CN109371098A - 一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法,包括:在微生物于固体培养基上生长后,用碱性溶液喷淋含有红四氮唑或蓝四氮唑的甲臜类还原产物的固体培养基表面。上述方法能更灵敏地用肉眼观察到固体培养基上这些色素的还原产物的颜色,从而能更灵敏地用肉眼观察和判定固体培养基上的微生物菌落的多少以及活性程度。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域,具体涉及一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法。
背景技术
石油或航空燃油储存过程会引发大型储罐的腐蚀。据报道,这类腐蚀主要由微生物滋生所导致。油料中存在的腐蚀性微生物,主要有细菌、真菌和放线菌三类。有的微生物腐蚀性特别强,例如硫酸盐还原菌(SRB)、硫氧化菌和铁细菌,其代谢活动会释放出有机酸和其它腐蚀性产物,在储存罐和飞机油箱中生长繁殖会导致油罐腐蚀、可以将油罐壁、油箱壁腐蚀破坏,造成油罐、油箱漏油等严重故障;有的微生物如树脂芽枝霉等繁殖很快,很容易集结成可见的絮状物,当包成团时,体积增长非常快,很容易造成飞机的燃料过滤器堵塞、燃油喷嘴结焦,或者油量指示设备故障,指示器读数不准确,甚至会威胁飞机飞行安全,造成飞机发动机空中停车。
非常精确地鉴定油料中微生物到底是什么,精确到菌种或菌株细分类,这对于石油或航空燃油储存过程中的日常腐蚀性微生物的污染预警,代价过高,操作繁琐,是不必要的。我们只需要知道油料中微生物污染总概况即可。或者,对某些腐蚀性细菌类别,例如硫酸盐还原菌(SRB)、硫氧化菌和铁细菌的污染,可以增加重点监测。
在发明专利201510297486.4中,发明人提及一种快速检测含油污水处理体系中石油烃及菌体含量方法,此发明专利是在一特定波长条件下,直接用分光光度计测定含有石油烃和细菌的悬液总光吸收值,用其预先实验得到的简单的二元一次方程,计算污水中石油烃及菌体含量。发明专利CN201110122479中,发明人提及一种中高温油藏细菌种群检测基因芯片及其用途。此发明专利是以待检测样品的基因组为模板,用标记的引物组进行扩增,然后将得到的扩增产物与生物芯片上的探针进行杂交,根据杂交结果确定油藏细菌群落构成,因而价格过高,并需要分子生物学昂贵设备。
在发明专利20091016426.4中,发明人提及一种飞机燃油微生物检测方法,此方法在不同培养基中加燃油样本培养和染色,形成易观察的菌落,用目视和显微镜对比观察来检测和监控飞机燃油系统、加油车、油库、油罐中的微生物污染程度,其微生物染色操作是挑取少许待检菌于载玻片上的无菌水中,混合均匀后涂布,进行简单染色或革兰氏染色,而不是在培养基上进行微生物活性显色。
关于油料微生物污染概况的检测,用不同原理的检测方法得出的结果也不尽相同。目前,国际航空运输协会(IATA)主要推荐MicrobMonitor 2(简称MM2)、HY-LiTE两类检测方法。英国ECHA公司(ECHA Microbiology Ltd.,UK)商品化的MM2工具箱,是将油料中的微生物生长在一种固体培养基上,做总体的微生物活性显色鉴定。此工具包的技术标准在2015年被美国材料与试验协会(American Society for Testing Materials,ASTM)收录为新的技术标准(参见ASTM D7978)[Google:MicrobMonitor2fuel test adopted as NEWASTM standard method(D7978)]。MM2工具箱,其原理是将石油样品混合到灭过菌的固体培养基上,经过一段时间的培养,石油中所含的微生物会生长成菌落,培养基中还预加色素分子作为活性显色剂,该菌落可以还原色素分子,其产物形成红色。因而可以肉眼更清晰地观测各类菌落的数目。其操作要领主要有两条:一是需要无菌操作,包括燃油取样器的取出和样品注入MM2培养瓶内;二是专业标准色卡的解读。
以上发明专利和产品中,均没有用到活性显色剂增强的操作技术措施。微生物活性显色剂,均为氧化还原色素类分子。目前,微生物活性最常用的显色剂为四氮唑盐,有两种,其结构类似,显色原理相同。其一便是红四氮唑(TTC),其还原产物为不溶于水的深红色三苯甲臜,在480~490nm波长处有最大吸收。其二是蓝四氮唑(MTT),英文名为(Methylthiazolyl diphenyl-tetrazolium bromide),其化学名为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,其还原产物为蓝紫色的双甲臜晶体,在550nm波长处有最大吸收。
TTC和MTT是一种可接受氢离子的化合物染料,带正电荷,具有细胞膜渗透性。活的微生物细胞的琥珀酸脱氢酶等脱氢酶类,能够将外源的TTC和MTT还原为水不溶性的有颜色的甲臜产物,而死细胞不具有此功能。而甲臜结晶的生成量与活细胞数目成正比,可以用以评估微生物的存活状况。甲臜产物在480~550nm波长下有光谱吸收,因而显红色或紫色。
无论是TTC,还是MTT,其还原后的显色产物的显色波长,需要稳定在峰值。这需要固体培养基处在中性环境和碱性环境条件下。但微生物在检测培养基中生长过程中,会积累酸性代谢物,培养基亦会变酸,从而造成还原产物显色的淡化。如何保证显色产物的灵敏性和颜色增强,这是石油微生物固体培养基法检测的一个难点。
发明内容
本发明目的是:提供一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法,以解决上述问题。
本发明的技术方案是:
一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法,包括:在微生物于固体培养基上生长后,用碱性溶液喷淋含有红四氮唑或蓝四氮唑的甲臜类还原产物的固体培养基表面。
进一步的,所述碱性溶液的pH值大于或等于8.5。
进一步的,所述碱性溶液是由强碱或/和弱碱用水配制而成。
进一步的,所述强碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氨水中的任意一种。
进一步的,所述弱碱为碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或磷酸氢钙中的任意一种。
进一步的,所述强碱或/和弱碱的总浓度为0.5~100g/L。
进一步的,所述碱性溶液储存在工具箱的专用瓶子内,与所述固定培养基隔离。
