量结果避免被下列事实失真：一些微生物被抑制微生物或杀微生物的物质或组分在样品制备或测量过程中杀死或失活而使测定的微生物计数错误地非常低。这使得有可能即使在含有抑制微生物的和/或杀微生物的物质或组分(例如，防腐剂、表面活性剂等)的样品中确定微生物数量，从而本发明的方法可以用于，例如在表面活性剂或分散产品中。
灭活或去除可能出现在样品中的抑制微生物或杀微生物的物质或组分，仅根据样品类型可行的方法步骤，有利地在荧光标记之前进行，优选直接在取样后或在本发明方法的步骤(a)样品制备的一开始就进行，这保证抑制微生物或杀微生物的物质、组分、成分等能基本上不改变原始样品中的微生物计数。同样可能的是，尽管不太优选，在荧光标记后灭活或去除可能出现在样品中存在的抑制微生物的或杀微生物的物质或组分。同样可能同时进行荧光标记和灭活或去除抑制微生物的或杀微生物的物质或组分。
根据样品类型可行的灭活或去除可能出现在样品中的抑制微生物的或杀微生物的物质或组分的方法步骤，以原本公知的方式完成。可以参考，例如，Stumpe等的稿件，“基于化学发光直接检测微生物：食品和化妆品工业中的经验报告(Chemoluminescence-based directdetection of microorganisms：a report on experience in the food andcosmetics industry)”，会议纪要第317页到323页“HY-PRO 2001，卫生的生产技术”，第二届国际会议和展览，Wiesbaden May 15-17，2001，和该论文集中指定的文献；该论文集的全部内容，包括此处引用文献的内容，在此引入全文作为参考。这通常可以通过将待分析的样品与合适的灭活和/或调节溶液接触而完成。这种灭活或调节溶液对本领域技术人员而言原本是已知的(如，TLH吐温/卵磷脂/组氨酸)调节水溶液)。适合本发明的灭活或调节水溶液还可以包括，例如，除TLH(如聚山梨醇酯80＝吐温80，大豆卵磷脂，和L-组氨酸)，缓冲物质(如，磷酸氢盐和/或磷酸二氢盐的磷酸盐缓冲液)，另外的盐(如氯化钠和/或硫代硫酸钠)，和胰蛋白胨(来自酪蛋白的蛋白胨)。
特别适合本发明的灭活或调节溶液具有下列组成：
-                      蛋白胨1.0g
-                      氯化钠8.5g
-                      五水合硫代硫酸钠5.0g
-                      0.05M磷酸盐缓冲液10ml
-TLH的水补至           1000ml。
本发明可用的“TLH的水”具有，特别是，下列组成：
-           聚山梨醇酯80(吐温80)30.0g
-           大豆卵磷脂3.0g
-           L-组氨酸1.0g
-           去离子水补至1000ml。
本发明可用的磷酸盐缓冲液，特别地，具有下列组成：
-           磷酸二氢钾6.8045g
-           磷酸氢二钾8.709g
-           去离子水补至1000ml。
荧光标记物的选择不是关键的。可以根据应用和微生物的类型而使用现有技术原本已知的荧光标记物，只要它们适用于本发明的方法的范围内。
术语“荧光标记物”应该在本发明的范围内作广义的解释，尤其表示任何以与微生物相互作用的方式，例如，结合到微生物，特别结合到其细胞壁(包膜)和/或核酸，和/或被微生物摄取，特别是被代谢和/或被酶转化而实施的荧光标记物。
使用的荧光标记物可以是，例如，非微生物特异的荧光标记物或非微生物特异的荧光标记物的混合物。这可以实现相对经济的对样品中所有微生物的荧光标记，并因此相对快速确定样品中总微生物计数。
