CN109439579A - 一种石油微生物检测工具箱用培养基组 - Google Patents

一种石油微生物检测工具箱用培养基组 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种石油微生物检测工具箱用培养基组，包括：细菌的培养基、真菌的培养基和硫酸盐还原菌(简称SRB菌)生长的培养基三种培养基，设定所述细菌的培养基为B培养基，真菌的培养基为E培养基，SRB菌生长的培养基为S培养基，所述B培养基的pH值为6.5～7.5，所述E培养基的pH值为pH 4～5.5，所述S培养基的pH值为6.0～8.0，所述B培养基和E培养基中均含有显色剂红四氮唑或蓝四氮唑，所述S培养基中含有显色剂Fe2+，将石油样品分别放置入所述B培养基、E培养基和S培养基中，获得石油微生物生长和分类信息。应用上述培养基组，能更灵敏地用肉眼观察和判定固体培养基上的微生物菌落的分类、多少以及活性程度，更精细地判定石油微生物污染等级。

Description

一种石油微生物检测工具箱用培养基组
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种石油微生物检测工具箱用培养基组。
背景技术
石油或航空燃油储存过程会引发大型储罐的腐蚀。据报道，这类腐蚀，主要由微生物滋生所导致。此类油料中微生物引发的腐蚀现象(Microbiology InfluencedCorrosion,MIC)，终极原因是油料中含有水。所滋生的微生物，主要存在油水界面和水滴内，可以利用油料作为能源物质，进行繁衍和新陈代谢，其分泌的代谢物和特种酶类能够引起金属材料的腐蚀。
油料中存在的腐蚀性微生物，主要有细菌、真菌和放线菌三类。在不同的生存环境中，这些微生物存在的量不尽相同，污染危害性也不尽相同。特别是在沿海环境中，高湿、高温和高盐，污染的微生物对大型储油设备、飞机油箱和过滤净化等设备的损害日渐增多，给燃油的储存安全和飞行安全带来巨大隐患。有的微生物腐蚀性特别强，例如硫酸盐还原菌(SRB)、硫氧化菌和铁细菌，其代谢活动，会释放出有机酸和其它腐蚀性产物，在储存罐和飞机油箱中生长繁殖会导致油罐腐蚀、可以将油罐壁、油箱壁腐蚀破坏，造成油罐、油箱漏油等严重故障；有的微生物如树脂芽枝霉等繁殖很快，很容易集结成可见的絮状物，包成团时，体积增长非常快，很容易造成飞机的燃料过滤器堵塞、燃油喷嘴结焦，或者油量指示设备故障，指示器读数不准确，甚至会威胁飞机飞行安全，造成飞机发动机空中停车。
石油中微生物污染程度检测，目前国内还没有相关的检测标准。国际上被公认并广泛使用的传统标准方法是过滤培养法。将一定量的燃油样品在无菌条件下用膜过滤，所有的微生物将被膜截留，然后把滤膜放在培养基上进行培养，或用无菌水洗下滤膜上的微生物，进行一定的稀释后进行培养，根据培养皿上的菌落数、稀释倍数和样品量可以得出样品的微生物含量。培养法的优点是准确性高，缺点是比较复杂且费时，需要严格的无菌操作环境，以及有经验的化验人员。这对于一般的燃油供应部门是无法办到的。
关于微生物污染检测的发明专利，已经申请或公开相关发明专利有如下这些，绝大部分都是检测水体或食品中微生物污染的。
如：发明专利CN200410026795.X，涉及一种快速、定量检测江河湖水、工业用水、生活饮用水及海水等水体中细菌总数、微藻细胞数量的检测方法及试剂，其原理是将水样依次经过不同孔径(由大到小)的微孔滤膜过滤，取下滤膜进行ATP发光检测，根据公式计算水体中细菌和微藻细胞等微生物的含量。
实用新型CN200620134860.5涉及一种细菌总数测试瓶，该测试瓶为带胶塞和铝皮盖的无菌、无色透明玻璃瓶，测试瓶中装有细菌总数测试液，测试液在瓶中的高度H1和留空高度H2之比为H1∶H2＝1∶0.3～0.8。将预先配置好的培养基测定液体封装于透明玻璃瓶中，可直接用于细菌的测定，培养基中的显色指示剂为酚红或中性红。
