CN104297038A

CN104297038A - 结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液

Info

Publication number: CN104297038A
Application number: CN201410530103.9A
Authority: CN
Inventors: 丁昊; 刘正华; 吴晓渊
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-10-10
Filing date: 2014-10-10
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2034-10-10
Also published as: CN104297038B

Abstract

本发明提供了一种结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，由（1）染色剂、（2）脱色剂、（3）复染剂、（4）抗衰减试剂组成；其中，（1）染色剂中以罗丹明B为荧光染料、以含有醇羟基的醚为渗透剂；（2）脱色剂为盐酸酒精溶液；（3）复染剂为高锰酸钾水溶液；（4）抗衰减试剂为油溶性抗氧化剂的有机溶液。本发明的抗酸染色染液的配方，选择无毒的渗透剂替代苯酚，引导染色素透过菌细胞壁，实现对抗酸菌染色。选择无害的荧光色素来替代传统使用的有毒和有潜在致癌性的金胺O。加入无毒害的抗衰减试剂，降低激发光源对染色片的荧光漂白（衰减）作用，延长染色涂片可观察时间和保存时间。

Description

结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液

技术领域

本发明属于医学检验技术，特别涉及一种分枝杆菌荧光抗酸染色染液。

背景技术

近年来，结核病的流行在世界有卷土重来的趋势。结核病的发病率和死亡人数在我国27种法定传染病中均占据前位。中国是全球22个结核病高负担国家之一，肺结核病人数位于全球第二位，耐多药病人数占全球耐多药病人数的三分之一。全国结核病患者达500万，结核菌感染人数达5.5亿，每年新增结核病患者130万，其中传染性肺结核病人60万，每年因结核病死亡人数达13万。由于人口基数大，疫情严重，加之流动人口增多、耐药结核病流行及结核病和艾滋病的双重感染，使结核病疫情下降缓慢。要有效地防治结核病、控制结核病疫情，首先必须早期发现病人。

结核病是由结核分枝杆菌引起的疾病。目前，结核病的病原学诊断主要有结核分枝杆菌表型（涂片染色镜检和培养）及基因型检测。培养技术具有一定的难度，设备要求高、需时长；基因技术虽然较快，但技术要求更高，设备和试剂更贵，目前还处于研究阶段，难于在广大临床和基层结控系统普及。结核分枝杆菌涂片抗酸染色虽然敏感性稍差，但由于其操作简单、经济、快速，至今还作为结核诊断的经典方法而被广泛使用。

自十九世纪八十年代初，Ziehl和Neelsen（参考文献Bishop PJ, Neuman G. The history of the Ziehl–Neelsen stain.Tubercle 1970; 51:196-206.）共同发明了分枝杆菌抗酸染色方法（萋-纳法，即ZN法）以来，在一百三十年间，国内外也有不少学者对分枝杆菌抗酸染色方法进行改进，比如改良的冷萋-纳法（即Kinyoun法，参考文献：Kent P,Kubica GP.Acid fast microscopy.In:Public Health Mycobacteriology: A guide for the level III laboratory. Atlanta, Georgia: US Department of Health and Human Services, 1985, p. 57-69.），荧光染色法（参考文献：Steingart KR,Henry M,Ng V,et al.Fluorescence versus conventional sputum Smear microscopy for tuberculosis:a systematic review.Lancet Infect Dis,2006a(6): 570-581） (即金胺O或金胺O-罗丹明复合染色)等。其中荧光法较萋-纳法敏感性好,阳性率高，可缩短看片时间，但由于荧光检查使用高压汞灯（或氙灯）作为荧光激发光源，成本高寿命短，使用时产生大量紫外线对人体造成损害。激发光源对染色涂片的荧光漂白（衰减）作用，使可观察的时间缩短，以及需昂贵设备，一直不能推广。无论是萋-纳法、Kinyoun法还是荧光法，所有染液都使用苯酚(石炭酸)作为染料进入菌细胞壁的渗透剂。尽管许多学者都做了很多改进，如染色时间、温度、色素浓度、脱色剂及对比剂等，目前还没有发现不使用苯酚的分枝杆菌抗酸染色方法。众所周知，苯酚具有毒性和很强的刺激性，其毒性属高毒类，易通过呼吸道和皮肤被人体吸收，造成健康危害。苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝肾功能。急性中毒：吸入高浓度蒸气可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿、肝或肾损害，出现急性肾功能和呼吸衰竭。眼接触可致灼伤。可经灼伤皮肤吸收经一定潜伏期后引起急性肾功能衰竭。慢性中毒：可引起头痛、头晕、咳嗽、食欲减退、恶心、呕吐，严重者引起蛋白尿。可致皮炎。