特别在只有特定的微生物被定性地和定量地以选择性的方式自动检测的情况下，微生物特异的荧光标记物或不同微生物特异的荧光标记物的混合物可以用作荧光标记物。
相似地，非微生物特异的和微生物特异的荧光标记物的混合物可以用作荧光标记物。
例如，与活微生物相互作用的荧光标记物可以用作荧光标记物。相似的，与“死”微生物相互作用的荧光标记物可以用作荧光标记物。
同样，有可能使用与“活”微生物作用的荧光标记物，和与“死”微生物作用的荧光标记物的混合物作为荧光标记物。样品中微生物活/死的差别是可以分辨的。这种混合物是现有技术中原本已知的(参见例如，Stumpe等，loc.cit.，和此处引用的系统EasyProof LaborbedarfGmbH，Voerde)。
前面提到的EasyProof Laborbedarf GmbH的标记系统最初引进是用于酿造工业(Eggers等，Brauindustrie 6，34-35，2001)。荧光标记物的非荧光的初始阶段(即前体)被摄入到完整的微生物细胞内并在细胞内(细胞质)被酶活性(酯酶)转化为有荧光的化合物(绿色＝检测到活细胞)；为实现该方法，必须存在具有膜电势的完整的细胞膜。“死”细胞的检测通过引入特异性荧光染料到细胞的DNA中而完成。这种掺入反过来只在细胞膜缺陷的细胞中发生(红色＝检测到死细胞)。由于两个反应基于不同的原理，其结果不相互依赖。这种标记技术不损伤细胞，所以可以在评估的环境下确定样品中当时的微生物学状态。
通常用于在落射荧光显微镜或在直接落射荧光过滤技术(DEFT)或在膜滤器微菌落荧光(MMCF)方法中的微生物标记的荧光标记物也能，例如用作本发明的方法中的荧光标记物。
例如，荧光染料或这种荧光染料的前体可用作荧光标记物，从所述前体通过与微生物作用特别是通过代谢和/或酶转化产生所述荧光染料。
该荧光染料的前体的例子描述于，例如，WO 86/05206 A1和EP 0443 700 A2，其各自全部的公开内容在此引入作为参考(如，可以酶学转化为荧光素的非荧光二乙酰荧光素)。
本发明可用的荧光染料作为荧光标记物的例子是，但不限于，例如3，6-双[二甲基氨基]吖啶(吖啶橙)，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基phenanthridinium溴化物(溴乙锭)，3，8-二氨基-5-[3-(二乙基methyammonio)丙基]-6-phenylphenanthridinium diiodide(碘化丙锭)，罗丹明如罗丹明B和磺酰罗丹明B，和荧光素异硫氰酸酯。另外的例子可以参考EP 0 940 472 A1或荧光探针和研究化学品的分子探针手册，第五版，分子探针公司，Eugene，Oregon(P.R.Haugland，编辑，1992)，其各自的全部公开内容在此引入作为参考。也可以参考相关的化学品目录(如生命科学研究的生化药品和试剂的“荧光标记试剂”目录，Sigma-Aldrich公司，2002/2003版)。
本发明方法中还可以使用，例如，随后被荧光标记的核酸探针(如，微生物特异性核酸探针)，特别是用荧光基团或荧光分子标记的核酸探针作为荧光标记物。荧光基团或荧光分子可以，例如共价地或其他方式结合到核酸探针上。本发明用作荧光标记物的核酸探针可以，例如是荧光标记的核酸寡核苷酸或多核苷酸或荧光标记的DNA探针或RNA探针。出于稳定的考虑，本发明通常优选DNA探针。
本发明中用作荧光标记物的核酸探针的例子，例如在WO01/85340 A2，WO 01/07649 A2和WO 97/14816 A1中阐述的，其各自的全部公开内容在此引入作为参考。
