CN104711315A - 一种肺炎链球菌的荚膜染色方法 - Google Patents

Abstract

本发明“一种肺炎链球菌的荚膜染色方法”涉及微生物检测领域。包括以下步骤：(1)制备细菌标本；(2)涂片：取少量所述细菌标本，均匀涂于洁净载玻片上，刮成薄层，自然晾干；(3)染色：滴加100-150μl的石碳酸复红染液于载玻片上，使之覆盖均匀，自然晾干；(4)媒染：用水冲洗，自然晾干，滴加媒染剂，均匀覆盖3-5min，用水冲洗，自然晾干；(5)镜检。本发明提供的针对肺炎链球菌的荚膜染色方法简单易行、耗时短、成功率高、重复性好，能够快速、高效地进行肺炎链球菌的菌种鉴定，在肺炎的临床诊断中有良好的应用前景。

Description

一种肺炎链球菌的荚膜染色方法

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，尤其涉及一种肺炎链球菌的荚膜染色方法。

背景技术

荚膜是细菌在一定条件下分泌的粘液或胶态物质，通常是由多糖类、多肽类或多糖蛋白复合体组成，不同的细菌其荚膜成分也有一定差异。肺炎链球菌荚膜主要是由多糖组成，根据荚膜成分的不同可以分为90多个血清型(丁绍卿，叶人邦，袁曾麟.肺炎链球菌血清学分型的研究.生物制品学杂志.1988,1(1):18-22)，且不同型别的血清型荚膜厚度有所不同。荚膜作为细菌的一种特殊结构，荚膜的低折光性与亲和染料能力差等特性，使其不易着色，制作一张好的荚膜染色玻片需要正确的染色方法和一定的熟练程度。

传统的细菌荚膜染色方法有赫氏(Hiss)染色法、墨汁染色法、Tyler染色法等。凌体淑等人在之前的基础上创建了新的细菌荚膜染色法(凌体淑，叶迎春，赵世鸿，等.细菌荚膜染色的创新.现代医学检验杂志.2004，19(4):35-36)。郭淑清等人以肺炎链球菌为例对荚膜染色方法进行了改良(郭淑清，徐晓莉.荚膜染色法的改良.山西医科大学学报.2001，32(3)：276)。现有的荚膜染色法操作过程如下：

1.赫氏(Hiss)染色法：

将荚膜菌涂片，在空气中自然干燥，不需加热固定。滴加结晶紫染色液，在火焰上微微加热，使玻片上染液冒蒸汽为止，不要水洗，再用200g/L硫酸铜水溶液冲洗染液，切勿用流水冲洗。用吸水纸吸干后油镜观察。

观察结果，菌体及背景呈紫色，荚膜呈淡紫色或无色。

2.墨汁染色法：

在载玻片上滴1滴印度墨水或黑色素水溶液，接种环取菌液一环，与染色液混合均匀，取另一块干净的载玻片将混合物自载玻片一侧平挂至另一侧，又平挂回来，使形成一薄层，在空气中干燥。用吸水纸吸干后油镜观察。

观察结果：菌体及背景呈黑色，荚膜无色。

3.Tyler法：

按常规法涂片，在空气中自然干燥。用Tyler染色液染5-7min，用20％CuSO₄水溶液洗去结晶紫；用吸水纸吸干，并立即加1-2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO₄结晶的形成；先用低倍镜再用高倍镜观察。

结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。

4.改良荚膜染色法：(凌体淑，叶迎春，赵世鸿，等.细菌荚膜染色的创新.现代医学检

验杂志.2004,19(4):35-36)

①菌涂片的制备：将肺炎链球菌接种于血清肉汤培养基，注射于小白鼠腹腔内，在小白鼠腹腔内注射荚膜保护液，抽出腹腔液，再注射到另外的健康小白鼠腹腔内，然后取腹腔液涂片。

②荚膜染色:将上述涂片在空气中自然干燥、固定，用5g/dl石碳酸复红染色3m in(染液提前30m in放37℃水浴箱预热)，用水冲去染液，倾去玻片上余水，再用特殊媒染剂染3min，水冲洗，最后用1.48g/dl美蓝酒精饱和溶液染0.5m in，水冲洗，干燥后油镜观察。

