CN101643769A - 一种飞机燃油微生物检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种飞机燃油微生物检测方法，在不同培养基中加燃油样本培养和染色，形成易观察的菌落，用目视和显微镜对比观察来检测和监控飞机燃油系统、加油车、油库、油罐中的微生物污染程度；本发明还公开了飞机燃油微生物检测方法中用的培养基配方以及制备这些培养基的方法，本发明的一种飞机燃油微生物检测方法满足国际航空运输协会IATA实行的《GuidanceMaterial On Microbiological Contamination in Aircraft Fuel Tanks》(飞机油箱微生物污染指南材料)第二版要求，克服了国外进口培养基产品价格高易过期失效的缺点，所用的培养基价格低廉，可在长温下储运，可取代国外进口产品。

Description

一种飞机燃油微生物检测方法

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体说是涉及一种飞机燃油微生物检测方法。

本发明还提供实现该方法用的飞机燃油微生物培养基及培养基的制备方法。

背景技术

随着航空技术的发展，飞机发动机的性能越来越先进，因此对飞机燃油系统及所用油料的要求越来越高。飞机燃油系统、加油车、油库、油罐中的任何污染物的存在，都会给飞行带来灾难性后果。但是由于航空煤油中水分的存在，油料中不可避免地存在大量的微生物。有的微生物数量较少，繁殖较慢，对飞机影响不大。但有的微生物如：脱硫弧菌等繁殖很快，包成团时，体积增长非常快，很容易造成燃油滤堵塞，造成飞机发动机空中停车等灾难性事故。有的微生物腐蚀性特别强，可以将油箱壁板、油罐壁腐蚀破坏，造成油箱、油罐漏油等严重故障。航空燃油中的微生物主要有霉菌、放线菌、细菌三类，这些微生物污染在不同的生存环境中，存在的量不尽相同，危害性也不尽相同；用不同原理的检测方法得出的结果也不尽相同，因此国际航空运输协会IATA在2005年出版的《Guidance Material On Microbiological Contamination in AircraftFuel Tanks》(飞机油箱微生物污染指南材料)第二版，规定了燃油微生物污染等级。

目前国际航空运输协会IATA推荐以下四种微生物检测方法：HY-LiTE JetAlFuel Test、MicrobMonitor2、Easicult Kits和FUELSTAT，参考的测试方法通常是IP385/99或者D6974-04，这种方法是许多微生物测试技术的基础。但这种方法对实验室环境、设备、人员经验都有很高的要求。国际航空运输协会IATA推荐的四种微生物检测方法存在以下问题：

1)Easicult Kits由于仅能检测水相样品，不能进行油相样品检测。因此这个方法不适合于飞机航空燃油微生物的检测，国内已很少采用。

2)FUELSTAT仅限于检测霉菌丝体的一种H.resinae(H.resinae的危害主要在于腐蚀飞机油箱金属结构)。由于飞机燃油中其它微生物污染(其可能产生的危害会造成燃油过滤器发生堵塞、油量指示出现故障)该方法无法检测到，因此该方法检测的单一性，无法满足飞机燃油微生物的检测要求。

3)MicrobMonitor2简称MM2，MM2试剂为瓶装可触变性营养凝胶，该营养凝胶能促进细菌、酵母菌、霉菌的生长，可用于检测石油产品中重点的危害性微生物，包括：HR、曲霉菌、假单胞(帚形、极毛杆菌)菌属等。支持水相、油相及油水混合样品的检测。但MM2为国外进口产品，消耗量大，价格昂贵，要求在黑暗、温度低于22℃的条件下保存时，有效期为一年。由于在国内外运输、储存时间长、条件差，严重影响检测精度；