例如，通常在荧光原位杂交(FISH)中用于标记(DNA标记或RNA标记)的核酸探针可以用作核酸探针。进一步的相关细节，可以参考Rmpp生物技术和遗传工程字典，第二版，Georg Thieme VerlagStuttgart，pp.285-286，在“FISH”条目下，和参考此处引用的文献，和WO 01/07649 A2，其各组全部公开内容在此引入作为参考。
同样可以用作荧光标记物尤其是微生物特异的抗体，其随后被荧光标记的，特别是用荧光基团或荧光分子标记，以致荧光基团或荧光分子可以共价地或其他方式结合到抗体。
使用的荧光标记物的数量或浓度由本领域技术人员根据个别案例的具体情况来调整。对本领域技术人员而言这是完全常见的操作。在分辨样品中死/活微生物时，例如，应当选择合适的“活染料”和“死染料”的混合比例，以使微生物染色充分的同时进行弱的“背景染色”；在个别案例中的选择是本领域技术人员的专业技能。
利用本发明的方法，待检测的微生物的界限为通常≤100菌落形成单位(CFUs)/毫升样品体积，优选≤10菌落形成单位(CFUs)/毫升样品体积。因此本发明的方法不需要任何预先富集。低的检测界限是非常关键的，例如，为了符合一些指南或说明书。根据CTFA指南，例如对更高的微生物计数界限(如，102到103CFUs/mL)的化妆品原料，必须进行耗时耗力的特定问题微生物，即病源微生物的检测。
利用本发明的方法，通常可以确定微生物计数范围在大约每毫升样品体积10CFUs或更低，到大约每毫升样品体积108CFUs。为定量评估的目的，超过一定微生物计数(通常超过大约每毫升样品体积102CFUs)，则该样品首先必须相应地(即合适地)稀释。
本发明的方法原理上适合确定任何微生物，特别是所有类型的病源微生物(如，所有类型的微生物，特别是单细胞微生物，如细菌和如酵母或霉菌的真菌)。
本发明的方法原理上适合定量和/或定性确定任何产品中的微生物(如，培养基，基质、溶液等)，优选可滤过的，特别是液体和/或多孔的产品。在固体产品或不可滤过的产品的例子中，它们必须在样品制备阶段转化为本发明的方法可作用的形式；使用原本已知的方法例如，通过粉碎、抽提等将其转化为溶液或分散体来进行。
本发明的方法适用于，例如定量和/或定性确定食品、含有表面活性剂的产品如洗涤和清洗剂、表面处理剂、分散产品、化妆品、卫生用品和个人护理产品、药物、粘合剂、冷却剂润滑剂、涂料和(涂层)凝结剂，及原材料和上述产品的起始物质中的微生物。
因此本发明的方法适合所有类型的可能的原材料、中间物和终产物，它们来自不同行业例如食品、贴有商标的产品、化妆品、粘合剂、冷却剂润滑剂(如，油性冷却剂润滑剂乳液)；工业系统的处理液等，限制在于其应该可以使用如过滤或沉淀的分离方法分离微生物。产品以固体或液体形式存在在此情况下无关紧要。
由于方法步骤的相对简单的操作和特定组合，本发明的方法特别适合自动化(如在生产和/或质量控制过程中)。在生产和/或质量控制之外(如在液体表面活性剂产品、分散体、腌制产品等的包装过程中)，本发明的方法还适合，例如调查故障或污染的场合以确定微生物状态，或用于评估产品卫生措施，或还用于优化或检查设施清洁操作(如在用于生产腌制产品的设施中)，例如用于在位清洁(CIP)和在位灭菌(SIP)过程中。
