CN116925947A

CN116925947A - 一株能产生表面活性剂且降解原油的枯草芽孢杆菌及应用

Info

Publication number: CN116925947A
Application number: CN202210361498.9A
Authority: CN
Inventors: 陈亚奎; 李兴春; 卢滇楠; 郑瑾; 杜显元; 吴慧君; 周银唤; 房晓宇
Original assignee: Tsinghua University; China National Petroleum Corp; CNPC Research Institute of Safety and Environmental Technology Co Ltd
Current assignee: Tsinghua University; China National Petroleum Corp; CNPC Research Institute of Safety and Environmental Technology Co Ltd
Priority date: 2022-04-07
Filing date: 2022-04-07
Publication date: 2023-10-24

Abstract

本发明提供一株能产生表面活性剂且降解原油的枯草芽孢杆菌及应用。本发明第一方面提供一株枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21627。本发明提供的保藏编号为CGMCC No.21627的枯草芽孢杆菌，一方面能够产生物表面活性剂，提高菌株与原油的亲和力，提高原油的乳化效果，另一方面能够以原油为唯一碳源生长，且具有较高的耐油性能，达到降解原油的作用，此外，该菌株还具备生长快、易培养、耐盐等特点，能够用于原油污染土壤的微生物修复中，实现高盐砂质土壤原油污染的原位修复。

Description

一株能产生表面活性剂且降解原油的枯草芽孢杆菌及应用

技术领域

本发明涉及一株能产生表面活性剂且降解原油的枯草芽孢杆菌及应用，涉及微生物技术领域。

背景技术

石油作为重要的工业原料，在能源、材料、化工等领域有着至关重要的作用，然而在石油开采、加工和运输过程中，由于操作不当或意外泄露容易造成原油污染，进而破坏土壤组成和结构，影响土壤通透性，引起土壤微生物群落变化，甚至导致植物根系中毒缺氧，影响营养吸收迫使粮食减产，污染物在粮食中积累，影响粮食品质最终危害人类健康。低浓度污染土壤修复是学术界和工程界公认的问题，其治理工作已成为我国环境保护和可持续发展的重大课题之一。

与传统的物理方法和化学方法相比，生物修复方法具备节能、减排、降耗、低成本、无二次污染、最大限度地降低污染物浓度、可同时处理受污染的土壤和地下水并实现土壤安全利用度等优点，成为土壤修复的优选技术手段。

目前使用的微生物为解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，该菌株能够产生表面活性剂，在一定程度上能够使油相乳化，但是，上述菌株无法利用原油进行代谢，表面活性剂的乳化作用对原油的处理效果有限，因此，如何提供一种能够降解原油的微生物是广大研究者研究的热点之一。

发明内容

本发明提供一株能产生表面活性剂且降解原油的枯草芽孢杆菌，该菌一方面能够产生表面活性剂，提高菌株与原油的亲和力，另一方面能够以原油为唯一碳源生长，且具有较高的耐油性能，达到降解原油的作用。

本发明第一方面提供一株枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌于2021年 01月15日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21627。

在一种具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌单个细胞大小为(0.7-0.8)μm×(2-3)μm，芽孢大小为(0.6-0.9)μm×(1.0-1.5)μm。

在一种具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌。

在一种具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明第二方面提供上述任一所述的枯草芽孢杆菌在产生表面活性剂中的应用。

本发明第三方面提供上述任一所述的枯草芽孢杆菌在降解原油中的应用。

本发明第四方面提供一种降解原油的方法，将上述任一所述的枯草芽孢杆菌加入到原油中进行降解。

在一种具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌在原油含量不高于8％的无机盐培养基中培养7天后，原油的降解率不低于10％。

在一种具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌的培养条件包括：摇床培养、培养温度为37℃、培养转速为170rpm。