本发明提供了一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法,能更灵敏地用肉眼观察和判定固体培养基上的微生物活性程度.无论是TTC,还是MTT,微生物活性显色后其还原产物可显色稳定,TTC的还原产物呈现鲜明的红色,MTT还原产物呈现鲜明的紫红色,从而增强显色剂还原产物的颜色,从而能更明显地用肉眼观察和判定固体培养基上的微生物菌落的多少以及活性程度,增加检测的灵敏性程度。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明提出了一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法,步骤包括:在微生物培养完成后,用碱性溶液喷淋含有红四氮唑(TTC)或蓝四氮唑(MTT)的甲臜类还原产物的固体培养基。
喷淋用的碱性溶液,其pH值大于等于8.5,是用强碱、弱碱单独或组合方式用水配制而成。强碱包括并不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁和氨水,弱碱包括并不限于碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢钙。上述碱性溶液的强碱、弱碱单独或组合方式配制时其总浓度为1~100g/L,碱性溶液水为去离子水、纯净水或蒸馏水,澄清透明无色、无肉眼可见的悬浮物,碱性溶液水配制完成后放置至少12小时。喷淋用的溶液储存在工具箱的专用瓶子内,并不与培养基在开始时混合,喷淋耗用的溶液体积为1~10mL,在喷淋后等待1min以上进行颜色观察。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例,还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含MTT的pH为5.0~6.5的固体培养基上三天,产生MTT的还原产物。喷淋用的碱性溶液为10g/L氢氧化钠的去离子水溶液,其pH值大于11。碱性溶液存放在100mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷2次,每次持续约1秒钟,喷出体积为2~5mL。静待3~5分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例2
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含MTT的pH为4.0~5.5的固体培养基上三天,产生MTT的还原产物。喷淋用的碱性溶液为20g/L碳酸钠的蒸馏水溶液,其pH值大于12。碱性溶液存放在100mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷2次,每次持续约1秒钟,喷出体积为2~5mL。静待1~5分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例3
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含MTT的pH为5.0~7.0的固体培养基上三天,产生MTT的还原产物。喷淋用的碱性溶液为50g/L碳酸氢钠的蒸馏水溶液,其pH值大于12。碱性溶液存放在250mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷2次,每次持续约2秒钟,喷出体积为2~5mL。静待10~15分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例4
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含MTT的pH为3.0~5.0的固体培养基上三天,产生MTT的还原产物。喷淋用的碱性溶液为50g/L氨水的蒸馏水溶液,其pH值大于12。碱性溶液存放在250mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷2次,每次持续约1秒钟,喷出体积为2~5mL。静待10~15分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例5
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含TTC的pH为5.0~7.0的固体培养基上三天,产生TTC的还原产物。喷淋用的碱性溶液为50g/L磷酸氢二钠的蒸馏水溶液,其pH值大于8.5。碱性溶液存放在250mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷2次,每次持续约1秒钟,喷出体积为2~3mL。静待10~20分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例6
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含MTT的pH为6.0~8.0的固体培养基上三天,产生MTT的还原产物。喷淋用的碱性溶液为50g/L磷酸氢二钾的蒸馏水溶液,其pH值大于8.5。碱性溶液存放在250mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷2次,每次持续约1秒钟,喷出体积为2~3mL。静待20~30分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例7
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含MTT的pH为3.0~5.0的固体培养基上三天,产生MTT的还原产物。喷淋用的碱性溶液为2g/L氢氧化钾的蒸馏水溶液,其pH值大于10。碱性溶液存放在250mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷2次,每次持续约1秒钟,喷出体积为1~3mL。静待2~5分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例8
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含TTC的pH为6.0~8.0的固体培养基上三天,产生TTC的还原产物。喷淋用的碱性溶液为1g/L氢氧化钾的蒸馏水溶液,其pH值大于9。碱性溶液存放在250mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷3次,每次持续约1秒钟,喷出体积为2~5mL。静待2~5分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例9