本发明的方法通常按照下面的方式进行：含有待定量和/或定性确定的微生物的样品被引入到合适的样品容器中，该容器应以无微生物的方式密封，其底部具有通常为圆形的膜。膜滤器的外缘与样品容器接触，所以外缘的同心圆没有微生物聚集。如果待调查的样品含有抑制微生物或杀微生物的物质或组分(如防腐剂或表面活性剂)，首先通过将样品与合适的灭活和/或调节溶液接触而灭活和/或去除这些物质或组分，特别是持续一段足以灭活和/或去除这些物质或组分的时间。灭活和/或调节溶液通过膜滤器在超压或真空作用下除去。过多的或剩余的灭活和/或调节溶液如果需要用水洗涤一次或数次通过膜滤器除去，通常使用超压或真空，以使洗涤的水以简单的方式去除。其后通过至少一种荧光标记物标记样品中至少一些微生物。为此，微生物可以与，例如荧光标记物的溶液或分散体接触，维持一段足以标记微生物的时间。过多的荧光标记物溶液或分散体然后再次使用超压或真空通过膜滤器去除。最后，如果可行，样品能够用水、缓冲液或其他液体进行单次或多次淋洗以除去多余的荧光标记物。在通过膜滤器使用超压或真空抽出水后，膜滤器最终与样品容器分离，产生聚集有荧光标记的微生物的膜滤器，其外缘没有微生物。这可以立即用于荧光反射光度测量，即通常无需对样品或滤器进一步准备或处理。在通过荧光反射光度测量的过程中，聚集有荧光标记的微生物的膜滤器用合适波长的光照射，即在该过程中被扫描。确认的测量值与膜滤器上或样品中的微生物计数相关。对下面的不同粘度的洗涤剂产品，使用本发明的设备进行研究：
  产品类别  粘度计   粘度(mPa)   温度(℃)   转动速率(min-1)   轴号
  精细纺织品洗涤剂  Brookfield LV   200   20   30   31
  调节剂  BrookfieldLVDV II+   175   20   20   31
  调节剂  BrookfieldLVDV II+   150   20   20   31
  手洗餐具洗涤液  BrookfieldLVDV II+   400   20   30   31
  手洗餐具洗涤液  BrookfieldLVDV II+   1500   20   30   31
  重垢型液体清洁剂  Brookfield RV   1800   20   20   3
  重垢型液体清洁剂  Brookfield RV   1500   20   20   2
  重垢型液体清洁剂  BrookfieldRVDV II+   2750   20   20   3
  重垢型液体清洁剂  BrookfieldRVDV II+   2750   20   20   3
本发明方法在自动处理情形下的典型过程顺序包括，例如，用户将确定量(如1mL)的样品置于以无微生物方式密封，并含有调节培养基或灭活培养基和在外缘具有膜滤器的预设样品容器中。启动测量程序，使样品振荡并根据微生物的类型而恒温控制在合适的温度(如37℃)。在配置的一段时间后，培养基从膜滤器滤掉。用无微生物的水、缓冲液或其他液体进行一次或多次洗涤步骤，然后按顺序自动洗出样品中含有的物质，接着用荧光标记物标记。根据要求不同，标记可以使用结合样品中所有微生物的非特异性荧光标记(如与核苷酸片段结合)，或使用DEFT方法辨别所有活的和“死的”微生物的标记物，或在第三种情况下使用基于FISH技术的荧光标记物完成，其可以选择性使用基因标记的荧光探针对个别微生物染色。在标记步骤之后，过多的标记溶液再次自动化地用水洗去，以便在自动化操作流程完成后，荧光标记的微生物出现在膜滤器上。使用荧光反射光度计或分光计自动化测量各荧光的强度及微生物数。用合适波长的光照射滤膜，由标记的微生物激发的荧光以相应的波长分辨的方式检测。随后的评估将膜边缘区域的强度，该区域应该没有聚集微生物，与带有标记微生物的区域的强度比较，并根据储存的标准曲线计算样品中微生物的数量。
本发明的方法具有一些优点；最主要的一些将在下文讨论，但不是以限制性的方式。
