CN110938569B - 用于六价铬污染治理的微生物菌剂、六价铬污染治理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及环境中重金属铬微生物修复技术领域，具体涉及用于六价铬污染治理的微生物菌剂，其有效成分为为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)4‑1或为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)4‑1的发酵液。

Description

用于六价铬污染治理的微生物菌剂、六价铬污染治理方法
技术领域
本发明涉及环境中重金属铬微生物修复技术领域，具体涉及用于六价铬污染治理的微生物菌剂和六价铬污染治理方法。
背景技术
铬是一种广泛应用于冶金、采矿、电镀、印染等行业的有毒重金属。铬及其化合物所引起的环境污染，主要来源于劣质化妆品原料、皮革制剂、金属部件镀铬部分、工业颜料以及鞣革、橡胶和陶瓷原料等。铬废水和铬渣淋滤液是重金属铬的两大污染来源，对土壤、地表水、浅层地下水造成严重影响。研究表明Cr(VI)很容易被人体吸收，引起皮肤粘膜、呼吸、消化、免疫、生殖等系统损伤，水污染严重地区居民，经常接触或过量摄入者，易得鼻炎、结核病、腹泻、支气管炎、皮炎等，具有致癌和诱发基因突变的作用。寻求针对环境中重金属铬的经济有效、无二次污染的处理技术一直是近年来环境工程界甚为关注的热点。
传统的铬污染治理方法有很多，如物理法、吸附法、化学还原法、离子交换、电解法等，但是这些方法存在成本高、操作困难、易产生二次污染等缺点，而且很难处理大流量低浓度的有害污染。相比物理、化学处理方法，生物修复是一种低能耗、高效率和对环境友好的治理方法。近年来，发展了各种生物材料(包括微生物、藻类、植物和农业废弃物)治理铬污染的处理技术。目前铬污染的治理主要集中于微生物治理方面，其中，获得具有高效去除能力的菌株，是生物修复技术应用最为关键的首要条件。
发明内容
本发明的目的是提供用于六价铬污染治理的微生物菌剂和六价铬污染治理方法。
一株可耐受高浓度六价铬的菌株，微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila)4-1，该菌株于2019年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉.武汉大学)，保藏号为：CCTCC M 2019031。该菌株能够在高浓度重金属离子的条件下生长，并能显著吸收环境中的Cr(VI)进入细胞体内，以达到富集铬的目的，同时，该菌的发酵液也具有去除铬离子Cr(VI)的效果，因此，在重金属污染治理领域具有十分重要的应用前景。
本发明还公开一种六价铬污染治理方法，包括向重金属铬污染物中接种微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)4-1的步骤。
本发明还公开一种用于铬污染治理的微生物菌剂，其活性成分为所述的微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)4-1或微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)4-1的发酵液。
所述微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)4-1的发酵液由以下方法制备而成：
1)先将微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)4-1接种在上述LB培养基中，在30℃恒温培养箱中活化24h；
2)挑取步骤1)中活化的单菌落，接种于装瓶量为30mL/100mL的LB培养基中，160r·min-1，30℃恒温振荡培养，得到浓度为4.1×107CFU·mL-1的菌株的细胞培养液；
3)将步骤2)中制备的细胞培养液，在4℃条件下，10000r·min-1离心20min，收集上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，上清液即为无菌发酵液。
本发明所提供的微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)4-1接种铬污染物，该菌能够有效去除环境中游离的铬离子，可耐受Cr(VI)1000mg·L-1，是重金属铬Cr(VI)污染治理的优秀微生物材料。
附图说明
图1为菌株4-1的正常状态下的扫描电镜图；
图2为菌株4-1在Cr(VI)浓度为90mg·L-1条件下培养7d的扫描透射电镜图(TEM)；
图3为菌株4-1在Cr(VI)浓度为90mg·L-1条件下培养7d的能谱分析图(EDS)；
图4为图3选定区域的Cr元素的面扫能谱图；
图5为不同Cr(VI)浓度对菌株4-1性能的影响；
图6为不同柴油浓度对菌株4-1性能的影响；
图7为含不同Cr(VI)浓度的污染土壤对菌株4-1性能的影响；
图8为菌株4-1的16S rDNA的系统发育进化树；
图9为无菌发酵液对含Cr(VI)的水体处理效果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细地说明。需要指出的是，本发明的实施例仅限于对于本发明进行说明，而没有限制作用，本发明中所涉及的其他各种操作，均本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