4)HY-LITE Jet Al Fuel Test测试法将燃油样品与酶试剂在专用的测试笔中混合，当三磷酸腺苷与酶反应时，检测仪就可测生物体发光反应强度，其反应强度越高，仪器读数越大。通过精确检测反应过程中释放出的光量，就可以精确检测ATP存在的量。因为RLU与试验中的ATP的量成比例，所以也与航空燃油中的微生物数量成比例。HY-LITE测试法支持水相、油相及油水混合样品的检测，并且支持绝大部分微生物污染检测。但HY-LITE测试法由于是通过检测ATP的量来检测飞机燃油微生物的含量，检测方法不直观，受其它因素影响较大；测试笔等日常消耗品为德国进口，消耗量大，价格昂贵；而且测试笔在运输和储存的温度要求为2～8℃；在室温下的储藏有效期(包括运输期和储藏期)不得超过3周；由于国内外运输、储存时间长、条件差，严重影响检测精度。

目前国内对飞机燃油主要是航空煤油的油相和水相中微生物污染等级的检测还没有专业方法。

发明内容：

本发明要解决的技术问题在于提供一种符合国际航空运输协会IATA检测原理的飞机燃油微生物检测方法，来对飞机燃油系统、加油车、油库、油罐中的微生物污染进行检测和监控。

为解决上述技术问题，本发明的一种飞机燃油微生物检测方法，其步骤如下：

1)样品准备与预处理：对不同飞机油箱取得的燃油样品的澄清度、不溶物、水珠等外观进行观察，若肉眼观察存在明显不溶物或有水滴的样品，一定有严重的微生物污染，选取直接检测发现污染较严重的，有水珠的样品作为微生物群落结构研究试样，取回的样品需进行低温保存，一般在4℃左右冰箱里冷藏即可；

2)取样：将取样玻璃瓶，塞上乳胶塞，在160～170℃下，干热灭菌1～2h后，自然冷却后。将样品取到取样瓶中；

3)加样培养：将取样瓶中的待检测的燃油样品按检测目的的不同，加入所需微生物培养基中，在30℃培养48h，观察菌落是否形成；

4)染色：菌落形成后，挑取少许待检菌于载玻片上的无菌水中，混合均匀后涂布，进行简单染色或革兰氏染色；

5)外观检测：培养过后，通过菌落的形状，数量等粗略判定菌的种类、数量；

6)显微镜检测：观察菌体的形态、结构、孢子的生长状况等，进一步判定菌的种类、数量；

7)根据标准判定飞机燃油的污染等级。

为实现本发明的一种飞机燃油微生物检测方法，本发明还提供了实现该方法用的飞机燃油微生物培养基及制备工艺。

1)微生物通用培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：葡萄糖：4.5～7.0g，硫酸氨：2.0～3.5g，柠檬酸钠：1.0～2.5g，七水硫酸镁：0.2～0.4g，磷酸氢二钾：3.0～4.5g，磷酸二氢钾：6.0～9.5g，琼脂粉：15～20g，吐温20：1.0～4.5mL，pH值是7.0～7.2。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：葡萄糖：5.0g，硫酸氨：2.0g，柠檬酸钠：1.0g，七水硫酸镁：0.2g，磷酸氢二钾：4.0g，磷酸二氢钾：6.0g，琼脂粉：15g，吐温20：1.0mL，pH值是7.0。

2)霉菌培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：硝酸钠：1.0～3.0g，磷酸氢二钾：1.0～3.5g，氯化钾：0.5～1.5g，七水硫酸镁：0.2～1.5g，蔗糖：30～35g，硫酸亚铁：微量，吐温20：1.0～4.5mL，琼脂粉：15～20g，pH值：自然。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：硝酸钠：2.0g，磷酸氢二钾：1.0g，氯化钾：0.5g，七水硫酸镁：0.5g，蔗糖：30g，FeSO₄：微量，吐温20：1.0mL，琼脂粉：15g。pH值：自然。

3)放线菌培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：可溶性淀粉：16～24g，硝酸钾：1.0～1.4g，七水硫酸镁：0.4～0.6g，氯化钠：0.5～0.7g，磷酸氢二钾：0.3～0.5g，硫酸铁：微量，吐温20：1.0～4.5mL。pH值：自然。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：可溶性淀粉：20g，硝酸钾：1.0g，七水硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸铁：微量，吐温20：1.0mL，pH：7.4。