发明专利CN200910080151.1涉及一种饮用水中细菌总数测试瓶的生产方法，在常温下，分别取氯化钠0.5％、牛肉膏0.5％、蛋白胨1.0％、蒸馏水98.0％，然后依次用蒸馏水将其溶解，并加入到容器中混合、充分摇匀，用酸液(10％HCl)或碱液(10％NaOH)将溶液的pH值调节到7.2～7.4，即配制成所需培养液；将所配制的培养液按每瓶9.0ml培养液装入瓶中，然后加盖、封口、高温灭菌、冷却后即制成一种饮用水中细菌总数测试瓶。该发明专利不加微生物显色剂。
发明专利CN200910164264.X公开了一种飞机燃油微生物检测方法，还公开了飞机燃油微生物检测方法中用的培养基配方以及制备这些培养基的方法。该发明专利是将取样瓶中的待检测的燃油样品按检测目的的不同，加入所需的不同的微生物培养基中，在30℃培养48h，待菌落形成后，挑取少许待检菌于载玻片上的无菌水中，混合均匀后涂布，进行简单染色或革兰氏染色，然后通过菌落的形状、数量等外观检测，还有菌体的形态、结构、孢子的生长状况等显微镜检测来判定飞机燃油的微生物污染程度。可见，其微生物显色操作是挑取少许待检菌于载玻片上的无菌水中，混合均匀后涂布，进行简单染色或革兰氏染色，而不是在培养基上进行微生物活性显色。
发明专利CN201410647033.5涉及一种快速简便评价水源水和饮用水微生物污染风险的方法，通过检测水中溶解氧消耗速率实现对水源水和饮用水中微生物污染风险的评价。
发明专利CN201511015810.5公开了一种细菌总数测试管，包括玻璃管、放置在所述玻璃管内的吸水纸、密封设置在所述玻璃管两端的密封圈，所述吸水纸内吸附有营养液、指示剂和冷水凝胶。其营养液、指示剂和冷水凝胶混合液配制方法为：每100mL无菌纯水中加入蛋白胨2.590g、酵母膏1.050g、葡萄糖0.239g、磷酸氢二钾0.250g、氯化钠0.450g、2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC)指示剂0.004g，加入卡拉胶与聚丙烯酸钠分别为1.000g、0.300g。
发明专利CN201611168793.3涉及一种菌落总数测试片及其制作方法，该装置包括了由无纺布和滤膜组合而成的载体结构，还包含了两层垫圈和上下层基材，装置可容纳500μL的液体。通过本发明所述方法制作的测试片，在接种液体样品后在37℃条件下培养48h可对红色菌落进行计数。该发明所用的菌落总数显色培养基配制方法是：将1.25g葡萄糖、0.025g吐温80、6.25g胰蛋白胨、1.25g酵母粉、终浓度0.004％的TTC显色剂溶解于1L水中，并加入终浓度1.6％的瓜尔豆胶做胶凝剂，搅拌均匀即为冷水可溶胶凝剂培养基，将无纺布浸入此培养基3min，使无纺布浸满培养基后进行环氧乙烷、γ射线或电子束辐照灭菌。
关于油料微生物污染的检测，用不同原理的检测方法得出的结果也不尽相同。国际航空运输协会(IATA)在2005年出版的《Guidance Material On MicrobiologicalContamination In Aircraft Fuel Tanks》(飞机油箱微生物污染指南材料)第二版，规定了燃油微生物污染等级。目前，IATA推荐有几种较新的检测方法，如Microb Monitor2(MM2)、HY-LiTE Jet Al、FuelStat TM Resinae等，可以定性或定量给出微生物污染的程度。参考的测试方法通常是IP385/99或者ASTM D 6974-04，这种方法是许多微生物检测技术的基础。与传统的检测方法比，这些方法更简便，也能灵敏地反映燃油微生物污染情况，受到油品检测单位的普遍欢迎。
HY-LiTE Jet Al燃料测试法，是德国MERCK集团开发出来的。其原理是通过测量样品中三磷酸腺苷(ATP)的含量来评估样品中的活菌数。其大体步骤为：将燃油样品与酶试剂在专用的测试笔中混合，当ATP与酶反应时，用专用的检测仪就可测生物体发光反应强度(RLU)，其反应强度越高，仪器读数越大。通过精确检测反应过程中释放出的光量，就可以精确检测ATP存在的量。因为RLU与试验中的ATP的量成比例，所以也与航空燃油中的微生物数量成比例。HY-LITE测试法支持水相、油相及油水混合样品的检测，并且支持绝大部分微生物污染检测。但HY-LiTE测试法的最大问题，是在于其对实验室环境、设备和操作者的微生物专业程度要求特高；另外，由于是通过检测ATP的量来检测飞机燃油微生物的含量，检测方法不直观，受其它因素影响较大；测试结果无法告诉我们是哪些微生物，即无法对污染微生物进行特异性检测；测试笔等日常消耗品为德国进口，消耗量大，价格昂贵。