实施例1菌株4-1的分离鉴定
具体筛选方案如下：
取1g油田污染土壤(2018年9月采集于胜利油田，东营市，中国)土样加入到筛选培养基中，在温度为30℃、转速为160rpm的摇床中振荡培养一周后，接种5％的培养液转接至新鲜的培养基中继续培养，相同条件下连续转接3次。然后取培养液进行梯度稀释，挑取形态不一的菌落，利用筛选培养基进行降解实验。
其中：
筛选培养基：在LB培养基的基础上加30mg·L-1的Cr(VI)。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.5。
经过分离筛选后，得到一株对铬具有稳定抗性能力的菌株4-1，进一步对该菌株鉴定。
实施例2菌株的鉴定
1、形态特征：菌落湿润、光滑，呈淡黄色。
2、生物生化特性
(1)革兰氏染色
A：染剂：
1.结晶紫混合液(甲液：结晶紫2g，95％乙醇20ml；乙液：草酸铵0.8g，蒸馏水80ml。甲液与乙液混合，静止48小时过滤使用)；
2.液碘(碘1g，碘化钾2.0g，蒸馏水300mL，先用3-5mL蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，待溶解后，加水稀释至300mL)；
3.脱色液(95％乙醇70mL)；
4.复染液(0.5％番红水溶液)。
B：染色步骤：
1，用接种针挑取少许菌苔，涂布在干净的玻璃片上的一滴无菌蒸馏水中，风干固定。
2，用结晶紫的混合液染1分钟后，用水洗。
3，碘液作用1分钟，吸干。
4，用95％乙醇或丙酮乙醇溶液脱色，流滴至洗脱液至无色。
5，用番红染液2-3分钟，水洗，风干。
C：用相差显微镜观察结果，红色为格兰氏阴性菌，深紫色为革兰氏阳性菌。
实验结果显示菌4-1为革兰氏阴性菌。
(2)糖醇发酵
A：休和利夫森二氏培养基(Hugh-Leifson Medium)：蛋白胨5g，NaCl 5g，K2HPO40.2g，糖醇(葡萄糖或其它糖、醇)10g，琼脂5～6g，1％溴甲酚紫3mL，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2，分装试管，培养基高度约4-5cm，115℃灭菌20分钟。
B：接种与观察。以幼龄斜面培养物穿刺接种于上述培养基中，适温培养3天后观察，如指示剂变黄，表示产酸，为阳性；不变或变蓝则阴性。
实验结果表明菌4-1的糖醇发酵实验呈阳性。
(3)甲基红试验
A：培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO4 5g，水1000mL，调PH至7.0-7.2。
B：甲基红试剂：甲基红0.1g，95％乙醇300mL，蒸馏水200mL。
C：接种观察：接种菌4-1于以上培养基中，至室温培养3天。在培养液中加入2-3滴甲基红试剂，红色为甲基红试验阳性反应，黄色为阴性反应。
实验结果表明菌4-1为甲基红试验阴性反应。
(4)V-P试验
A：培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO4 5g，水1000mL，调pH至7.0-7.2。
B：肌酸，40％NaOH。
C：接种观察：接种菌4-1于以上培养基中，至室温培养3天。取培养液和40％NaOH等量相混。加少许肌酸，10min如培养液出现红色，即为阳性反应。
实验结果中4-1培养液未出现红色。
(5)明胶液化
A：培养基：蛋白胨5g，明胶100-150g，水1000mL，PH 7.2-7.4，分装试管，培养基高度约4-5cm，115℃蒸汽灭菌20min。
B：接种与观察。取18-24h的斜面培养物穿刺接种并有两只未接种的空白对照。于室温下培养3天。在室温观察生长情况和明胶是否液化。如果菌4-1已生长，明胶表面无凹陷且为稳定的凝块，则为阴性。如明胶部分或者全部在20℃以下为可流动的液体，则为明胶水解为阳性。
实验结果明胶全部在20℃以下为可流动的液体，表明明胶水解为阳性。
(6)细菌运动性试验
配置无机盐培养基，在其中加入0.3％-0.6％的琼脂，配制成半固体培养基，其放倒试管不流动，手上轻轻敲打即破裂。用直针穿刺接种菌4-1于半固体培养基上，适温培养。若生长物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性，如生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示试验菌有运动性。
实验结果呈现出生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，表示菌4-1有运动性。
(7)接触酶实验
A：试剂3％过氧化氢。
B：接种与结果观察：将24h培养的斜面菌4-1，以铂丝接种环取一小环涂抹于有3％过氧化氢的玻片上，如有气泡产生即为阳性，无气泡产生则为阴性。
实验结果表现为有气泡产生，表明菌4-1为阳性。
3、16S rDNA序列分析：
使用TIANGEN(天根生化科技(北京)有限公司)细菌基因组DNA提取试剂盒进行菌株基因组DNA提取，以细菌16S rDNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，对DNA模板进行PCR扩增。进行序列测定，测定序列的分析结果表明16S rDNA扩增片段长度为1012，序列见SED ID NO.1。
