CN112358880A - 一种微生物-纳米材料复合菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物复合材料领域，公开了一种微生物‑纳米材料复合菌剂及其制备方法与应用。将铁基纳米材料和镁基纳米材料与微生物进行化学耦合，开发新一代纳米材料@微生物复合材料。在纳米材料强化下微生物可以实现对重金属污染土壤的快速吸附固定，同时纳米矿物材料可以作为本源微生物活化剂、营养缓释剂、还原性物质微循环再生载体与重金属吸附固定剂。活化后的微生物‑纳米材料复合菌剂可以作为重金属土壤淋洗剂，将纳米材料@微生物复合材料添加到重金属污染土壤进行淋洗后，微生物和纳米材料相结合进行土壤淋洗修复有效解决了传统生物修复技术效率低、普适性弱的问题和纳米材料修复技术成本高等问题。

Description

一种微生物-纳米材料复合菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于微生物复合材料领域，具体涉及一种微生物-纳米材料复合菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
重金属土壤修复技术主要有物理修复法、化学修复法和生物修复法，这些方法都有其优缺点。其中物理修复法主要是利用物理学原理，通过客土换土法、电动修复法等工程措施去除土壤中的重金属。化学修复法主要是向铬污染土壤中添加化学药剂处理土壤中的重金属，主要包括化学还原固定法、化学淋洗法等，前者降低重金属在土壤中的迁移能力，从而使重金属稳定在土壤中，后者将重金属从土壤中淋洗出来再处理。其优点是成本较低而且可以快速处理污染物，缺点是容易造成二次污染和破坏土壤理化性质，如淋洗剂会导致土壤酸化。生物修复法主要是利用生物对土壤中的重金属进行提取或固定。生物修复法是一种成本效益高且可持续、环境友好型的修复方法，其作为一种有发展前景的修复的方法，受到越来越多人的关注。
专利CN111589856A涉及重金属污染土壤的微生物修复技术领域，通过在污染土壤种植万寿菊幼苗，利用植物根系为微生物提供营养物质以供微生物进行正常的生理活动，该修复技术具有的环境友好、成本低、能完成微生物大规模培养的优点，但该技术微生物培养和实际修复时间较长，需要几个月时间，同时以植物根系为微生物提供营养物质的供能模式限制了微生物在土壤中的活动，容易造成土壤重金属处理效率低，该技术只适用于重金属污染农田土壤修复。专利CN111408621A涉及环境中镉污染土壤的微生物修复技术领域，利用洋葱伯克氏菌制剂与皮氏罗尔斯通氏菌制剂两种微生物菌剂与东南景天协同处理污染土壤，该修复技术具有经济效益高、环境友好、可以实现边种植边修复的优点，但该技术实际修复时间较长，需要几个月时间甚至数年的时间，该技术只适用于重金属污染农田土壤修复。专利CN110938569A涉及环境中重金属铬微生物修复技术领域，具体涉及用于六价铬污染治理的微生物菌剂，其有效成分为微嗜酸寡养单胞菌4-1和/或微嗜酸寡养单胞菌4-1的发酵液，该菌剂具有制备简单、成本低、可以在1000mg/L的高浓度六价铬溶液中发挥作用等优点，但该菌剂在实际应用过程微生物大规模培养的活性和质量仍较难保证。
目前，在应用生物修复技术处理重金属污染的土壤方面仍然存在一些问题，如修复过程中容易造成微生物损失，微生物大规模培养的活性和质量难以保证，微生物处理重金属效率低下等。需要寻找一种重金属污染土壤处理效率相对较高及微生物稳定性好以及安全性的微生物菌剂。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种微生物-纳米材料复合菌剂的制备方法。通过利用有机改性纳米矿物材料作为本源微生物活化剂、营养缓释剂、还原性物质微循环再生载体与重金属吸附固定剂来实现上述目的。
本发明再一目的在于提供一种微生物-纳米材料复合菌剂。该菌剂可以实现微生物菌剂快速吸附固定重金属，通过生物淋洗的方法将含重金属的菌剂从土壤中淋洗出来。
本发明另一目的在于提供微生物-纳米材料复合菌剂作为生物淋洗剂应用于重金属污染土壤淋洗。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种微生物-纳米材料复合菌剂制备方法，包括如下制备步骤：