英国ECHA公司商品化的MM2工具箱，是将油料中的微生物生长在一种培养基上，做总体鉴定。在MM2工具箱装备中有一瓶营养凝胶体，用注射器把油料样品注射到凝胶体中，晃动玻璃瓶，凝胶体溶解，样品分散，再放到一薄层中，让微生物在凝胶体中生长几天，催化色素产生可见的红紫色菌落。
而油料中的污染微生物，类别较多，包括细菌、真菌以及特殊腐蚀性微生物，如SRB类细菌。在同一种培养基上，种类繁多的微生物，其生长状况不尽相同。有些微生物，是聚集成团，对输油管路，尤其是飞机的燃油管路和指示仪表，可以堵塞和干扰。有些微生物，如SRB类细菌，主要是腐蚀储油罐内壁、输油管路和油箱。
目前，市场上还没有一种石油污染微生物的检测工具箱能进行以上微生物的分类精细鉴别。
发明内容
本发明目的是：提供一种石油微生物检测工具箱用培养基组，以解决上述问题。
本发明的技术方案是：
一种石油微生物检测工具箱用培养基组，包括：细菌的培养基、真菌的培养基和SRB菌生长的培养基三种培养基，设定所述细菌的培养基为B培养基，真菌的培养基为E培养基，SRB菌生长的培养基为S培养基，所述B培养基的pH值为6.5～7.5，所述E培养基的pH值为pH 4～5.5，所述S培养基的pH值为6.0～8.0，所述B培养基和E培养基中均含有显色剂红四氮唑或蓝四氮唑，所述S培养基中含有显色剂Fe2+，将石油样品分别放置入所述B培养基、E培养基和S培养基中，可获得石油微生物的生长和分类信息，能更灵敏地用肉眼观察和判定固体培养基上的微生物菌落的分类、多少以及活性程度，更精细地判定石油微生物污染等级。
进一步的，所述B培养基、E培养基和S培养基中均含有培养基凝胶，所述培养基凝胶中含有1～20g/L琼脂、1～10g/L瓜尔胶、1～10g/L卡拉胶、1～10g/L黄原胶或1～10g/L阿拉伯胶中的任意一种。
进一步的，所述红四氮唑或蓝四氮唑的添加方法为：将所述红四氮唑水溶液或蓝四氮唑水溶液无菌过滤，然后在所述B培养基或E培养基高温灭菌后降至80℃以下时加入其中，并且混合均匀。
进一步的，所述显色剂Fe2+的添加方法为：将FeSO4或(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O的水溶液无菌过滤，然后在所述S培养基高温灭菌后降至80℃以下时加入其中，并且混合均匀。
进一步的，所述B培养基中的营养盐含有机氮源、碳源和缓冲盐，所述有机氮源为蛋白胨、酵母粉或酵母浸出粉中的任意一种或多种，所述有机氮源的总浓度为1～20g/L，所述碳源为1～20g/L葡萄糖，所述缓冲盐的pH值为6.5～7.5，所述缓冲盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠中的任意一种或多种，所述缓冲盐的浓度为5～50mM磷酸根。
进一步的，所述E培养基含有10～100mM柠檬酸根的缓冲液，所述缓冲液的pH值为4～5.5。
进一步的，所述E培养基的营养盐采用普通马铃薯培养基或麦芽汁培养基。
进一步的，所述E培养基的制作方法为：将营养盐同培养基所需凝胶一起高温蒸汽灭菌，再与高温灭菌后的pH值为4～5.5的缓冲液混合。
进一步的，所述S培养基的营养盐含碳源、无机氮源、有机氮源、无机盐、缓冲盐和专用硫酸盐类，所述碳源为乳酸钠、蔗糖和柠檬酸钠，所述碳源的总浓度为1～20g/L，所述有机氮源为蛋白胨、酵母浸粉、酵母粉中的一种或几种，所述有机氮源的总浓度为0.1～5g/L，所述无机氮源为硫酸铵、氯化铵或磷酸氢二铵中的任意一种或几种，所述无机氮源的总浓度为0.1～5g/L，所述无机盐含有氯化钙、硫酸镁，所述无机盐的总浓度为0.1～5g/L，所述缓冲盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠中的任意一种或几种，所述缓冲盐的总浓度为0.1～5g/L，所述专用硫酸盐类为硫酸钠、硫酸钾或硫酸铵中任意一种或几种，所述专用硫酸盐类的总浓度为0.1～10g/L。