通过MEGA7软件构建菌4-1的系统发育树见图8，从图8中可以看出该菌与Stenotrophomonas acidaminiphila strain YFMCD4.4的亲缘最为接近。
经过形态观察、生理生化反应和16S rDNA分子鉴定，确定菌株4-1为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)，命名为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila)4-1。
实施例3：微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)4-1对含六价铬废水中的六价铬的富集能力
用K2Cr2O7配制Cr(VI)浓度为15mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1、120mg·L-1、150mg·L-1、180mg·L-1、200mg·L-1、500mg·L-1、1000mg·L-1，菌株4-1接种量为10％(v/v，菌密度为4.1×107CFU/mL)，摇床转速160rpm于30℃下培养7d，用可见分光光度计于540nm测定吸光度。
具体测定方法如下：培养基以4000r/min离心20min，用移液枪取100μL的上清液于50mL比色管中用水稀释至刻度，加入0.5mL的1+1硫酸溶液，0.5mL的1+1磷酸溶液，以及2mL的显色剂(称取二苯碳酰二肼0.2g溶于50mL丙酮中，加水稀释到100mL)，10min后在540nm处测定吸光度。
图2所示为抗铬菌4-1在Cr(VI)浓度为90mg·L-1条件下培养7d的TEM图，从图中可以看出菌株4-1细胞外部有一层胞外聚合物包裹着，且细胞内部均匀的分散着数个黑色点状物质。图3所示为菌株4-1在Cr(VI)浓度为90mg·L-1条件下培养7d的的能谱分析图(EDS)；图4为图3的选定区域的面扫能谱图，从图4中可明显看出，细胞内部与胞外聚合物都检测到铬，说明该菌株对铬具有富集作用。
菌株4-1在Cr(VI)浓度为15mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1、120mg·L-1、150mg·L-1、180mg·L-1、200mg·L-1、500mg·L-1、1000mg·L-1条件下，7d的去除Cr(VI)情况见图5。菌株4-1对15mg·L-1去除率高达75.7％，可耐受高达1000mg·L-1的Cr(VI)。
实施例4：在柴油中的应用
准确称量实验所用柴油0.1g、0.3g、0.5g、0.7g、1.0g、1.5g分别加入到30mL的LB培养基中，所得柴油浓度为3.33g·L-1、10g·L-1、16.67g·L-1、23.33g·L-1、33.33g·L-1、50g·L-1，菌株4-1接种量为10％(v/v，菌密度为4.1×107CFU·mL-1)，摇床转速160rpm于30℃下培养7d，用可见分光光度计于540nm测定吸光度。具体的测定方法如实施例3所述。
菌株4-1在柴油浓度为3.33g·L-1、10g·L-1、16.67g·L-1、23.33g·L-1、33.33g·L-1、50g·L-1降解情况见图6，对3.33g·L-1的柴油降解率可达68.47％。
实施例5：六价铬污染的土壤处理
配制铬污染土壤，控制土样中六价铬离子浓度分别为0.2mg·g-1、0.3mg·g-1、0.7mg·g-1、1.0mg·g-1、3.0mg·g-1、10.0mg·g-1、15.0mg·g-1，搅拌均匀后放入干燥箱中(75℃)烘干，使Cr(VI)被土壤充分吸附。然后，接种菌株4-1的菌液量为2.5mL(菌密度为4.1×107CFU·mL-1)，对照组不加菌液，搅拌均匀后放入培养箱中(30℃)培养，培养期间定期补水，控制土壤含水量为15％～20％。培养7d后取出，称取0.1000g土样于100mL小烧杯中，在烧杯中加入5mL提取液(0.4mol·L-1KCl)，用电磁搅拌器搅拌5min后将土壤悬液转移到离心管中，以4000r·min-1离心20min，上清液倒入100mL容量瓶中，残渣加入去离子水2mL，用玻璃棒搅拌2min，再离心5min，倒出上清液，重复洗涤一次，合并上清液，定容，将定容后的溶液移于50mL比色管中，依据实际情况稀释一定倍数后加入0.5mL 1+1硫酸溶液、0.5mL 1+1磷酸溶液、2mL显色剂，摇匀后静置5分钟，在波长540nm处，以零浓度溶液做参比，测定吸光度。
菌株4-1在Cr(VI)浓度为0.2mg·g-1、0.3mg·g-1、0.7mg·g-1、1.0mg·g-1、3.0mg·g-1、10.0mg·g-1、15.0mg·g-1条件下，7d的处理情况见图7。菌株4-1对1mg·g-1去除率高达45.8％。
实施例6：菌种的活化及培养
1)培养基的制备：
LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.5；
2)菌株的活化：先将微嗜酸寡养单胞菌4-1接种在上述LB培养基中，于30℃恒温培养箱中活化24h；
