CN101255458A - 一种细菌的荚膜染色方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细菌荚膜染色方法。包括如下步骤：1)在载玻片上滴一小滴无菌水；2)细菌培养24～48小时，用接种环挑取菌，水湿润状态下，在玻片上自中心向外做螺旋状缓慢载涂布，以保持荚膜完整；3)自然风干或用电风吹冷风吹干；4)滴加纯甲醇2～3滴，固定1～2分钟，倾斜倒掉甲醇；5)滴加石碳酸复红染色1～3分钟，盖上盖玻片；6)用吸水纸吸除盖玻片周围液体，并将载玻片倾斜，用吸水纸吸除盖玻片下的部分染色液。本发明通过对制片方法、染色方法、操作步骤的改进，有效地保持了细菌荚膜的完整性，能清晰地展示样本中所有菌体的荚膜生长状态，显著降低了荚膜染色的操作难度，提高了对细菌荚膜识别的可靠性。

Description

一种细菌的荚膜染色方法

技术领域

本发明涉及一种细菌的荚膜染色方法，采用独特染色方法进行细菌荚膜染色，针对微生物实验和医学检测中细菌荚膜形态观察的样本制作。

背景技术

荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，部分的由细胞质内合成，主要成分是多糖，这些多糖的分子组成和构型多样，令其结构极为复杂，成为血清学分型的基础。例如肺炎双球菌，根据其荚膜多糖的抗原性，至少可将其分成85个血清型。有少许菌种是多肽类，如炭疽芽胞杆菌、鼠疫杆菌等。荚膜的主要作用是：

①抗吞噬作用：荚膜因其亲水性及其空间占位、屏障作用，可有效抵抗宿主吞噬细胞的吞噬作用。

②粘附作用：荚膜多糖可使细菌彼此间粘链，也可粘附于组织细胞或无生命物体表面，是引起感染的重要因素。

③抗有害物质的损伤作用：处于细菌细胞最外层，荚膜犹如盔甲可有效保护菌体免受或少受多种杀菌、抑菌物质的损伤，如溶菌酶、补体等。

④抗干燥作用：荚膜多糖为高度水合分子，含水量在90％以上，可帮助细菌抵抗干燥对生存的威胁。

⑤是重要的能源贮藏库，在缺少能源时，将荚膜分解为碳源和能源而被利用。

荚膜在实验和医学中有重要的作用，主要用于因荚膜抗原不同分血清型，鉴别细菌，制备疫苗。也是大学微生物实验必需完成的一个实验。所以荚膜的染色形态观察非常重要。

由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以通常用衬托染色法(负染色法)染色，即将菌体和背景着色而把不易染色的且透明的荚膜衬托出来。由于荚膜富含水分，很薄，制片时应自然干燥，通常不用加热固定法，避免加热蒸发，影响观察。有时可用甲醇固定目前常用的检测方法有如下四种：

1.负染色法：(诸葛键，王正祥，工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社，1994，72)

(1)滴一滴印度墨水或黑素液与干净的载玻一侧；

(2)接种环取菌液一环，与染色液混合均匀；

(3)取另一块干净的载玻片将混合物自载玻片一侧平挂至另一侧，又平挂回来，使形成一薄层，在空气中干燥；

(4)加蕃红液盖于载玻片上30秒，然后用水洗去；

(5)用吸水纸吸干载玻片底部十分，干燥。

(6)镜检

2.湿墨水法

(1)制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀；

(2)加盖玻片放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液；

(3)镜检：结果：背景灰色，菌体较暗，荚膜呈现明亮的透明圈。

3.干墨水法

(1)制菌液：加1滴6％葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀；

(2)制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜；

(3)干燥：空气中自然干燥；

(4)固定：用甲醇浸没涂片，固定1min，立即倾去甲醇；

(5)干燥：在酒精灯上方，用文火干燥；

(6)染色：用甲基紫染1-2min；

(7)水洗：用自来水轻洗，自然干燥；

(8)镜检。结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈透明圈。

4.Tyler法

(1)涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大；

(2)干燥：在空气中自然干燥；

(3)染色：用Tyler染色液染5～7min；

(4)脱色：用20％CuSO₄水溶液洗去结晶紫，脱色要适度(冲洗2遍)。用吸水纸吸干，并立即加1～2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO₄结晶的形成；

(5)镜检：观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。

采用传统的负染色(衬托染色法)以及其他一些方法存在一些缺点。首先对实验员的操作技能要求很高，容易导致实验失败。黑墨水法背景很黑，要让单个菌体透明展示，需要刮成微米级厚度，制片时的有效区域很小，新手难以胜任。其二是采用黑墨水法等传统负染色法制作的标本往往只能看到少数几个菌体，且需要在显微镜下大范围寻找。另外，细菌荚膜易降解消失，由于实验菌最佳培养时间的偏离和个体菌龄的差异，即使实验菌有荚膜，通常也不会每个菌体同时展示完整荚膜。因此，传统的负染色法难以确定实验菌是否有荚膜，尤其对于未知菌种。