进一步的，所述S培养基的制作方法为：将各个营养盐成分用水混匀后加入培养基凝胶，再用50～250g/L氢氧化钠调节pH值至6.0～8.0后，高温蒸汽灭菌。
本发明提供了一种石油微生物检测工具箱用培养基组，制备适合细菌、真菌和典型的腐蚀性微生物SRB菌生长所用的三类培养基，从而能更灵敏用肉眼观察和判定固体培养基上的微生物菌落的多少以及活性程度，更精细地判定石油微生物污染等级。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
一种石油微生物检测工具箱用培养基组，适合细菌、真菌和典型的腐蚀性微生物SRB菌生长，包括：组成该工具箱微生物污染检测用的培养基，该工具箱用培养基，分为三类，分别是B培养基、E培养基和S培养基，其营养盐成分各不相同。
培养基的pH梯度，更适合细菌、真菌和SRB菌分别生长。适合细菌的(B培养基)维持在pH 6.5～7.5；适合真菌的培养基(E培养基)pH维持在pH 4～5.5；适合SRB菌生长的S培养基pH维持在pH 6.5～8；
B培养基中含有显色剂红四氮唑(TTC)或蓝四氮唑(MTT)，红四氮唑(TTC)或蓝四氮唑(MTT)是以其水溶液无菌过滤，然后在B培养基高温灭菌后降到80℃以下时加入其中混合均匀，TTC或MTT的终浓度为10～60mg/L。B培养基采用的培养基凝胶含有1～20g/L琼脂、1～10g/L瓜尔胶、1～10g/L卡拉胶、1～10g/L黄原胶和1～10g/L阿拉伯胶。B培养基的营养盐含有机氮源、碳源、缓冲盐，其中的有机氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸出粉中的一种或几种且总浓度为1～20g/L，其中的碳源为1～20g/L葡萄糖，其中的缓冲盐pH为6.5～7.5并包含磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠中的一种或几种且总浓度为5～50mM磷酸根。
E培养基中含有显色剂红四氮唑(TTC)或蓝四氮唑(MTT)，红四氮唑(TTC)或蓝四氮唑(MTT)是以其水溶液无菌过滤，然后在E培养基高温灭菌后降到80℃以下时加入其中混合均匀，TTC或MTT的终浓度为10～60mg/L。E培养基采用的培养基凝胶含有1～20g/L琼脂、1～10g/L瓜尔胶、1～10g/L卡拉胶、1～10g/L黄原胶和1～10g/L阿拉伯胶。E培养基的制造是用营养盐同培养基所需凝胶一起高温蒸汽灭菌，再同高温灭菌后的pH 4～5.5的缓冲液混合。E培养基缓冲液采用pH 4～5.5的含有10-100mM柠檬酸根的缓冲液。E培养基的营养盐采用普通马铃薯培养基(PDA)或麦芽汁培养基。
S培养基中含有显色剂Fe2+，是以FeSO4或(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O水溶液无菌过滤，然后在所述S培养基高温灭菌后降至80℃以下时加入其中，并且混合均匀。S培养基采用的培养基凝胶含有1～20g/L琼脂、1～10g/L瓜尔胶、1～10g/L卡拉胶、1～10g/L黄原胶和1～10g/L阿拉伯胶。S培养基各个营养盐成分用水混匀后加入培养基凝胶，再用50～250g/L氢氧化钠调节pH至6.0～8.0后115～121℃灭菌15～30min。S培养基营养盐含碳源、无机氮源、有机氮源、无机盐、缓冲盐和专用硫酸盐类，其中的碳源为乳酸钠、蔗糖和柠檬酸钠，且总浓度为1～20g/L，其中的有机氮源为蛋白胨、酵母浸粉、酵母粉中的一种或几种，且总浓度为0.1～5g/L，其中的无机氮源为硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵中的一种或几种，且总浓度为0.1～5g/L，其中的无机盐含有氯化钙、硫酸镁，且总浓度为0.1～5g/L，其中的缓冲盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或几种，且总浓度为0.1～5g/L，其中专用硫酸盐类为硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵中一种或几种，且总浓度为0.1～10g/L。