在一种具体实施方式中，所述无机盐培养基中，盐含量不高于8％。

本发明提供的保藏编号为CGMCC No.21627的枯草芽孢杆菌，一方面能够产生物表面活性剂，提高菌株与原油的亲和力，提高原油的乳化效果，另一方面能够以原油为唯一碳源生长，且具有较高的耐油性能，达到降解原油的作用，此外，该菌株还具备生长快、易培养、耐盐等特点，能够用于原油污染土壤的微生物修复中，实现高盐砂质土壤原油污染的原位修复。

附图说明

图1为本发明提供的枯草芽孢杆菌的原油溶油圈现象；

图2为本发明提供的枯草芽孢杆菌的革兰氏染色镜检图；

图3为本发明提供的枯草芽孢杆菌的糖(醇)类发酵现象；

图4为本发明提供的枯草芽孢杆菌的淀粉水解现象；

图5为本发明提供的枯草芽孢杆菌的Tween80试验现象；

图6为本发明提供的枯草芽孢杆菌的甲基红试验现象；

图7为本发明提供的枯草芽孢杆菌的V-P试验现象；

图8为本发明提供的枯草芽孢杆菌的触酶试验现象；

图9为本发明提供的枯草芽孢杆菌的排油圈；

图10为本发明提供的枯草芽孢杆菌的排油圈试验结果；

图11为本发明提供的枯草芽孢杆菌的发酵液的表面张力测定结果；

图12为本发明提供的枯草芽孢杆菌的原油乳化性能试验结果；

图13为本发明提供的枯草芽孢杆菌的耐盐特性试验；

图14不同盐含量条件下枯草芽孢杆菌对液体石蜡的乳化性能试验结果；

图15为本发明提供的枯草芽孢杆菌的原油降解结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明以下试验所涉及的培养基配方如下：

LB液体培养基：酵母粉0.5g，氯化钠1.0g，蛋白胨1.0g，溶解于1000 mL去离子水，121℃灭菌15min。

LB固体培养基：酵母粉0.5g，氯化钠1.0g，蛋白胨1.0g，琼脂2.0g-3.0 g，溶于1000mL去离子水，121℃灭菌15min。

PDA液体培养基：马铃薯浸出粉0.3g，葡萄糖2.0g，溶解于1000mL 去离子水，121℃灭菌15min。

PDA固体培养基：马铃薯浸出粉0.3g，葡萄糖2.0g，琼脂2.0g-3.0g，溶解于1000mL去离子水，121℃灭菌15min。

无机盐液体培养基：硫酸铵1.0g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.2g，溶解于1000mL去离子水中，121℃灭菌15min。

无机盐固体培养基：硫酸铵1.0g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.2g，溶解于1000mL去离子水中，121℃灭菌15min

【枯草芽孢杆菌LSB25的筛选及鉴定】

1、菌株LSB25的分离、筛选

采集新疆石西石油污染土壤样品200g，通过循环流化床进行菌株初筛，环流液使用无机盐液体培养基，在第1、3、5、7天进行环流液取样，随后每 5天取一次环流液，最后每7天取一次环流液。

将LB固体培养基和PDA固体培养基趁热倒平板，凝固后得到LB固体平板和PDA固体平板，将取样得到的环流液样品分别稀释至10⁶和10⁸后涂布于LB固体平板和PDA固体平板上，在恒温箱内37℃培养，分离纯化得到菌株166株。

取初筛的得到的166株菌株的单菌落分别接种于含原油的无机盐固体培养基中，原油含量为0.1g/L，在37℃恒温培养箱中培养48小时，挑选具有明显溶油圈的菌株，该菌株如图1所示。

采用通用引物27F和1492R对该菌株进行PCR扩增测定菌株的16SrDNA 序列，该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。将序列输入NCBI数据库BLAST进行序列同源性检索分析比对，用MEGA-X构建分子进化树，获得与其同源性最高的已知序列以确定其种属，经确定，该菌株与枯草芽孢杆菌有较高的同源性，因此，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，并命名为LSB25，现于2021年01月15日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏编号为CGMCC。