4)细菌常规培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：牛肉膏：3.0～5.0g，蛋白胨：8.0～12g，氯化钠：4.0～6.0g，琼脂粉：15～20g，吐温20：1.0～4.5mL。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：牛肉膏：5.0g，蛋白胨：10g，氯化钠：5.0g，琼脂粉：15g，吐温20：1.0mL。pH值：自然。

5)细菌染色培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：牛肉膏：3.0～5.0g，蛋白胨：8.0～12g，氯化钠：4.0～6.0g，琼脂粉：15～20g，吐温20：1.0～4.5mL，pH.7.2～7.4。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：牛肉膏：5.0g，蛋白胨：10g，氯化钠：5.0g，琼脂粉：15g，吐温20：1.0mL，pH：7.4。

6)细菌染色培养基细菌触变培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：黄原胶：7.5～11g，琼脂：2.0～6.5g，卡拉胶：2.5～4.0g，葡萄糖：2.0～4.5g，蛋白胨：1.2～2.8g，胰蛋白胨：3.0～4.75g，氯化钠：0.5～1.25g，0.1％TTC：15～20mL，pH ：7.2～7.4。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：黄原胶：11g，琼脂：4.0g，卡拉胶：3.5g，葡萄糖：4.0g，蛋白胨：2.25g，胰蛋白胨：4.75g，氯化钠：1.25g，0.1％TTC：15～20mL。pH值：自然。

7)酵母菌培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：蛋白胨：24～36g，酵母膏：5.0～7.5g，酪蛋白水解物：5.0～7.5g，葡萄糖：20～40g，硫酸锌：0.3～1.4g，琼脂粉：15～20g，吐温20：1.0～4.5mL。pH值：自然。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：蛋白胨：30g，酵母膏：5.0g，酪蛋白水解物：5.0g，葡萄糖：40g，硫酸锌：1.4g，琼脂粉：15g，吐温20：1.0mL。pH值：自然。

制备上述一种飞机燃油微生物检测方法用各类培养基的通用方法，具体步骤如下：

1)称量：用称量纸、烧杯、载玻片、移液管称取称取后倒入烧杯中；

2)溶解：在烧杯中先加入所需要水量的一半左右的水，完全溶解后补充水分到所需要的总体积；

3)调pH：用试纸、酸度计测量原始pH，再用烧碱、盐酸调节pH；

4)过滤：滤去溶液中的不溶物；

5)分装：用试管、三角瓶等分装，在瓶口塞上硅胶塞或棉塞；

6)包扎：加塞后，三角瓶瓶口外包一层牛皮纸，试管8支左右用麻绳包好再在管口外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水打湿塞子；

7)灭菌：采用高压蒸汽灭菌；

8)pH调整：重新调整pH；

9)加染色剂：趁热将培养基与染色剂混合，摇动去气泡；

10)无菌检查：将灭菌的培养基放置在37℃的温室中培养24～48h，观察有无菌落形成，以检查灭菌是否彻底。

本发明相比于现有技术具有如下积极效果。本发明的一种飞机燃油微生物检测方法由于采用可靠的培养基进行排除检测，因此培养菌落快速，分辨菌类容易，通过菌落的形状，数量，能可靠判定菌的种类和样品的污染程度，该方法符合国际航空运输协会IATA规定的检测原理。该方法克服了国外进口培养基产品价格高易过期失效的缺点，所用的培养基价格低廉，可在长温下储运，可取代国外进口产品。

附图说明

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施范围之中。

飞机燃油主要是航空煤油，其微生物检测方法的步骤如下：

1.样品准备与预处理：对不同飞机油箱取得的燃油样品的澄清度、不溶物、水珠等外观进行观察，若肉眼观察存在明显不溶物或有水滴的样品，一定有严重的微生物污染，选取直接检测发现污染较严重的，有水珠的样品作为微生物群落结构研究试样，取回的样品需进行低温保存，一般在4℃左右冰箱里冷藏即可；