S培养基115～121℃灭菌15～30min后降温至80℃以下在无菌条件下加入用0.45μM膜过滤除菌的1～10g/L维生素C的水溶液和1～20g/L(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O的水溶液，加入体积为1～10mL每升S培养基，并混合均匀后分装。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本实施案例按如下步骤展示一种石油微生物检测工具箱用培养基组：
组成该工具箱微生物污染检测用的培养基分三类pH梯度，这三类培养基作为整体一起完成石油微生物污染程度的检测工作，适合细菌的培养基(B培养基)维持在pH6.5，适合真菌的培养基(E培养基)pH维持在pH4.5，适合SRB菌生长的培养基(S培养基)pH维持在pH6.0。B培养基和E培养基中均含有显色剂红四氮唑(TTC)，S培养基中含有显色剂Fe2+。
B培养基的制作方法为：含有蛋白胨1g/L，葡萄糖5g/L，10mM且pH 6.5磷酸二氢钾-磷酸氢二钠，琼脂1g/L、瓜尔胶2g/L、卡拉胶2g/L、黄原胶5g/L和阿拉伯胶1g/L，121℃灭菌15min。显色剂TTC先用纯净水溶解后再无菌过滤，然后在B培养基温度降到60℃左右时加入其中混合均匀，其TTC终浓度为20mg/L。
E培养基的制作方法为：马铃薯150～300g去皮切碎，煮烂后纱布过滤取得土豆汁，加入葡萄糖20g、琼脂1g、瓜尔胶2g、卡拉胶2g、黄原胶5g和阿拉伯胶1g，补水到1L，121℃灭菌15min。另200mL的pH4.5，50mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液在121℃灭菌15min。待两者降温至60℃左右时混合，混合比例为1000mL:200mL。显色剂TTC先用纯净水溶解后再无菌过滤，然后在上述混合液温度降到60℃左右时加入其中混合均匀，其TTC终浓度为20mg/L。
S培养基的制作方法为：将含有乳酸钠10g/L、酵母浸粉1g/L、硫酸铵1g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸钠5g/L、琼脂1g/L、瓜尔胶2g/L、卡拉胶2g/L、黄原胶5g/L和阿拉伯胶1g/L的溶液调至pH6.0，115℃灭菌30min，待温度降到60℃时在无菌条件下加入用0.45μM膜过滤除菌的10g/L维生素C的水溶液和10g/L(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O的水溶液，加入体积比例为2mL每升S培养基，混合均匀。
实施例2
本实施案例按如下步骤展示一种石油微生物检测工具箱用培养基组：
组成该工具箱微生物污染检测用的培养基分三类pH梯度，这三类培养基作为整体一起完成石油微生物污染程度的检测工作，适合细菌的培养基(B培养基)维持在pH7.0，适合真菌的培养基(E培养基)pH维持在pH5.0，适合SRB菌生长的培养基(S培养基)pH维持在pH7.0。B培养基和E培养基中均含有显色剂蓝四氮唑(MTT)，S培养基中含有显色剂Fe2+。
B培养基的制作方法为：含有酵母浸出粉5g/L，葡萄糖10g/L，20mM且pH 7.0磷酸二氢钾-磷酸氢二钠，琼脂2g/L、瓜尔胶5g/L、卡拉胶1g/L、黄原胶2g/L和阿拉伯胶7g/L，121℃灭菌20min。显色剂MTT先用纯净水溶解后再无菌过滤，然后在B培养基温度降到50℃左右时加入其中混合均匀，其MTT终浓度为30mg/L。
E培养基的制作方法为：马铃薯150～300g去皮切碎，煮烂后纱布过滤取得土豆汁，加入葡萄糖20g、琼脂2g、瓜尔胶5g、卡拉胶1g、黄原胶2g和阿拉伯胶7g，补水到1L，121℃灭菌20min。另200mL的pH 5.0、100mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液在121℃灭菌20min。待两者降温至50℃左右时混合，混合比例为1000mL:40mL。显色剂MTT先用纯净水溶解后再无菌过滤，然后在上述混合液温度降到60℃左右时加入其中混合均匀，其MTT终浓度为30mg/L。