利用污染场地本源微生物培养微生物菌株；
利用铁基和/或镁基纳米材料作为微生物营养物质和重金属吸附固定材料；
通过微生物菌株与铁基和/或镁基纳米材料耦合，制备微生物-纳米材料复合菌剂。
进一步地，所述的微生物属于芽孢杆菌属。
更进一步地，所述的微生物属于芽孢杆菌属中各方面性能较佳的蜡状芽孢杆菌。
进一步地，所述的铁基纳米材料为纳米零价铁和硫化亚铁纳米颗粒中的一种或两种，所述镁基材料包括为氢氧化镁纳米材料。
进一步地，所述的微生物菌株与铁基和/或镁基纳米材料耦合，通过如下方法实现：称取适量上述的铁基纳米材料和/或上述的镁基纳米材料溶于无菌水中，制备得到铁基纳米材料溶液和/或镁基纳米材料溶液，构建成具有铁源和/或镁源的微生物培养液，再加入微生物菌株，在微生物生长的同时形成纳米材料，所述纳米材料沉积在微生物体内或表面，自发的形成微生物-纳米材料协同体系。
更进一步地，所述铁基纳米材料溶液的浓度为1～10g/L；所述镁基纳米材料溶液的浓度为0.5～5g/L；所述微生物菌株在微生物培养液中的浓度为0.4～4g/L。
进一步地，所述的纳米零价铁，其通过如下方法制备得到：称取七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶于无氧水中，制备得到0.005～0.05mol/L的硫酸亚铁溶液，接着加入适量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，使质量比PVP：FeSO4·7H2O＝(5～10)：1，搅拌后得到溶液A；称取适量硼氢化钠(NaBH4)溶于无氧水中，得到0.015～0.15mol/L的硼氢化钠溶液B；在不断搅拌下，将溶液B加入到等体积的溶液A中，混合溶液变为黑色时停止搅拌，用磁选法选出，分别用无氧水和丙酮依次洗涤和干燥，得到目标产物纳米零价铁。
进一步地，所述硫化亚铁纳米颗粒，其通过如下方法制备得到：在氮气保护氛围下，称取硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶于无氧水中，得到0.3982～3.982g/L硫酸亚铁溶液A，称取适量硫化钠(Na2S·9H2O)溶于无氧水中，得到4.08～40.8g/L的硫化钠溶液B，按照溶液A和溶液B体积比A：B＝(10～15):1，将溶液B加入溶液A中，搅拌得到100～1000mg/L纳米硫化亚铁悬浊液，经过60～80℃的真空干燥处理后，得到目标产物硫化亚铁纳米颗粒。
进一步地，所述的氢氧化镁纳米材料，其通过如下方法制备得到：称取氢氧化钠(NaOH)溶于无氧水中，制备得到0.5～2.0mol/L的硫酸亚铁溶液，并按照0.5～2.0g/L的投加量加入对硝基偶氮间苯二酚(NPR)，得到溶液A。称取适量硫酸镁(MgSO4)溶于无氧水中，制备得到0.1～0.5mol/L的硫酸镁溶液，作为溶液B。然后将溶液A和溶液B按体积比A：B＝1:(1～4)混合，搅拌均匀，在70～90℃水浴反应12～20h，经过转速为4000～5000r/min的离心处理3～5min，使反应产物离心分离，用无氧水洗涤和干燥，得到目标产物氢氧化镁纳米材料。
上述的微生物-纳米材料复合菌剂作为生物淋洗剂应用于重金属污染土壤淋洗。
进一步地，所述的重金属包括铅、镉、铬、铜、锌、镍、汞、砷中的至少一种。
本发明的原理为：利用细菌在对抗恶劣环境时产生芽孢，并在环境适宜生长时重新生长的生理特征，将细菌从营养液中分离出来并干燥处理后制备成芽孢菌剂，在使用前需要一段时间活化细菌。再利用有机改性纳米矿物材料作为细菌活化剂，同时纳米材料可以作为细菌的营养缓释剂供细菌完成正常的生理活动，该菌剂可以实现微生物快速吸附固定重金属，通过生物淋洗的方法将含重金属的菌剂从土壤中淋洗出来。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)目前的研究现状中，纳米材料@微生物是一类新兴的生物复合材料，它既具有微生物的生物活性，同时经过纳米材料的修饰是这一类材料也具有纳米材料的特性。现有的技术中，对于其光响应或者是其本身的特性研究较多，但本发明将首次制备以铁基或者镁基纳米材料和微生物耦合的生物复合材料并将其应用于重金属污染土壤修复。