2.取样：

1)飞机油箱取样时，打开放沉淀阀或排污(水)管直接取样，注意不要放掉沉淀水；

2)从储油罐顶部取样时，可参照GB/T 4756。取样时，应用70％的酒精对取样装置进行消毒；每一次取样前，应用燃油从顶部清洗油库专用取样瓶或取样装置；

3)打开取样容器盖子后，立即取样，取完样后，马上盖紧盖子；

4)取样量：通常为1L；

5)取样时，样品不要超过取样瓶容积的三分之二，保证燃油微生物生存必需的氧气；

6)取样时应记录取样时燃油的视觉效果；

7)从油箱底部或附件表面或过滤器滤芯上取样时，用消毒后的棉签擦拭产生污染的表面后，对棉签进行测试；

8)过滤器等可用洁净塑料袋密封后，立即送实验室取样，避免送样途中水分蒸发；

3.加样培养：将待检测油样加入配置好的培养基中，在30℃培养48h，观察。若有菌落形成，可挑取单菌落进行下一步的菌种形态观察，若菌落数较多，则需先分离纯化，细菌用划线法，霉菌、放线菌用梯度稀释法；

1)混杂菌的培养温度一般在30～32℃，培养时间一般两天左右就能开始有菌落的形成，其中有霉菌、细菌等各种类型的菌，不同类型的菌的生长速率不同，形成的菌落大小也不同。一般培养7天，可观察到各种菌落；

2)霉菌的培养温度一般为28℃，培养时间一般两天左右就能开始有菌落的形成，大约六天就能形成可以观察的直径1.5cm的菌落，生长快慢不同的菌种表现有所差别；

3)放线菌的培养温度一般为29℃，放线菌生长较快，经过了适应期两天菌落直径就能达到5mm左右；

4)细菌的培养温度较高为37℃，细菌相对霉菌和放线菌的生长速度都快，宏观上来看菌落的直径一般较小，3天菌落达1～2mm；

5)酵母菌的培养温度为28℃，生长较快，一般培养48h后，可观察到菌落；

4.染色：菌落形成后，挑取少许待检菌于载玻片上的无菌水中，混合均匀后涂布，进行简单染色或革兰氏染色；

1)简单染色步骤

a)涂片：取一洁净载玻片，中间滴一滴水滴，用接种环按无菌操作从菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，涂成直径1cm左右的薄膜；

b)干燥：室温自然干燥；

c)固定：涂面朝上，通过火焰三次，温度不宜太高，以玻片背面不烫手为宜；

d)染色：滴加染液于涂片上，吕氏碱性美蓝染色1～2min，石碳酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min；

e)水洗：倒去染液，用自来水冲洗，直到流下的水无色为止，最后用自来水漂洗一次；

f)干燥：自然干燥，或者用电吹风吹干；

g)镜检：图片必须完全干燥后才能用油镜观察。

2)革兰氏染色步骤

a)制片：同简单染色的前三步；

b)初染：滴加结晶紫染色1min后水洗；

c)媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min后水洗；

d)脱色：在白色背景下，用滴管流加95％的乙醇脱色，直到流出的乙醇无紫色时，立即水洗。注意应控制脱色时间一般在20～30秒；

e)复染：用番红液复染约2min后水洗；

f)镜检：用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的为阳性菌，被染成红色的为阴性菌。

5.目视检测：培养过后，通过菌落的形状，数量等粗略判定菌的种类；并通过菌落计数或按照表1菌落总数对照表，来估算样品中的微生物菌落总数；

1)霉菌菌落形态较大，质地疏松，颜色各异，有丝状、绒毛状或蜘蛛网状的菌丝体，是由交织在一起的菌丝体构成。仔细观察记录培养时间、菌落大小、形态、颜色、表面状态等；

2)放线菌菌落在培养基上着生牢固，与基质结合紧密，难以用接种针挑取。放线菌细胞一般呈分枝无隔的丝状，菌丝体分为在培养基内部的基内菌丝和伸出培养基表面的气生菌丝。气生菌丝上部分化成孢子丝，呈螺旋状、波浪状或分枝状。菌丝呈各种颜色，有的能分泌水溶性色素到培养基内。孢子丝长出孢子，孢子形状各异。由于孢子的存在使菌落表面呈干粉状。观察放线菌菌落表面形状、大小、颜色、边缘以及有无色素分泌；并用接种环挑取菌落，注意在培养基上的着生的紧密情况。区别基内菌丝、气生菌丝及孢子丝的着生部位；