S培养基的制作方法为：将含有乳酸钠5g/L、酵母浸粉0.5g/L、硫酸铵5g/L、氯化钙1g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸钠5g/L、琼脂2g/L、瓜尔胶5g/L、卡拉胶1g/L、黄原胶2g/L和阿拉伯胶7g/L的溶液调至pH7.0，115℃灭菌30min，待温度降到60℃时在无菌条件下加入用0.45μM膜过滤除菌的5g/L维生素C的水溶液和20g/L(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O的水溶液，加入体积比例为10mL每升S培养基，混合均匀。
实施例3
本实施案例按如下步骤展示一种石油微生物检测工具箱用培养基组：
组成该工具箱微生物污染检测用的培养基分三类pH梯度，这三类培养基作为整体一起完成石油微生物污染程度的检测工作，适合细菌的培养基(B培养基)维持在pH 7.5，适合真菌的培养基(E培养基)pH维持在pH5.5，适合SRB菌生长的培养基(S培养基)pH维持在pH7.5。B培养基和E培养基中均含有显色剂蓝四氮唑(MTT)，S培养基中含有显色剂Fe2+。
B培养基的制作方法为：含有酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，5mM且pH 7.5磷酸二氢钾-磷酸氢二钠，琼脂1g/L、瓜尔胶1g/L、卡拉胶10g/L、黄原胶1g/L和阿拉伯胶2g/L，115℃灭菌30min。显色剂MTT先用纯净水溶解后再无菌过滤，然后在B培养基温度降到50℃左右时加入其中混合均匀，其MTT终浓度为10mg/L。
E培养基的制作方法为：马铃薯150～300g去皮切碎，煮烂后纱布过滤取得土豆汁，加入葡萄糖20g、琼脂1g、瓜尔胶1g、卡拉胶10g、黄原胶1g和阿拉伯胶2g，补水到1L，115℃灭菌30min。另200mL的pH 5.5、100mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液在121℃灭菌20min。待两者降温至50℃左右时混合，混合比例为1000mL:40mL。显色剂MTT先用纯净水溶解后再无菌过滤，然后在上述混合液温度降到60℃左右时加入其中混合均匀，其MTT终浓度为10mg/L。
S培养基的制作方法为：将含有乳酸钠5g/L、酵母浸粉0.5g/L、硫酸铵8g/L、氯化钙1g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸钠2g/L、琼脂1g/L、瓜尔胶1g/L、卡拉胶10g/L、黄原胶1g/L和阿拉伯胶2g/L的溶液调至pH7.5，115℃灭菌30min，待温度降到60℃时在无菌条件下加入用0.45μM膜过滤除菌的1g/L维生素C的水溶液和20g/L FeSO4的水溶液，加入体积比例为10mL每升S培养基，混合均匀。
实施例4
本实施案例按如下步骤展示一种石油微生物检测工具箱用培养基组：
组成该工具箱微生物污染检测用的培养基分三类pH梯度，这三类培养基作为整体一起完成石油微生物污染程度的检测工作，适合细菌的培养基(B培养基)维持在pH6.5，适合真菌的培养基(E培养基)pH维持在pH5.0，适合SRB菌生长的培养基(S培养基)pH维持在pH7.0。B培养基和E培养基中均含有显色剂红四氮唑(TTC)，S培养基中含有显色剂Fe2+。
B培养基的制作方法为：含有酵母粉10g/L，葡萄糖10g/L，50mM且pH 6.5磷酸二氢钾-磷酸氢二钠，琼脂5g/L、瓜尔胶5g/L、卡拉胶1g/L、黄原胶5g/L和阿拉伯胶2g/L，115℃灭菌30min。显色剂TTC先用纯净水溶解后再无菌过滤，然后在B培养基温度降到80℃左右时加入其中混合均匀，其TTC终浓度为10mg/L。