在萋-纳法中需要对染液加热，产生大量气溶胶，加大操作人员中毒的风险。荧光染色法采用金胺O作为荧光染料，金胺O是高毒化学试剂，长期使用有潜在的致癌性。由于对抗酸染色方法做根本性改变有相当的难度；另一方面这也是被广大学者遗忘的角落，因此一百多年来一直没有根本的改变。

本发明的目的是考虑上述方法中存在的有害因素，我们设想选择没有毒性的材料来替代苯酚作为渗透剂；选用没有潜在致癌性的荧光染料替代金胺O，配制出一种新的结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，另外，加入抗衰减试剂，降低激发光源对染色片的荧光漂白（衰减）作用，延长染色涂片可观察时间和保存时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，以解决现有技术中存在的有害因素的问题。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，由（1）染色剂、（2）脱色剂、（3）复染剂、（4）抗衰减试剂组成；其中，（1）染色剂中以罗丹明B为荧光染料、以含有醇羟基的醚为渗透剂；（2）脱色剂为盐酸酒精溶液；（3）复染剂为高锰酸钾水溶液；（4）抗衰减试剂为油溶性抗氧化剂的有机溶液。

所述染色剂由罗丹明B、含有醇羟基的醚、甘油、乙醇、浓盐酸、蒸馏水组成。

所述染色剂中，每100mL所含组分组成为：罗丹明B 0.25～1g、含有醇羟基的醚 0.75～3mL、甘油10mL、体积分数为95%的乙醇75mL、浓盐酸 3mL、其余为蒸馏水。

所述含有醇羟基的醚为乙二醇一乙醚、二乙二醇乙醚、乙二醇二乙醚的一种。

所述脱色剂由乙醇与浓盐酸组成。

所述脱色剂中，每100mL的体积分数为70%乙醇中含有0.25～1mL的浓盐酸。

所述复染剂为质量浓度为0.5%的高锰酸钾水溶液。

所述抗衰减试剂中由油溶性抗氧化剂、甘油、乙醇组成。

所述抗衰减试剂中，每100mL所含组分组成为：油溶性抗氧化剂0.5～2g、甘油10mL、体积分数为95%的乙醇 90mL。

所述抗衰减试剂中，油溶性抗氧化剂为丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、特丁基对苯二酚、没食子酸丙酯的一种。

本发明的有益效果是：本发明的抗酸染色染液的配方，选择无毒的渗透剂替代苯酚，引导染色素透过菌细胞壁，实现对抗酸菌染色。选择无害的荧光色素来替代传统使用的有毒和有潜在致癌性的金胺O。加入无毒害的抗衰减试剂，降低激发光源对染色片的荧光漂白（衰减）作用，延长染色涂片可观察时间和保存时间。可以消除抗酸染色过程中苯酚毒害的危险和荧光染色中金胺O潜在致癌性的威胁。继承了荧光染色法的快速、敏感、简单等固有优点，又避免了荧光快速衰减的缺点，有利于本发明的推广。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

配制结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液：

（1）染色剂

罗丹明B 1g

乙二醇一乙醚 2mL

甘油 10mL

95%的乙醇 75mL

浓盐酸 3mL

加蒸馏水至100mL

（2）脱色剂

70%乙醇100mL

浓盐酸0.5mL

（3）复染剂

0.5%高锰酸钾

（4）抗衰减试剂

没食子酸丙酯 1.5g

甘油10mL

95%的乙醇 90mL。

用上述染液H₃₇Ra进行染色，获得明确阳性结果；同时用此染液对一株革兰阳性菌株进行抗酸荧光染色，结果为阴性，证明该染液有可行性。

选取南京市胸科医院300份肺结核及疑似肺结核患者痰标本，分别采用常规抗酸染色染料和本实施例配制的结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液来检查痰中结核杆菌，比较两组阳性率。

染色步骤：痰涂片火焰固定，平放染色架上；加染色剂盖满痰膜，染色10～15min，水洗；加脱色剂盖满痰膜，脱色3～5min，至无红色，水洗；加复染剂盖满痰膜，染色2min，水洗；加抗衰减试剂，干后，镜检。

在暗色背景下，抗酸杆菌呈橙色荧光。

荧光显微镜检查，20×物镜计数，40×物镜观察抗酸杆菌形态。

荧光染色后在24h内完成检查，需隔夜时，置痰涂片于暗处保存，次日完成检查。

荧光显微镜20×物镜镜检结果按下列标准报告：

视野内未发现抗酸杆菌，报告抗酸杆菌阴性(一)。

视野内发现抗酸杆菌1～9条，报告抗酸杆菌条数。应以抗酸染色法复染或涂片复检结果报告之。

视野内发现抗酸杆菌10～100条，报告抗酸杆菌阳性(1+)。

平均每一视野内发现抗酸杆菌1～10条，报告抗酸杆菌阳性(++)。

平均每一视野内发现抗酸杆菌11～200条，报告抗酸杆菌阳性(+++)。

平均每一视野内发现抗酸杆菌多于200条，报告抗酸杆菌阳性(++++)。

结果：常规荧光染液组检出结核分枝杆菌阳性91例，阳性率为30.3％，其中（<+）、(+)、(++)、(+++)、(++++)阳性率分别占5.7%、10.2％、6.0％、4.7％和3.7％；采用本实施例的74例，阳性率为24.7％，其中(<+)、 (+)、(++)、(+++)、(++++)分别占2.7％、8.3％、6.7％、5.0％、2.0％。两组总阳性率及(<+)阳性率比较P均<0.05。