对该菌株LSB25进行观察可知，菌落生长、繁殖速度快，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，经光学显微镜观察可知，该菌株单个细胞大小为 (0.7-0.8)μm×(2-3)μm，芽孢大小为(0.6-0.9)μm×(1.0-1.5)μm，芽孢形成后菌体不膨大。

2、菌株LSB25的鉴定

(1)革兰氏染色

制片：取干净载玻片一块，在载玻片上加一滴生理盐水，注意接种环的无菌操作，将培养20-24h的菌体均匀涂在载玻片上，注意菌体量适中。

固定：让涂片在室温下自然晾干，手执载玻片一端，菌膜朝上，在火焰上固定2-3次。

染色：滴加结晶紫进行初染1-2min，水洗；用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min进行媒染，水洗。

脱色：用95％的乙醇进行脱色。

复染：用番红液进行复染约2min，应用细小的缓流水将多余燃料从标本上洗去，但不要将细胞所吸附的燃料洗去，自然风干。

镜检：干燥后，用油镜观察。

图2为本发明提供的枯草芽孢杆菌的革兰氏染色镜检图，如图2所示，菌体被染成紫色，为革兰氏阳性菌。

(2)糖(醇)类发酵实验

配制休和李夫森二氏培养基，并分别添加1％葡萄糖、蔗糖、D-山梨醇、果糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖和1.5％乳糖，加入1％溴百里酚蓝混匀，将培养液分装于试管内，培养液高度约4-5cm，管内倒置杜氏小管，使其充满培养液，115℃灭菌20min，用穿刺针将培养8-12h的幼龄菌种接种于培养基中，室温培养1d、3d、5d后观察，若培养液颜色变黄，且有气泡产生，为阳性反应。

菌株LSB25的糖(醇)类发酵实验结果如图3所示，从左至右的试管依次为：空白组、葡萄糖、蔗糖、纤维二糖、D-山梨醇、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖，结果表明该菌株能以葡萄糖、蔗糖、纤维二糖、果糖、木糖、麦芽糖为碳源和能源进行发酵培养。

(3)淀粉水解实验

淀粉培养基配制：牛肉膏5g，NaCl 5g，可溶性淀粉5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.2，121℃灭菌20min，倒平板。

试验方法：以24h的纯培养物，点接于上述淀粉培养基平板上，于37℃ 培养48h，加入数滴碘液立即检视结果，阳性反应为培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈，阴性反应无透明圈出现。

图4为本发明提供的枯草芽孢杆菌的淀粉水解现象，如图4所示，该菌株能够水解淀粉。

(4)Tween80试验

培养基配制：蛋白胨10g，NaCl 5g，CaCl₂ 0.1g，琼脂9g，H₂O 1000ml， 121℃灭菌20min，冷却至50℃，加入Tween80至终浓度体积分数为1％，倒平板。

将培养24h的纯菌种点接于上述平板中，35℃培养7d，有晕圈者为阳性。

图5为本发明提供的枯草芽孢杆菌的Tween80试验现象，如图5所示， Tween80试验为阳性。

(5)甲基红试验

培养基配制：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.2，分装试管，每管装约4-5cm，115℃灭菌20min。

试验方法：挑取菌株接种于上述培养基中，37℃培养4d，加甲基红指示剂1-2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。

图6为本发明提供的枯草芽孢杆菌的甲基红试验现象，左侧为对照组，右侧为实验组，如图6所示，该菌株的甲基红试验为阴性。

(6)V-P试验

试验方法：将菌株接种于上述培养基中，于37℃培养4d后，加入α萘酚的纯酒精溶液0.6ml，再加40％氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2-5min，阳性菌则立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或37℃恒温箱，如2h内仍不显示红色、可判定为阴性。