本发明方法的一个优点在于其可以以自动化方式实施。整个过程的全部自动化表明该方法可以更简单，更快捷和更可重复性地实施。这在成本、人力需求和灵敏度上产生优势。进行研究时有好的可重复性同样是非常有利的。
本发明方法的其他优点在于其不需要落射荧光显微镜。用简化的评估和检测方法和系统(即，使用荧光反射光度测量)取代现有技术使用的落射荧光显微镜降低了用户在工作中的费用和固定设备，样品的评估可以完全自动化的进行(如，使用对应的算法)。辐射的影响也可以降低。
本发明方法的另一个优点是使用标准化的或常规的组分：实施本发明的方法所需的整个系统以可以使用多个标准化的或常规的组分(容器、培养基、滤器等)的方式整合，因此降低操作者的工作量并增强该方法的可靠性。
本发明方法的另一个优点是其简单的检测和评估：本发明的方法可以例如在合适的样品容器中进行，以使标记的微生物制备在合适的滤膜上。合适的膜大小(如8mm直径)的选择和不聚集微生物的同心圆边缘使各样品可以参考和内部标准化。
本发明方法的另一个优点是实施本发明的方法的速度：本发明的方法可以允许根据微生物的类型和其数量，在只有数分钟(大约3到5)后确定微生物计数。而相对的常规的培养方法，需要最长达数天。
本发明的方法的高灵敏度也是特别具有优势的：本发明的方法可以在高稀释度下检测微生物。加速的培养方法还不够灵敏到足以检测每毫升样品体积10CFUs的界限。
本发明方法的其他优点在于荧光标记的微生物只在相对短的时间内暴露给辐射，因为测量值可以相对快速地通过荧光反射光度测量获得。结果，几乎可以完全避免荧光标记合的任何“漂白”和测量结果的失真。这也避免杀死活的微生物，这在辨别活的/死的微生物的情况下是非常重要的。
本发明的方法或通过荧光反射光度测量进行评估的情况下对样品的“扫描”(或更精确对聚集有荧光标记的微生物的膜滤器的扫描)产生另外的优点：一方面，扫描可以激发大的区域，另一方面，尤其是与常规的具有限制的传感区域的荧光显微镜相比，伴随短的比较可以实现高的单点激发密度。扫描形成对样品均匀的照明尤其在密度测量的过程中是非常重要的。
最后，本发明的用户友好性可以看作是另外的一个优点。测定样品中微生物含量的整个过程包括，在自动化执行的过程中，简单添加样品和启动顺序。用户然后接收微生物含量的数值。用于样品制备和测量的工作是最少的。因此系统还可以，理想情况下掺入到处理系统中用于监控、保证和记录质量。
根据本发明的第二方面，本发明还涉及如权利要求28所述的设备，用于定量和/或定性测定样品中的微生物，采用的方法是样品制备和随后检测和/或评估，在样品制备过程中可通过设备用至少一种荧光标记物标记样品中至少一些微生物，及检测和/或评估可利用荧光标记物，尤其是用于实施前面的方法权利要求限定的方法。
本发明设备的另外有利的实施方案是独立的设备权利要求的主题(权利要求29到36)。涉及本发明方法的陈述对应地适用于本发明的设备。
在附图中，图1示意性地描绘了用于实施定量和/或定性确定样品中微生物的方法的设备。该设备的基础是样品接收容器1。该样品接收容器1，如示意图所示，在设备中通过各种线2连接到通风口4和压缩空气5的控制阀3，并通过泵6连接到染料7(“荧光标记”)和淋洗溶液8的连接器。无菌的滤器2a整合到各个线2上。
图1示意性显示了已经阐述的相互关系。该设备的操作方式逻辑上遵循方法权利要求中阐述的步骤。
安置在样品接收容器1的出口处--如优选的示例性的实施方案中阐述，位于样品接收容器1的底部--是在示例性实施方案中表示为简单的圆盘的膜滤器9。后者在实施时截留待检测的微生物和/或对待检测的微生物是不透过的。还提供经配置通过荧光反射光度进行测量的检测系统10，为检测和/或评估目的，其上面还可放置带有膜滤器9的样品接收容器1，或优选地除去样品接收容器1的膜滤器9。总体的结构显示于图2的荧光反射光度检测系统10中对聚集微生物的膜9的分析在示例性的实施方案中使用图1显示的计算机控制的控制和/或评估装置11来完成。