③结果：肺炎链球菌菌体呈紫红色，荚膜呈浅蓝色，背景无色。

上述方法以及其它的一些方法都存在一定的缺点：首先，操作过程比较复杂，对实验员的操作技能要求较高，容导致实验失败，重复性较差；其次，这些方法染色后能看到清晰荚膜的菌体很少，需要在显微镜下大范围查找，实际操作不方便；再次，由于细菌荚膜含水量高，加热会使菌体失水收缩，与细胞周围染料脱离而产生透明的明亮区，导致假阳性出现。此外，一些改良的荚膜染色方法，对荚膜的形态要求较高，在制备菌片的过程为增强荚膜染色效果，需要添加荚膜保护液，操作繁琐，耗时较长，并且成功率较低，重复性差。

荚膜染色是肺炎链球菌菌种检定中的一项重要检测指标，因此，建立一种快速、简便、染色效果好的荚膜染色方法是非常必要的。

发明内容

为满足上述领域的需求，本发明提供一种针对肺炎链球菌的快速、高效的荚膜染色方法。

本发明请求保护的技术方案如下：

一种用于肺炎链球菌的荚膜染色方法，包括以下步骤：

(1)制备细菌标本；

(2)涂片：取少量所述细菌标本，均匀涂于洁净载玻片上，刮成薄层，自然晾干；

(3)染色：滴加100-150μl的石碳酸复红染液于载玻片上，使之覆盖均匀，自然晾干；

(4)媒染：用水冲洗，自然晾干，滴加媒染剂，均匀覆盖3-5min，用水冲洗，自然晾干；

(5)镜检。

所述石碳酸复红染液为：50mg/ml石碳酸复红溶液。

所述媒染剂为：30mg/ml FeCl₃溶液二份，150mg/ml单宁酸二份，200mg/ml硫酸铝钾饱和溶液五份，临用前三天混合，室温放置。

所述细菌标本采用冻干的肺炎链球菌进行制备，制备方法为：取冻干的肺炎链球菌，用无菌生理盐水溶解，反复吹打混匀；将菌液滴加于10％羊血MH培养基上，涂布均匀，然后置于6％CO₂培养箱中，37℃倒置培养16h-18h后，用生理盐水洗下，备用。

上述方法，其染色效果为：背景色为红色，菌体为紫色，荚膜呈无色或淡粉色透明圈。

上述方法在肺炎链球菌菌种鉴定中的应用。

本发明提供一种肺炎链球菌的荚膜染色方法，该方法采用负染法，使背景色为红色，菌体为紫色，荚膜呈无色或淡粉色透明圈。与现有的染色方法相比，本发明的荚膜染色法具有以下优点：(1)保证了细菌荚膜的完整性，并且菌体清晰，容易辨认；(2)所染背景颜色均一，荚膜与背景颜色反差大，荚膜典型，容易辨认，大大提高了肺炎链球菌菌种鉴定的准确性；(3)包括细菌标本的制备、涂片、染色、媒染和镜检等步骤，实验操作简单，对实验员的技能和熟练程度要求不高，本领域普通技术人员均能操作，染色成功率高。

在本发明的一些实施例中，采用本发明的方法对肺炎链球菌进行荚膜染色后，均可观察到清晰的荚膜形态，而对金黄色葡萄球菌进行染色后，未见到荚膜形态，因此，本发明是一种针对肺炎链球菌的荚膜染色方法，能够快速、高效地进行肺炎链球菌的菌种鉴定，在肺炎的临床治疗中有利于医生及时了解致病菌菌种，制定针对该菌种的治疗方案，使患者早日康复。

在本发明的一些实施例中，所述石碳酸复红染液优选50mg/ml石碳酸复红溶液。

在本发明的一些实施例中，所述媒染剂优选30mg/ml FeCl₃溶液二份，150mg/ml单宁酸二份，200mg/ml硫酸铝钾饱和溶液五份，临用前三天混合，室温放置。

本发明肺炎链球菌的荚膜染色方法，细菌标本可采用冻干的肺炎链球菌进行制备，也可以直接使用活化的肺炎链球菌菌液作为细菌标本。

综上所述，本发明提供一种针对肺炎链球菌的荚膜染色方法，所述方法简单易行、耗时短、成功率高、重复性好，能够快速、高效地进行肺炎链球菌的菌种鉴定，在肺炎的临床诊断中有良好的应用前景。