3)细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。其基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年还发现星状和四方形细菌等。细菌形态受培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。加入染色剂后，菌落的颜色呈现鲜红色，但是通过颜色不能区分不同类型的细菌；

4)酵母菌与很多细菌相似，但比细菌菌落较大，较厚，较不透明，形状一般呈圆形或近圆形，边缘圆整，颜色均一，多数呈乳白色或浅黄色，少数酵母菌呈红色；菌落表面一般较湿润，光滑，菌落隆起呈半圆形或圆台形，较粘稠呈固态油脂状，容易挑起。多数假丝酵母菌落较平坦，表面皱缩粗糙，边缘不整齐或呈缺刻状；有些酵母在液体培养基表面生长形成干而皱的菌膜。

6.显微镜检测：观察菌体的形态、结构、孢子的生长状况等，进一步判定菌的种类；通过计数来计算样品中的微生物菌落总数；

表1

1)霉菌采用新的透明胶带法，该法是在无菌条件下，用左手将培养皿盖揭起一部分，右手大拇指和中指分别持透明胶带一端，将胶带覆盖于菌落上方，并用右手食指轻轻压下，待胶带上粘上菌丝或孢子后，取出。将胶带轻轻贴于载玻片上，滴苯酚棉蓝溶液浸渍数分钟后，于显微镜下观察其形态。菌丝呈管状，有的有横隔将菌丝分割为多细胞如青霉、曲霉，有的菌丝没有横隔如毛霉、根霉。菌丝直径比一般细菌和放线菌菌丝大几倍到几十倍；

2)放线菌制样用插片法或者盖片法观察。其余同霉菌；

3)细菌挑取少许待检菌于载玻片上的无菌水中，混合均匀后涂布，使其均匀的附着于载玻片上，将其稍微烘干以固定细菌，经简单染色或革兰氏染色后放于显微镜载玻台上，镜检，主要观察菌的大小、形状、颜色的；

4)酵母菌操作同细菌。染色方法可以用负染色法。此法采用使菌体不易染色的酸性燃料如刚果红或墨汁等，使菌体不易着色而背景着色。由于死细菌可被染色，此法还能区分菌的死活细胞。

7.飞机燃油微生物污染分级

飞机燃油微生物的污染程度根据检测的水相样口和油相样品的不同，按下表2分为：轻度污染、一般污染和重度污染。

表2

为实现本发明的一种飞机燃油微生物检测方法，本发明还提供了实现该方法用的飞机燃油微生物培养基，包括通用培养基和针对霉菌培、放线菌、细菌、酵母菌的专用培养基。

1)微生物通用培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：葡萄糖：4.5～7.0g，硫酸氨：2.0～3.5g，柠檬酸钠：1.0～2.5g，七水硫酸镁：0.2～0.4g，磷酸氢二钾：3.0～4.5g，磷酸二氢钾：6.0～9.5g，琼脂粉：15～20g，吐温20：1.0～4.5mL，pH值是7.0～7.2。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：葡萄糖：5.0g，硫酸氨：2.0g，柠檬酸钠：1.0g，七水硫酸镁：0.2g，磷酸氢二钾：4.0g，磷酸二氢钾：6.0g，琼脂粉：15g，吐温20：1.0mL，pH值是7.0。

2)霉菌培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：硝酸钠：1.0～3.0g，磷酸氢二钾：1.0～3.5g，氯化钾：0.5～1.5g，七水硫酸镁：0.2～1.5g，蔗糖：30～35g，硫酸亚铁：微量，吐温20：1.0～4.5mL，琼脂粉：15～20g。pH值：自然。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：硝酸钠：2.0g，磷酸氢二钾：1.0g，氯化钾：0.5g，七水硫酸镁：0.5g，蔗糖：30g，硫酸亚铁：微量，吐温20：1.0mL，琼脂粉：15g。pH值：自然。