图1还以指示性的方式显示样品接收容器1底部的膜滤器9。这表明在图1显示的示例性的实施方案中，膜滤器9能从样品接收容器1的下方除去以通过检测系统10。这种安排的具体外观可以由本领域的技术人员来设计。
如果膜滤器9是有孔的，特别是聚碳酸酯膜滤器；以及如果，特别地，膜滤器9的孔径小于样品中出现的或期望出现的待检测的微生物的大小，则是特别有优势的。
特别优选使用硅微筛代替膜滤器9。使用硅微筛的优点在上文中已经详细讨论。这里还将提到硅微筛可以普遍用于本发明的设备上代替膜滤器。
在样品接收容器1内的安排和膜滤器9从样品接收容器1中分离以检测标记的微生物方面，推荐使用基准面以使各样品可以自给自足的标准化。根据优选的实施方案，为上述目的可以规定：安置于样品接受容器1内的膜滤器9具有区域12，尤其是不能或实际上不能在样品制备时聚集微生物，并用作实施检测和/或评估时的基准面的边缘区域。未聚集标记的区域或边缘12使得样品本身在膜滤器9上的内标化。
关于膜滤器9和样品接受收容器1的大小，对所示用途而言，推荐膜滤器9具有有效过滤的直径从大约5到大约25mm，特别是大约6mm到大约12mm，优选大约8mm到大约10mm。
上文已经提到膜滤器9保留微生物，即用荧光标记物标记的微生物保留在膜滤器9的上侧。为此目的，推荐选择对膜滤器9可透过的荧光标记物以在检测系统10中达到理想的信号-噪声比率。为在样品接收容器1内处理样品，必须在膜滤器9上分离荧光标记(“标记的”)的微生物。关于设备，为此推荐使用滴注的装置、抽吸装置(真空抽吸)，和/或滴注和收集膜滤器9上方的样品液体和/或接受荧光标记物和/或淋洗液体的排出装置。图1显示的示例性实施方案表明，使用压缩空气5完成排出的变体形式。
最后关于设备，图1还显示设备包括用于样品接收容器1的恒温控制的恒温装置13。此处可见的恒温装置13具有总共四个接受口，所以可以同时恒温控制总共四个样品接收容器1至由目标微生物决定的通常需要的温度(如37℃)。
图2显示本发明使用的荧光反射光度检测系统10的基本结构。评估装置11控制将测量参数传送给电子控制系统15用于激发光学系统16的中央控制器14和定位平台17。测量样本，即此由情形下聚集有标记微生物的膜滤器9定位在定位平台17上。从激发光学系统16发射到测量标本18上的激发光以荧光形式被反射到检测光学系统19。检测的信号传递到电子检测系统20，其随后提供给控制器14。简化的荧光反射光度检测系统10取代复杂的落射显微镜降低了用户的资金开销。
根据本申请的第三方面，本发明还进一步涉及根据上文所述的本发明的设备的使用，构成应用型权利要求的主题(权利要求37到39)。
本发明另外的实施方案、修饰、变体和优点对本领域的技术人员是显而易见的，并且在阅读本说明书后无需脱离本发明内容的前提下得以实现。

Claims (39)

1.定量和/或定性测定样品中微生物的方法，该方法包括样品制备步骤(a)和检测和/或评估步骤(b)，在步骤(a)中利用至少一种荧光标记物标记样品含有的至少一些微生物，及在步骤(b)中完成定量和/或定性检测和/或评估，
其中
在步骤(b)中进行的检测和/或评估通过荧光反射光度测量完成。
2.权利要求1的方法，其中在通过荧光反射光度测量确定的测量值的基础上，特别是通过合适的校准，确定样品中存在的微生物的数量。
3.权利要求1或2的方法，其中在步骤(a)的样品制备过程中，荧光标记的微生物被施加到硅微筛上，所述硅微筛截留微生物和/或对微生物是不透过的。