E培养基的制作方法为：马铃薯150～300g去皮切碎，煮烂后纱布过滤取得土豆汁，加入葡萄糖20g、琼脂1g、瓜尔胶1g、卡拉胶10g、黄原胶1g和阿拉伯胶2g，补水到1L，115℃灭菌30min。另200mL的pH5.5、100mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液在121℃灭菌20min。待两者降温至50℃左右时混合，混合比例为1000mL:40mL。显色剂TTC先用纯净水溶解后再无菌过滤，然后在上述混合液温度降到60℃左右时加入其中混合均匀，其TTC终浓度为10mg/L。
S培养基的制作方法为：将含有乳酸钠2g/L、柠檬酸钠5g/L、酵母浸粉0.1g/L、硫酸铵9g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸钠1g/L、琼脂1g/L、瓜尔胶1g/L、卡拉胶10g/L、黄原胶1g/L和阿拉伯胶2g/L的溶液调至pH7.0，115℃灭菌30min，待温度降到80℃时在无菌条件下加入用0.45μM膜过滤除菌的10g/L维生素C的水溶液和10g/L FeSO4的水溶液，加入体积比例为20mL每升S培养基，混合均匀。
实施例5
本实施案例按如下步骤展示一种石油微生物检测工具箱用培养基组：
组成该工具箱微生物污染检测用的培养基分三类pH梯度，这三类培养基作为整体一起完成石油微生物污染程度的检测工作，适合细菌的培养基(B培养基)维持在pH7.0，适合真菌的培养基(E培养基)pH维持在pH5.0，适合SRB菌生长的培养基(S培养基)pH维持在pH7.0。B培养基和E培养基中均含有显色剂蓝四氮唑(MTT)，S培养基中含有显色剂Fe2+。
B培养基的制作方法为：含有酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，5mM且pH 7.0磷酸二氢钾-磷酸氢二钠，琼脂2g/L、瓜尔胶2g/L、卡拉胶2g/L、黄原胶5g/L和阿拉伯胶1g/L，115℃灭菌30min。显色剂TTC先用纯净水溶解后再无菌过滤，然后在B培养基温度降到45℃左右时加入其中混合均匀，其TTC终浓度为60mg/L。
E培养基的制作方法为：取大麦或小麦100g，用水洗净，浸水6～12小时，至20℃阴暗处发芽，上面盖纱布一块，每日隔12h淋水50mL，麦根伸长至麦粒的两倍时即停止发芽，磨碎，加300mL水，在65～70℃水浴中糖化3～4小时，糖化程度可用碘滴定观察，继续在糖化液中搅拌至煮沸，以4～6层纱布过滤得澄清滤液，加水至800mL得麦芽汁，再加入琼脂2g、瓜尔胶2g、卡拉胶2g、黄原胶5g和阿拉伯胶1g，补水到1L，115℃灭菌30min。另200mL的pH5.0、50mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液在115℃灭菌30min。待两者降温至50℃左右时混合，混合比例为1000mL:50mL。显色剂TTC先用纯净水溶解后再无菌过滤，然后在上述混合液温度降到45℃左右时加入其中混合均匀，其TTC终浓度为60mg/L。
S培养基的制作方法为：将含有乳酸钠5g/L、柠檬酸钠5g/L、酵母浸粉1g/L、硫酸铵2g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸钠8g/L、琼脂2g/L、瓜尔胶2g/L、卡拉胶2g/L、黄原胶5g/L和阿拉伯胶1g/L的溶液调至pH7.0，115℃灭菌30min，待温度降到45℃时在无菌条件下加入用0.45μM膜过滤除菌的10g/L维生素C的水溶液和20g/LFeSO4的水溶液，加入体积比例为10mL每升S培养基，混合均匀。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用同一个石油样品进行微生物培养，能在B培养基、E培养基和S培养基上分别生长出细菌、真菌和典型的腐蚀性微生物SRB菌的菌落，三类菌落的颜色分别是：B培养基上显现红色或紫红色斑点、E培养基上显现红色或紫红色斑点、S培养基上显现黑色斑点.同已有的商品化石油微生物检测方法相比，本发明最明显的效果是能更灵敏地用肉眼观察和判定同一石油样品中微生物菌落的分类、多少以及活性程度，更精细地判定石油微生物污染等级。