图7为本发明提供的枯草芽孢杆菌的V-P试验现象，左侧为对照组，右侧为实验组，如图7所示，该菌株为阳性菌株。

(7)触酶实验现象

在菌种的培养液中滴加3％过氧化氢，有大量气泡产生为阳性反应。

图8为本发明提供的枯草芽孢杆菌的触酶试验现象，如图8所示，该菌株的触酶实验为阳性。

将菌株LSB25的主要生理生化试验结果汇总见表1：

表1：菌株LSB25的生理生化结果

【枯草芽孢杆菌LSB25的生物活性性能测定】

1、菌株的排油圈试验

将菌株于LB液体培养基中培养48h(20ml培养基-50ml锥形瓶中)；

5ml液体石蜡(C₂₅H₄₃NO₃轻质，密度：0.84-0.86，上海麦瑞尔)加入到装有15ml蒸馏水的6cm培养皿中，表层形成均匀分散的液体石蜡薄膜；

取1ml该菌株的发酵菌液慢慢滴加到液体石蜡油膜的中心，观察测定排油圈大小。

图9为本发明提供的枯草芽孢杆菌的排油圈试验结果，如图9所示，表明菌株LSB25能产生较大排油圈，直径为3.85cm。

2、菌株的乳化性能试验

取液体石蜡和上述培养48小时后的菌液各5ml于刻度试管内混合，漩涡振荡器震荡3min，混合后静置过夜，观察起泡层高度，计算乳化率。

图10为本发明提供的枯草芽孢杆菌的乳化性能试验结果，如图10所示， LSB25对液体石蜡具有较好的乳化效果，且乳化率为57.14％。

3、表面张力测定

表面张力是由自由表面能引起的沿液面表面作用在单位长度上的力，在数值上同单位表面上的自由表面能相等，单位是毫牛顿每米(mN/m)，具体测试方法包括如下步骤：配置不同菌液浓度的待测试液，并保持待测试液温度恒定，测定时，先用待测试液冲洗测量杯，将待测试液放置在测量杯内并放在仪器的平台上，升起平台至铂金圆环浸入待测试液的中部，再慢慢地放低平台，当铂金圆环刚露出液面时，在圆环与液面之间会形成一液膜，当拉力增大到一定程度时，读数不再变化，液膜破裂，读出此时刻盘上的读数，即为该测试溶液测得的表面张力值。

图11为本发明提供的枯草芽孢杆菌的发酵液的表面张力测试结果，如图 11所示，本发明提供的菌株的发酵液的表面张力可降低至26.65mN/m，表明本发明提供的菌株能够产生表面活性剂。

相同浓度下，已工业化的鼠李糖脂表面活性剂能使水的表面张力从 72mN/m降至30mN/m左右。

4、对原油的乳化性能试验

无机盐培养基中加入2％和8％的原油样品，将菌株在LB液体培养基中培养，随后在含有原油的无机盐培养基中接入5％和10％的LSB25菌液，在 37℃/170rpm培养7d，观察原油变化，以不加菌液的样品作为空白组。

图12为本发明提供的枯草芽孢杆菌的原油乳化性能试验结果，其中，A 为含油量2％时，未添加LSB25菌液的结果，B为含油量为2％时，添加5％的LSB25菌液后的结果，C为含油量8％时，未添加LSB25菌液后的结果， D为含油量8％时，添加10％的LSB25菌液后的结果，如图12所示，未添加 LSB25菌液的空白组(A、C)中油相和水相明显分层，且水相澄清；添加 LSB25菌液的实验组(B、D)中油相被乳化，水相浑浊，除摇瓶挂壁现象无聚集性油滴出现，表明菌株LSB25对原油具有较好的乳化效果。

【枯草芽孢杆菌LSB25的耐盐特性试验】

培养基：100ml水、酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，分别加入氯化钠，氯化钠的含量依次设置为0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、 10％、11％，每组设置3组平行。

取菌株种子液以1％接种量接种于上述培养基中，在37℃、170rpm条件下摇床培养48h，利用紫外分光光度法检测菌液的OD₆₀₀。

图13为本发明提供的枯草芽孢杆菌的耐盐特性试验，如图13所示，当氯化钠的含量为10-11％时，菌液的OD₆₀₀依然大于2.0，表明菌株LSB25具有较强的耐盐特性，且在较高盐含量下对液体石蜡依旧有较高的乳化性能。