4.权利要求1或2的方法，其中在步骤(a)的样品制备过程中，荧光标记的微生物被施加到有孔的膜滤器，特别是聚碳酸酯膜滤器上，所述膜滤器截留微生物和/或对微生物是不透过的。
5.权利要求3或4的方法，其中膜滤器或硅微筛的孔径选择小于样品中存在的微生物的大小。
6.权利要求3到5之一的方法，其中通过荧光反射光度测量进行的检测和/或评估直接在膜滤器或微筛上完成，特别地，不需要进一步处理或制备或转移样品。
7.权利要求1到6之一的方法，其中选择荧光标记物使其对步骤(a)中进行样品制备使用的膜滤器而言是可透过的，或对使用的硅微筛而言是可透过的。
8.权利要求1到7之一的方法，其中样品制备步骤(a)还包括灭活和/或除去样品可能存在的抑制微生物和/或杀微生物的物质或组分，特别是防腐剂或表面活性剂，尤其是其中灭活和/或除去样品中存在的抑制微生物和/或杀微生物的物质或组分可以通过将样品与合适的灭活和/或调节溶液接触而完成。
9.权利要求1到8之一的方法，其中选择荧光标记物使其与微生物相互作用，特别是结合到微生物上，特别是结合到它们的细胞壁(包膜)和/或核酸上，和/或被这些微生物摄入，特别是被代谢和/或被酶转化。
10.权利要求1到9之一的方法，其中非微生物特异的荧光标记物或非微生物特异的荧光标记物的混合物用作荧光标记物。
11.权利要求1到9之一的方法，其中微生物特异的荧光标记物或不同微生物特异的荧光标记物的混合物用作荧光标记物。
12.权利要求1到9之一的方法，其中非微生物特异的荧光标记物和微生物特异的荧光标记物的混合物用作荧光标记物。
13.权利要求1到12之一的方法，其中与活的微生物相互作用的荧光标记物用作荧光标记物。
14.权利要求1到12之一的方法，其中与死的微生物相互作用的荧光标记物用作荧光标记物。
15.权利要求1到12之一的方法，其中与活的微生物相互作用的荧光标记物和与死的微生物相互作用的荧光标记物的混合物用作荧光标记物，以区分样品中存在的活的/死的微生物。
16.权利要求1到15之一的方法，其中在落射荧光显微镜或在直接落射过滤技术(DEFT)或在膜滤器微菌落荧光(MMCF)方法中通常用于微生物标记的荧光标记物用作荧光标记物。
17.权利要求1到16之一的方法，其中荧光染料或这种荧光染料的前体用作荧光标记物，从所述前体通过与微生物作用，尤其是通过代谢和/或酶转化产生所述荧光染料。
18.权利要求16的方法，其中荧光染料选自3，6-双[二甲基氨基]吖啶(吖啶橙)，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，3，8-二氨基-5-乙基-6-phenylphenanthridinium溴化物(溴乙锭)，3，8-二氨基-5-[3-(diethylmethyammonio)丙基]-6-phenylphenanthridinium diiodide(碘化丙锭)，罗丹明如罗丹明B和磺酰罗丹明B，和荧光素异硫氰酸酯。
19.权利要求1-18之一的方法，其中尤其是微生物特异的核酸探针用作荧光标记物，该探针又特别是用荧光基团或荧光分子而被荧光标记，特别其中荧光基团或荧光分子可以共价或其他方式结合到核酸探针上，和/或特别其中核酸探针包括荧光标记的寡核苷酸或多核苷酸，和/或特别其中核酸探针是荧光标记的DNA或RNA探针。
20.权利要求19的方法，其中在荧光原位杂交(FISH)中通常用于标记的核酸探针用作核酸探针。
21.权利要求1-20之一的方法，其中尤其是微生物特异性抗体用作荧光标记物，该抗体又特别是用荧光基团或荧光分子而被荧光标记，特别其中荧光基团或荧光分子可以共价或其他方式结合到抗体上。