3)菌株的液体培养：挑取步骤2)中活化的微嗜酸寡养单胞菌菌株的单菌落，接种于装瓶量为30mL/100mL的LB培养基中，160r·min-1，30℃恒温振荡培养24h，得到浓度为4.1×107CFU·mL-1的菌株的细胞培养液；
4)制剂的制备：将步骤3)中制备的细胞培养液，在4℃条件下，10000r·min-1离心20min，收集上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，上清液即为无菌发酵滤液；
上述方法制备的无菌发酵滤液在实际污染水体进行降解测试，分别制作6个样本，各个样本中发酵滤液含量(V/V)分别为5％，10％，20％，30％，40％，50％，各个样本中Cr(VI)浓度处理前均为15mg·L-1，处理7d，7d的处理效果如图9所示，由图9可以看出，发酵滤液用量(V/V)50％时，7d的去除率达到53.78％，效果优异。
序列表
<110> 山东科技大学
<120> 用于六价铬污染治理的微生物菌剂、六价铬污染治理方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1012
<212> DNA
<213> 16S rDNA
<400> 1
ggggatgcgg taggctacac atgcaagtcg aacggcagca cagtaagagc ttgctcttac 60
gggtggcgag tggcggacgg gtgaggaatg catcggaatc tactctgtcg tgggggataa 120
cgtagggaaa cttacgctaa taccgcatac gacctacggg tgaaagcagg ggatcttcgg 180
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tcgtgccagc agccgcggta atacgaaggg tgcaagcgtt actcggaatt actgggcgta 540
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gcgatggaaa ctgggcgact agagtgtggc agagggtagt ggaattcctg gtgtagcagt 660
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taagttcgcc gcctggggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtgggagt atgtggttta attcgatgca cgcgaagacc ttacctggcc 960
ttgacatgca cggactttcc agagatggat tggtgccttc ggaaccgtga cc 1012

Claims (2)

1.用于六价铬污染治理的微生物菌剂，其特征在于，有效成分为为微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）4-1；
所述微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）4-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC M 2019031。
2.一种六价铬污染治理方法，其特征在于，包括向铬污染物中接种微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）4-1的步骤和/或向铬污染物中使用微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）4-1的发酵液的步骤；
所述微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）4-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC M 2019031；
所述微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）4-1的发酵液由以下方法制备而成：
1）先将微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）4-1接种在LB 培养基中，在30℃恒温培养箱中活化24h；
2)挑取步骤1）中活化的单菌落，接种于装瓶量为30mL/100mL的LB培养基中，160r·min-1，30℃恒温振荡培养，得到浓度为 4.1×107 CFU·mL-1 的菌株的细胞培养液；
3)将步骤 2)中制备的细胞培养液，在4℃条件下，10000r·min-1 离心20min，收集上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，上清液即为无菌发酵液；
向铬污染物中接种微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）4-1的步骤中所使用的微嗜酸寡养单胞菌4-1的菌密度为4.1×107 CFU·mL-1。
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