附图说明

图1.4型肺炎链球菌荚膜染色镜检结果(1000×)

图2.11A型肺炎链球菌荚膜染色镜检结果(1000×)

图3.12F型肺炎链球菌荚膜染色镜检结果(1000×)

图4.15B型肺炎链球菌荚膜染色镜检结果(1000×)

图5.17F型肺炎链球菌荚膜染色镜检结果(1000×)

图6.19A型肺炎链球菌荚膜染色镜检结果(1000×)

图7.20型肺炎链球菌荚膜染色镜检结果(1000×)

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行更详细的解释，需要说明的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，而不是以任何方式限制本发明。

实验材料：

菌种：肺炎链球菌菌种均购自中国药品生物制品检定所中国医学细菌保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collections,CMCC)。本单位实验室也有保存，申请人声明自申请日起二十年内，可向公众发放用于必要的验证试验。

表1.肺炎链球菌菌种信息表

实施例1、肺炎链球菌荚膜染色方法的效果鉴定

本发明选用23价肺炎球菌多糖疫苗中的7个血清型的菌种(表1)进行肺炎链球菌荚膜染色方法的效果展示，步骤如下：

1、细菌标本的制备：

取冻干的肺炎链球菌菌种，加200μl无菌生理盐水溶解，反复吹打混匀。取100μl于10％羊血MH培养基上，以玻璃三角涂布器涂布均匀。置于6％CO₂培养箱中，37℃倒置培养16h-18h后，用生理盐水洗下，涂片备用。

2、涂片：取少量制备好的细菌标本均匀涂于洁净载玻片上，刮成薄层，自然晾干(由于荚膜的含水量在90％以上，故不需热固定，以免荚膜皱缩变形)。

3、染色：滴加石碳酸复红染液于载玻片上(约100-150μl)，使之覆盖均匀，自然晾干。

4、媒染：用水冲洗，自然晾干，滴加媒染剂，均匀覆盖3-5min，用蒸馏水冲洗，自然晾干。

5、镜检：先在低倍镜下观察，寻找到染色的菌体，再转用油镜观察荚膜。

6、实验结果：

23价肺炎链球菌多糖疫苗生产用菌种典型染色结果如图1-7所示，各图分别为4、11A、12F、15B、17F、19A、20型肺炎链球菌的荚膜染色结果：在显微镜油镜(1000×)下观察，背景色为红色，菌体为紫色，荚膜呈无色透明圈。

实验结果表明，利用本发明的方法对肺炎链球菌进行荚膜染色后，均可观察到清晰的荚膜形态。因此，本发明是一种针对肺炎链球菌的快速、高效的荚膜染色方法，可用于肺炎链球菌菌种的形态学鉴定。

以上所述为本发明的优选实施例，并非对本发明做任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而并非以任何方式限定本发明。任何本领域熟练技术人员，在本发明的技术方案范围内，凡利用上述公开的技术内容做出少许改动或修饰，应视为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于肺炎链球菌的荚膜染色方法，包括以下步骤：

(1)制备细菌标本；

(2)涂片：取少量所述细菌标本，均匀涂于洁净载玻片上，刮成薄层，自然晾干；

(3)染色：滴加100-150μl的石碳酸复红染液于载玻片上，使之覆盖均匀，自然晾干；

(4)媒染：用水冲洗，自然晾干，滴加媒染剂，均匀覆盖3-5min，用水冲洗，自然晾干；

(5)镜检。

2.根据权利要求1所述的方法，所述石碳酸复红染液为：50mg/ml石碳酸复红溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，所述媒染剂为：30mg/ml FeCl₃溶液二份，150mg/ml单宁酸二份，200mg/ml硫酸铝钾饱和溶液五份，临用前三天混合，室温放置。

4.根据权利要求1所述的方法，所述细菌标本采用冻干的肺炎链球菌进行制备，制备方法为：取冻干的肺炎链球菌，用无菌生理盐水溶解，反复吹打混匀；将菌液滴加于10％羊血MH培养基上，涂布均匀，然后置于6％CO₂培养箱中，37℃倒置培养16h-18h后，用生理盐水洗下，备用。

5.根据权利要求1所述的方法，其染色效果为：背景色为红色，菌体为紫色，荚膜呈无色或淡粉色透明圈。

6.权利要求1-5所述的方法在肺炎链球菌菌种鉴定中的应用。