3)放线菌培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：可溶性淀粉：16～24g，硝酸钾：1.0～1.4g，七水硫酸镁：0.4～0.6g，氯化钠：0.5～0.7g，磷酸氢二钾：0.3～0.5g，硫酸铁：微量，吐温20：1.0～4.5mL。pH值：自然。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：可溶性淀粉：20g，硝酸钾：1.0g，七水硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸铁：微量，吐温20：1.0mL，pH：7.4。

4)细菌常规培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：牛肉膏：3.0～5.0g，蛋白胨：8.0～12g，氯化钠：4.0～6.0g，琼脂粉：15～20g，吐温20：1.0～4.5mL。pH值：自然。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：牛肉膏：5.0g，蛋白胨：10g，氯化钠：5.0g，琼脂粉：15g，吐温20：1.0mL。pH值：自然。

5)细菌染色培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：牛肉膏：3.0～5.0g，蛋白胨：8.0～12g，氯化钠：4.0～6.0g，琼脂粉：15～20g，吐温20：1.0～4.5mL。pH值：自然。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：牛肉膏：5.0g，蛋白胨：10g，氯化钠：5.0g，琼脂粉：15g，吐温20：1.0mL。pH值：自然。

6)细菌触变培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：黄原胶：7.5～11g，琼脂：2.0～6.5g，卡拉胶：2.5～4.0g，葡萄糖：2.0～4.5g，蛋白胨：1.2～2.8g，胰蛋白胨：3.0～4.75g，氯化钠：0.5～1.25g，0.1％TTC：15～20mL，pH：7.2～7.4。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：黄原胶：11g，琼脂：4.0g，卡拉胶：3.5g，葡萄糖：4.0g，蛋白胨：2.25g，胰蛋白胨：4.75g，氯化钠：1.25g，0.1％TTC：15～20mL。pH值：自然。

7)酵母菌培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：蛋白胨：24～36g，酵母膏：5.0～7.5g，酪蛋白水解物：5.0～7.5g，葡萄糖：20～40g，硫酸锌：0.3～1.4g，琼脂粉：15～20g，吐温20：1.0～4.5mL。pH值：自然。

在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：蛋白胨：30g，酵母膏：5.0g，酪蛋白水解物：5.0g，葡萄糖：40g，硫酸锌：1.4g，琼脂粉：15g，吐温20：1.0mL。pH值：自然。

制备上述七种飞机燃油微生物检测方法用微生物培养基的方法，具体步骤如下：

1)称量：用称量纸、烧杯、载玻片、移液管称取培养基配方中的各类样品，称取后倒入烧杯中；

2)溶解：在烧杯中先加入所需要水量的一半左右的水，完全溶解后补充水分到所需要的总体积；

3)调pH值：用试纸、酸度计测量原始pH，再用0.1mol/L的氢氧化钠或0.1mol/L的氯化氢进行。

4)过滤：滤去溶液中的不溶物；

5)分装：用试管、三角瓶等分装，在瓶口塞上硅胶塞或棉塞；

6)包扎：加塞后，三角瓶瓶口外包一层牛皮纸，试管8支左右用麻绳包好再在管口外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水打湿塞子；

7)灭菌：采用高压蒸汽灭菌；

8)pH调整：重新调整pH；

9)加染色剂：趁热将培养基与染色剂混合，摇动去气泡；

10)无菌检查：将灭菌的培养基放置在37℃的温室中培养24～48h，观察有无菌落形成，以检查灭菌是否彻底。

Claims (9)