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含MTT的pH为3.0~5.0的固体培养基上四天,产生MTT的还原产物。喷淋用的碱性溶液为100g/L碳酸钠的蒸馏水溶液,其pH值大于13。碱性溶液存放在250mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷3次,每次持续约1秒钟,喷出体积为1~3mL。静待2~5分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例10
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含MTT的pH为5.0~7.0的固体培养基上三天,产生MTT的还原产物。喷淋用的碱性溶液含有2g/L氢氧化钠和20g/L磷酸氢二钠的蒸馏水溶液,其pH值大于10。碱性溶液存放在250mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷2次,每次持续约1秒钟,喷出体积为1~3mL。静待5~10分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例11
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含MTT的pH为5.0~7.0的固体培养基上三天,产生MTT的还原产物。喷淋用的碱性溶液含有5g/L碳酸钠和20g/L碳酸氢钠的蒸馏水溶液,其pH值大于12。碱性溶液存放在250mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷2次,每次持续约1秒钟,喷出体积为2~5mL。静待3~5分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例12
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含MTT的pH为5.0~7.0的固体培养基上三天,产生MTT的还原产物。喷淋用的碱性溶液含有20g/L氨水和1g/L碳酸钙的蒸馏水溶液,其pH值大于12。碱性溶液存放在250mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷2次,每次持续约1秒钟,喷出体积为2~5mL。静待3~5分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例13
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含MTT的pH为5.0~7.0的固体培养基上三天,产生MTT的还原产物。喷淋用的碱性溶液含有80g/L氨水和20g/L碳酸氢钾的蒸馏水溶液,其pH值大于13。碱性溶液存放在250mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷2次,每次持续约1秒钟,喷出体积为3~5mL。静待5~10分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例14
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含MTT的pH为5.0~7.0的固体培养基上三天,产生MTT的还原产物。喷淋用的碱性溶液含有20g/L磷酸氢二钾和2g/L碳酸钾的蒸馏水溶液,其pH值大于10。碱性溶液存放在250mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷2次,每次持续约1秒钟,喷出体积为3~5mL。静待5~10分钟后,观测培养基上显色情况。
实施例15
本实施案例按如下步骤展示一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法:
微生物生长在含MTT的pH为6.0~7.0的固体培养基上三天,产生MTT的还原产物。喷淋用的碱性溶液含有1g/L氢氧化钠、5g/L氨水和20g/L碳酸钠的去离子水溶液,其pH值大于13。碱性溶液存放在250mL左右洁净塑料喷壶中。塑料喷壶可以喷出气雾状液滴散布在整个固体培养基表面,喷2次,每次持续约1秒钟,喷出体积为2~5mL。静待1~3分钟后,观测培养基上显色情况。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:能更灵敏地用肉眼观察到固体培养基上这些色素的还原产物的颜色,从而能更灵敏地用肉眼观察和判定固体培养基上的微生物菌落的多少以及活性程度。
应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法,其特征在于:在微生物于固体培养基上生长后,用碱性溶液喷淋含有红四氮唑或蓝四氮唑的甲臜类还原产物的固体培养基表面。
2.根据权利要求1所述的一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法,其特征在于:所述碱性溶液的pH值大于或等于8.5。
3.根据权利要求1所述的一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法,其特征在于:所述碱性溶液是由强碱或/和弱碱用水配制而成。
4.根据权利要求3所述的一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法,其特征在于:所述强碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氨水中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法,其特征在于:所述弱碱为碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或磷酸氢钙中的任意一种。
6.根据权利要求3所述的一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法,其特征在于:所述强碱或/和弱碱的总浓度为0.5~100g/L。
7.根据权利要求1所述的一种石油腐蚀性微生物检测工具箱用微生物活性显色增强方法,其特征在于:所述碱性溶液储存在工具箱的专用瓶子内,与所述固定培养基隔离。
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Legal Events
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---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190222 |