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种石油微生物检测工具箱用培养基组，其特征在于，包括：细菌的培养基、真菌的培养基和硫酸盐还原菌生长的培养基三种培养基，设定所述细菌的培养基为B培养基，真菌的培养基为E培养基，硫酸盐还原菌生长的培养基为S培养基，所述B培养基的pH值为6.5～7.5，所述E培养基的pH值为pH 4～5.5，所述S培养基的pH值为6.0～8.0，所述B培养基和E培养基中均含有显色剂红四氮唑或蓝四氮唑，所述S培养基中含有显色剂亚铁离子Fe2+，将石油样品分别放入所述B培养基、E培养基和S培养基中，获得石油微生物的生长和分类信息。
2.根据权利要求1所述的一种石油微生物检测工具箱用培养基组，其特征在于：所述B培养基、E培养基和S培养基中均含有培养基凝胶，所述培养基凝胶中含有1～20g/L琼脂、1～10g/L瓜尔胶、1～10g/L卡拉胶、1～10g/L黄原胶或1～10g/L阿拉伯胶中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种石油微生物检测工具箱用培养基组，其特征在于，所述红四氮唑或蓝四氮唑的添加方法为：将所述红四氮唑水溶液或蓝四氮唑水溶液无菌过滤，然后在所述B培养基或E培养基高温灭菌后降至80℃以下时加入其中，并且混合均匀。
4.根据权利要求1所述的一种石油微生物检测工具箱用培养基组，其特征在于，所述显色剂Fe2+的添加方法为：将FeSO4或(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O水溶液无菌过滤，然后在所述S培养基高温灭菌后降至80℃以下时加入其中，并且混合均匀。
5.根据权利要求1所述的一种石油微生物检测工具箱用培养基组，其特征在于：所述B培养基中的营养盐含有机氮源、碳源和缓冲盐，所述有机氮源为蛋白胨、酵母粉或酵母浸出粉中的任意一种或多种，所述有机氮源的总浓度为1～20g/L，所述碳源为1～20g/L葡萄糖，所述缓冲盐的pH值为6.5～7.5，所述缓冲盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠中的任意一种或多种，所述缓冲盐的浓度为5～50mM磷酸根。
6.根据权利要求1所述的一种石油微生物检测工具箱用培养基组，其特征在于：所述E培养基含有10～100mM柠檬酸根的缓冲液，所述缓冲液的pH值为4～5.5。
7.根据权利要求1所述的一种石油微生物检测工具箱用培养基组，其特征在于：所述E培养基的营养盐采用普通马铃薯培养基或麦芽汁培养基。
8.根据权利要求1所述的一种石油微生物检测工具箱用培养基组，其特征在于，所述E培养基的制作方法为：将营养盐同培养基所需凝胶一起高温蒸汽灭菌，再与高温灭菌后的pH值为4～5.5的缓冲液混合。
9.根据权利要求1所述的一种石油微生物检测工具箱用培养基组，其特征在于：所述S培养基的营养盐含碳源、无机氮源、有机氮源、无机盐、缓冲盐和专用硫酸盐类，所述碳源为乳酸钠、蔗糖和柠檬酸钠，所述碳源的总浓度为1～20g/L，所述有机氮源为蛋白胨、酵母浸粉、酵母粉中的一种或几种，所述有机氮源的总浓度为0.1～5g/L，所述无机氮源为硫酸铵、氯化铵或磷酸氢二铵中的任意一种或几种，所述无机氮源的总浓度为0.1～5g/L，所述无机盐含有氯化钙、硫酸镁，所述无机盐的总浓度为0.1～5g/L，所述缓冲盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠中的任意一种或几种，所述缓冲盐的总浓度为0.1～5g/L，所述专用硫酸盐类为硫酸钠、硫酸钾或硫酸铵中任意一种或几种，所述专用硫酸盐类的总浓度为0.1～10g/L。
10.根据权利要求1所述的一种石油微生物检测工具箱用培养基组，其特征在于，所述S培养基的制作方法为：将各个营养盐成分用水混匀后加入培养基凝胶，再用50～250g/L氢氧化钠调节pH值至6.0～8.0后，高温蒸汽灭菌。
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