将上述不同盐含量下的菌液与液体石蜡混合，测试不同盐含量条件下菌株对液体石蜡的乳化能力，图14不同盐含量条件下枯草芽孢杆菌对液体石蜡的乳化性能试验结果，如图14所示，当盐含量为1-7％时，菌株对液体石蜡的乳化率大于50％，且乳化性能较为稳定，当盐含量达到8％时，菌株对液体石蜡的乳化性能明显降低，可能因为该条件下该菌株生长受到一定限度，同样体积的菌液含菌量太低所致。

【枯草芽孢杆菌LSB25对原油的降解能力】

配制原油含量分别为2％、4％、6％、8％的无机盐培养基，设定菌液接种量为5％，每组设置3组平行，同时以未接种菌的含油无机盐培养基作为对照组。将上述培养基经121℃高温灭菌15min后进行接种工作。

将接菌后的培养基在37℃、170rpm恒温摇床中培养7d后计算原油降解率。图15为本发明提供的枯草芽孢杆菌的原油降解结果，如图15所示，该菌株能在原油含量为8％的条件下正常生长，说明该菌株有较强的耐油性能，原油含量2％-4％时，降解率达17-20％左右。

综上，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.21627的枯草芽孢杆菌，一方面能够产生物表面活性剂，提高菌株与原油的亲和力，提高原油的乳化效果，另一方面能够以原油为唯一碳源生长，且具有较高的耐油性能，达到降解原油的作用，此外，该菌株还具备生长快、易培养、耐盐等特点，能够用于原油污染土壤的微生物修复中，实现高盐砂质土壤原油污染的原位修复。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 中国石油天然气集团有限公司；中国石油集团安全环保技术研究院有限公司；清华大学

<120> 一株能产生表面活性剂且降解原油的枯草芽孢杆菌及应用

<130> CNCNP2201337

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1418

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

gcggctggct ccataaaggt tacctcaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg 60

acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac 120

tagcgattcc agcttcacgc agtcgagttg cagactgcga tccgaactga gaacagattt 180

gtgggattgg cttaacctcg cggttttgct gccctttgtt ctgtccattg tagcacgtgt 240

gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt 300

caccggcagt caccttagag tgcccaactg aatgctggca actaagatca agggttgcgc 360

tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 420

gtcactctgc ccccgaaggg gacgtcctat ctctaggatt gtcagaggat gtcaagacct 480

ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 540

cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg 600

ttagctgcag cactaagggg cggaaacccc ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt 660

ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtta 720

cagaccagag agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct 780

acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca atgaccctcc 840

ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaaggaacc gcctgcgagc cctttacgcc 900

caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960

ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg taccgcccta ttcgaacggt acttgttctt 1020

ccctaacaac agagctttac gatccgaaaa ccttcatcac tcacgcggcg ttgctccgtc 1080

agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1140

tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtt gccttggtga 1200

gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg tagccgaagc 1260

caccttttat gtttgaacca tgcggttcaa acaagcatcc ggtattagcc ccggtttccc 1320

ggagttatcc cagtcttaca ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac 1380

atcagggagc aagctcccat ctgtccgctc gactgcat 1418

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21627。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌单个细胞大小为(0.7-0.8)μm×(2-3)μm，芽孢大小为(0.6-0.9)μm×(1.0-1.5)μm。

3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌。

4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

5.权利要求1-4任一项所述的枯草芽孢杆菌在产生表面活性剂中的应用。

6.权利要求1-4任一项所述的枯草芽孢杆菌在降解原油中的应用。

7.一种降解原油的方法，其特征在于，将权利要求1-4任一项所述的枯草芽孢杆菌加入到原油中进行降解。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌在原油含量不高于8％的无机盐培养基中培养7天后，原油的降解率不低于10％。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的培养条件包括：摇床培养、培养温度为37℃、培养转速为170rpm。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述无机盐培养基中，盐含量不高于8％。