1.一种飞机燃油微生物检测方法，包括下列步骤：

1)样品准备与预处理：选取肉眼观察发现有水珠或不溶物的燃油样品，在4℃左右冷藏；

2)取样：将取样瓶在160～170℃下，干热灭菌1～2h后，自然冷却后将样品取到取样瓶中；

3)加样培养：将取样瓶中的待检测的燃油样品按检测目的的不同，加入所需微生物培养基中，在30℃培养48h，观察菌落是否形成；

4)染色：菌落形成后，挑取少许待检菌于载玻片上的无菌水中，混合均匀后涂布，进行简单染色或革兰氏染色；

5)外观检测：培养过后，通过菌落的形状、数量等粗略判定菌的种类、数量；

6)显微镜检测：观察菌体的形态、结构、孢子的生长状况等，进一步判定菌的种类、数量；

7)根据标准判定飞机燃油的污染等级。

2.实现权利要求1的一种飞机燃油微生物检测方法的微生物通用培养基，其特征在于：其中各组份在1000mL水中其含量分别为：葡萄糖：4.5～7.0g，硫酸氨：2.0～3.5g，柠檬酸钠：1.0～2.5g，七水硫酸镁：0.2～0.4g，磷酸氢二钾：3.0～4.5g，磷酸二氢钾：6.0～9.5g，琼脂粉：15～20g，吐温20：1.0～4.5mL，pH值是7.0～7.2。

3.如权利要求2所述的微生物通用培养基，其特征在于：在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：葡萄糖：5.0g，硫酸氨：2.0g，柠檬酸钠：1.0g，七水硫酸镁：0.2g，磷酸氢二钾：4.0g，磷酸二氢钾：6.0g，琼脂粉：15g，吐温20：1.0mL，pH值是7.0。

4.实现权利要求1的一种飞机燃油微生物检测方法的霉菌培养基，其特征在于：其中各组份在1000mL水中其含量分别为：硝酸钠：1.0～3.0g，磷酸氢二钾：1.0～3.5g，氯化钾：0.5～1.5g，七水硫酸镁：0.2～1.5g，蔗糖：30～35g，硫酸亚铁：微量，吐温20：1.0～4.5mL，琼脂粉：15～20g。pH值：自然。5.如权利要求4所述的霉菌培养基，其特征在于：在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：硝酸钠：2.0g，磷酸氢二钾：1.0g，氯化钾：0.5g，七水硫酸镁：0.5g，蔗糖：30g，硫酸亚铁：微量，吐温20：1.0mL，琼脂粉：15g。pH值：自然。

6.实现权利要求1的一种飞机燃油微生物检测方法的放线菌培养基，其特征在于：其中各组份在1000mL水中其含量分别为：可溶性淀粉：16～24g，硝酸钾：1.0～1.4g，七水硫酸镁：0.4～0.6g，氯化纳：0.5～0.7g，磷酸氢二钾：0.3～0.5g，硫酸铁：微量，吐温20：1.0～4.5mL。pH值：自然。

7.如权利要求6所述的放线菌培养基，其特征在于：在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：可溶性淀粉：20g，硝酸钾：1.0g，七水硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸铁：微量，吐温20：1.0mL，pH：7.4。

8.实现权利要求1的一种飞机燃油微生物检测方法的细菌常规培养基，其中各组份在1000mL水中其含量分别为：牛肉膏：3.0～5.0g，蛋白胨：8.0～12g，氯化钠：4.0～6.0g，琼脂粉：15～20g，吐温20：1.0～4.5mL。pH值：自然。

9.如权利要求8所述的细菌常规培养基，其特征在于：在1000mL水中，各组份优选的含量分别为：牛肉膏：5.0g，蛋白胨：10g，氯化钠：5.0g，琼脂粉：15g，吐温20：1.0mL。pH值：自然。

10.制备权利要求2至9所述的一种飞机燃油微生物检测方法用各类培养基的通用方法，具体步骤如下：

1)称量：用称量纸、烧杯、载玻片、移液管称取各组份后倒入烧杯中；

2)溶解：在烧杯中先加入所需要水量的一半左右的水，完全溶解后补充水分到所需要的总体积；

3)调pH：用试纸、酸度计测量原始pH，再用0.1mol/L的氢氧化钠或0.1mol/L的氯化氢进行；

4)过滤：滤去溶液中的不溶物；

5)分装：用试管、三角瓶等分装，在瓶口塞上硅胶塞或棉塞；

6)包扎：加塞后，三角瓶瓶口外包一层牛皮纸，试管8支左右用麻绳包好再在管口外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水打湿塞子；

7)灭菌：采用高压蒸汽灭菌；

8)pH调整：重新调整pH；

9)加染色剂：趁热将培养基与染色剂混合，摇动去气泡；

10)无菌检查：将灭菌的培养基放置在37℃的温室中培养24～48h，观察有无菌落形成。