22.权利要求1-21之一的方法，其中微生物的检测界限为≤100菌落形成单位(CFUs)/毫升样品体积，优选≤10菌落形成单位(CFUs)/毫升样品体积。
23.权利要求1-22之一的方法，其中待检测的微生物是各种病源微生物，特别是单细胞微生物，如细菌和真菌(如酵母或霉菌)。
24.权利要求1-23之一的方法，用于定量和/或定性确定食品、含表面活性剂的产品如洗涤和清洁剂、表面处理剂、分散产品、化妆品、卫生用品和个人护理产品、药物、粘合剂、冷却剂润滑剂、涂料和(涂层)凝结剂，及上述产品的原材料和起始物质中的微生物。
25.权利要求1-24之一的方法，用于定量和/或定性确定可滤过的微生物，尤其是液体和/或有孔产品中的微生物。
26.权利要求1-25之一的方法，其中该方法是自动化的。
27.权利要求1-26之一的方法，其中该方法在生产监测和/或质量控制的过程中进行。
28.采用下列方法进行定量和/或定性确定样品中微生物的设备：样品制备和随后检测和/或评估，用至少一种在样品制备过程中通过该设备标记的荧光标记物标记样品中存在的至少一些微生物，利用该荧光染料进行检测和/或评估，特别地，用于实施上述方法权利要求之一的方法，
特征在于
-样品接受容器(1)；
-硅微筛或膜滤器(9)，其实施用于截留待检测的微生物和/或对待检测的微生物是不可透过的，其安置于样品接受容器(1)的出口，特别是在其底部；
-配置用于通过荧光反射光度测量进行测量的检测系统(10)，并且为检测和/或评估的目的可以放置于带有硅微筛或膜滤器(9)的样品接受容器(1)上，或优选放置于从样品接受容器(1)取出的硅微筛或膜滤器(9)上。
29.权利要求28的设备，其中计算机控制的控制和/或评估装置(11)作为检测系统(10)的一部分，或提供用于控制检测系统(10)。
30.权利要求28或29的设备，其中该设备中用硅微筛取代膜滤器(9)。
31.权利要求28或29的设备，其中膜滤器(9)是有孔的膜滤器，特别是聚碳酸酯膜滤器。
32.权利要求30或31的设备，其中膜滤器(9)或硅微筛的孔经小于样品中存在的和/或期待在样品中出现的待检测的微生物的大小。
33.权利要求28-32之一的设备，其中安置于样品接受容器(1)内的膜滤器(9)或硅微筛具有区域(12)，特别是在样品制备过程中不能或实际上不能聚集微生物，并用作检测和/或评估性能时的基准面的边缘。
34.权利要求28-33之一的设备，其中膜滤器(9)或硅微筛具有有效过滤的直径，从大约5mm到大约25mm，尤其是从大约6mm到大约12mm，优选从大约8mm到大约10mm。
35.权利要求28-34之一的设备，其中样品接受容器(1)包括滴注装置、抽吸装置，和/或用于滴注、抽吸和/或排出膜滤器(9)或硅微筛上方存在的样品液体和/或接收荧光标记物的液体和/或淋洗液体的排出装置。
36.权利要求28-35之一的设备，其中该设备含有用于恒温控制样品接收容器1的恒温装置(13)。
37.权利要求28到36之一的设备的应用，用于定量和/或定性检测食品、含表面活性剂的产品如洗涤和清洁剂、表面处理剂、分散产品、化妆品、卫生用品和个人护理产品、药物、粘合剂、冷却剂润滑剂、涂料和(涂层)凝结剂，及上述产品的原材料和起始物质中的微生物。
38.权利要求28到36之一的设备的应用，用于定量和/或定性检测可滤过的，特别是液体和/或可灌注产品，尤其是培养基、溶液、液体、基质等中的微生物。
39.权利要求28到36之一的设备的应用，优选用于自动化生产和/或质量控制。
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