实施例2

配制结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液：

（1）染色剂

罗丹明B 0.25g

乙二醇二乙醚 3mL

甘油10mL

95%的乙醇 75mL

浓盐酸 3mL

加蒸馏水至100mL

（2）脱色剂

70%乙醇100mL

浓盐酸1mL

（3）复染剂

0.5%高锰酸钾

（4）抗衰减试剂

特丁基对苯二酚0.5g

甘油10mL

95%的乙醇 90mL。

选取南京市胸科医院300份肺结核及疑似肺结核患者痰标本，采用本实施例配制的结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液来检查痰中结核杆菌，比较两组阳性率。方法同实施例1。

结果：抗酸染色组阳性88例，阳性率为29.3％，其中(<+)、 (+)、(++)、(+++)、(++++)分别占3.5％、9.0％、7.2％、6.9％、2.7％。

实施例3

配制结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液：

（1）染色剂

罗丹明B 1g

二乙二醇乙醚0.75mL

甘油10mL

95%的乙醇 75mL

浓盐酸 3mL

加蒸馏水至100mL

（2）脱色剂

70%乙醇100mL

浓盐酸0.25mL

（3）复染剂

0.5%高锰酸钾

（4）抗衰减试剂

二丁基羟基甲苯2g

甘油10mL

95%的乙醇 90mL。

结果：抗酸染色组阳性92例，阳性率为30.6％，其中（<+）、(+)、(++)、(+++)、(++++)阳性率分别占6.0%、9.2％、7.2％、4.3％和3.9％。

实施例4

配制结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液：

（1）染色剂

罗丹明B 0.5g

乙二醇二乙醚1.5mL

甘油10mL

95%的乙醇 75mL

浓盐酸 3mL

加蒸馏水至100mL

（2）脱色剂

70%乙醇100mL

浓盐酸0.6mL

（3）复染剂

0.5%高锰酸钾

（4）抗衰减试剂

丁基羟基茴香醚1g

甘油10mL

95%的乙醇 90mL。

结果：抗酸染色组阳性85例，阳性率为28.3％，其中（<+）、(+)、(++)、(+++)、(++++)阳性率分别占7.2%、6.8％、5.9％、4.8％和3.6％。

Claims

1.一种结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，其特征在于：由（1）染色剂、（2）脱色剂、（3）复染剂、（4）抗衰减试剂组成；其中，（1）染色剂中以罗丹明B为荧光染料、以含有醇羟基的醚为渗透剂；（2）脱色剂为盐酸酒精溶液；（3）复染剂为高锰酸钾水溶液；（4）抗衰减试剂为油溶性抗氧化剂的有机溶液。

2.如权利要求1所述的结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，其特征在于：所述染色剂由罗丹明B、含有醇羟基的醚、甘油、乙醇、浓盐酸、蒸馏水组成。

3.如权利要求2所述的结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，其特征在于：所述染色剂中，每100mL所含组分组成为：罗丹明B 0.25～1g、含有醇羟基的醚 0.75～3mL、甘油10mL、体积分数为95%的乙醇75mL、浓盐酸 3mL、其余为蒸馏水。

4.如权利要求1、2、3任一所述的结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，其特征在于：所述含有醇羟基的醚为乙二醇一乙醚、二乙二醇乙醚、乙二醇二乙醚的一种。

5.如权利要求1所述的结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，其特征在于：所述脱色剂由乙醇与浓盐酸组成。

6.如权利要求5所述的结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，其特征在于：所述脱色剂中，每100mL的体积分数为70%乙醇中含有0.25～1mL的浓盐酸。

7.如权利要求1所述的结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，其特征在于：所述复染剂为质量浓度为0.5%的高锰酸钾水溶液。

8.如权利要求1所述的结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，其特征在于：所述抗衰减试剂中由油溶性抗氧化剂、甘油、乙醇组成。

9.如权利要求1所述的结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，其特征在于：所述抗衰减试剂中，每100mL所含组分组成为：油溶性抗氧化剂0.5～2g、甘油10mL、体积分数为95%的乙醇 90mL。

10.如权利要求1、8、9任一所述的结核分枝杆菌荧光抗酸染色染液，其特征在于：所述抗衰减试剂中，油溶性抗氧化剂为丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、特丁基对苯二酚、没食子酸丙酯的一种。