发明内容

本发明的目的是针对传统方法的缺陷，找到一种简单、高效，成像清晰美观的细菌的荚膜染色方法。

细菌荚膜染色方法包括如下步骤：

1)在载玻片上滴一小滴无菌水；

2)细菌培养24～48小时，用接种环挑取菌，水湿润状态下，在玻片上自中心向外做螺旋状缓慢载涂布，以保持荚膜完整；

3)自然风干或用电风吹冷风吹干；

4)滴加纯甲醇2～3滴，固定1～2分钟，倾斜倒掉甲醇；

5)滴加石碳酸复红染色1～3分钟，盖上盖玻片；

6)用吸水纸吸除盖玻片周围液体，并将载玻片倾斜，用吸水纸吸除盖玻片下的部分染色液。

本发明通过对制片方法、染色方法、操作步骤的改进，有效地保持了细菌荚膜的完整性，能清晰地展示样本中所有菌体的荚膜生长状态，显著降低了荚膜染色的操作难度，提高了对细菌荚膜识别的可靠性。从实施例中可以看出，背景染成明亮的淡红色，细菌荚膜轮廓以及菌体均十分清晰。所以本发明是一种简单、高效的细菌荚膜染色方法。

附图说明

图1是本发明在无菌水滴中由内到外缓慢的螺旋状涂开的示意图；

图2(a)是本发明的钾细菌荚膜染色在油镜下的观察图；

图2(b)是本发明的钾细菌荚膜染色在油镜下的观察图；

图2(c)是本发明的钾细菌荚膜染色在油镜下观察图。

具体实施方式

细菌荚膜染色方法包括如下步骤：

1)在载玻片上滴一小滴无菌水(应尽可能少些)；

2)细菌培养24～48小时，已长出白色透明状的胶体，用接种环挑取菌，挑取时可以旋转接种环几圈，以便挑取足量的带荚膜的胶体，水湿润状态下，在玻片上自中心向外做螺旋状缓慢载涂布，以保持荚膜完整，如图1所示；

3)自然风干或用电风吹冷风吹干；

4)滴加纯甲醇2～3滴，固定1～2分钟，倾斜倒掉甲醇；

5)滴加石碳酸复红(浓度为常规浓度的1/2～2/3)染色1～3分钟，盖上盖玻片；

6)小心地用吸水纸吸除盖玻片周围液体，并将载玻片倾斜，用吸水纸吸除盖玻片下的部分染色液，，以增加盖玻片附着力和镜检时样本透光度；

7)油镜镜检。

实施例1

1)在载玻片上滴一小滴无菌水；

2)制片：用接种环取少许培养了24小时的细菌，并在水湿润状态下自中心向外作螺旋状缓慢涂布，以保持荚膜完整；

3)自然风干；

4)滴加纯甲醇一滴，固定1分钟，倾斜倒掉甲醇；

5)滴加数滴石碳酸复红染色1分钟；

6)加盖玻片；

7)小心地用吸水纸将盖玻片周围多余液体吸掉，并将玻片倾斜后吸去部分盖玻片下的染色液，以增加盖玻片附着力和镜检时样本透光度；

8)油镜镜检。

观察结果如附图2(a)所示，背景红色，荚膜无色。

实施例2

1)在载玻片上滴一小滴无菌水；

2)制片：用接种环取少许培养了48小时的菌，并在水湿润状态下自中心向外作螺旋状缓慢涂布，以保持荚膜完整；

3)自然风干；

4)用纯甲醇固定2分钟，倾斜倒掉甲醇；

5)滴加数滴石碳酸复红染色3分钟；

6)加盖玻片；

7)小心地用吸水纸将盖玻片周围多余液体吸掉，并将玻片倾斜后吸去部分盖玻片下的染色液，以增加盖玻片附着力和镜检时样本透光度；

8)油镜镜检。观察结果如附图2(b)所示，背景红色，荚膜无色。

实施例3

1)在载玻片上滴一小滴无菌水；

2)制片：用接种环取少许培养了36小时的菌，并在水湿润状态下自中心向外作螺旋状缓慢涂布，以保持荚膜完整；

3)自然风干；

4)滴加纯甲醇2滴，固定1分钟，倾斜倒掉甲醇；

5)滴加数滴石碳酸复红染色2分钟

6)加盖玻片；

7)小心地用吸水纸将盖玻片周围多余液体吸掉，并将玻片倾斜后吸去部分盖玻片下的染色液，以增加盖玻片附着力和镜检时样本透光度；

8)油镜镜检。观察结果如附图2(c)所示，背景红色，荚膜无色。

Claims (1)

1.一种细菌荚膜染色方法，其特征在于包括如下步骤：

1)在载玻片上滴一小滴无菌水；

2)细菌培养24～48小时，用接种环挑取菌，水湿润状态下，在玻片上自中心向外做螺旋状缓慢载涂布，以保持荚膜完整；

3)自然风干或用电风吹冷风吹干；

4)滴加纯甲醇2～3滴，固定1～2分钟，倾斜倒掉甲醇；

5)滴加石碳酸复红染色1～3分钟，盖上盖玻片；

6)用吸水纸吸除盖玻片周围液体，并将载玻片倾斜，用吸水纸吸除盖玻片下的部分染色液。

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