(2)微生物修复成本低，但效率慢，结合纳米材料能加快微生物的修复效率，推动微生物的实际应用。
(3)淋洗修复后，重金属能从土壤固相转移都淋洗菌剂的液相中，同时纳米材料可以滞留在土壤中进一步与土壤中的重金属进行反应，可以提高重金属的淋出效率，处理过程不易产生二次污染。
(4)铁基、镁基纳米材料由于其低毒性和较低的成本，是一种环境友好型材料，本发明的制备方法简单高效、操作可行、原料来源广、成本较低。
附图说明
图1为实施例3中微生物-纳米材料菌剂处理重金属污染土壤淋洗效率图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。蜡状芽孢杆菌的保藏号：KR052008。
实施例1
(1)配置培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠，不同浓度梯度的重金属溶液，溶于1L去离子水，搅拌均匀，形成稳定的澄清溶液。
(2)细菌筛选：取某重金属污染场地土样，接种于新鲜配置的并且已经进行灭菌处理的液体培养基中，在35℃的温度和200r/min的转速下培养，一段时间后获得可培养的重金属耐受细菌。
(3)细菌纯化：将得到的重金属耐受细菌菌液充分稀释后，均匀涂抹在相同配方的固体培养基中，隔水恒温培养一段时间后，得到数个不同的菌落。将固体培养基中的菌落挑回液体培养基中进行培养，至此完成第一次细菌纯化的循环。如此循环，最终得到微生物菌株。
(4)称取0.1390g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶解于50mL无氧水中，接着加入1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，搅拌10分钟，得到溶液A；称取0.0568g硼氢化钠(NaBH4)溶于50mL无氧水中，得到溶液B。在不断搅拌下，将B溶液迅速加入到A溶液中，混合溶液变为黑色时停止搅拌，用磁选法选出，得到目标产物纳米零价铁前驱液。
(5)称取0.4g氢氧化钠(NaOH)溶于10.0mL无氧水中，并加入10.0mg对硝基偶氮间苯二酚(NPR)，得到溶液A。称取0.6g硫酸镁(MgSO4)溶于25mL无氧水中得到溶液B。然后将A溶液和B溶液混合，搅拌均匀，转移到具塞锥形瓶中，80℃水浴反应16h，得到氢氧化镁纳米材料前驱液。
(6)纳米材料@微生物制备：量取上述铁基纳米材料前驱液400mL和镁基纳米材料前驱液100mL，混合制备成铁基/镁基纳米材料前驱液，然后将1g菌株加入到前驱液，35℃下培养48h，制备得到微生物菌剂。
实施例2
(1)配置培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠，不同浓度梯度的重金属溶液，溶于1L去离子水，搅拌均匀，形成稳定的澄清溶液。
(2)细菌筛选：取某重金属污染场地土样，接种于新鲜配置的并且已经进行灭菌处理的液体培养基中，在35℃的温度转速下培养，一段时间后获得可培养的重金属耐受细菌。
(3)细菌纯化：将已经得到的重金属耐受细菌菌液充分稀释后，均匀涂抹在相同配方的固体培养基中，隔水恒温培养一段时间后，得到数个不同的菌落。将固体培养基中的菌落挑回液体培养基中进行培养，至此完成第一次细菌纯化的循环。如此循环，最终得到微生物菌株。
(4)在氮气保护氛围下，将0.2390g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶于120mL无氧水中，得到硫酸亚铁溶液A，0.2040g硫化钠(Na2S·9H2O)溶于10mL无氧水中，得到硫化钠溶液B，将溶液B缓慢滴加入溶液A中，搅拌10分钟得到500mg/L纳米硫化亚铁纳米材料前驱液。
(5)称取0.4g氢氧化钠(NaOH)溶于10.0mL无氧水中，并加入10.0mg对硝基偶氮间苯二酚(NPR)，得到溶液A。称取0.6g硫酸镁(MgSO4)溶于25mL无氧水中得到溶液B。然后将A溶液和B溶液混合，搅拌均匀，转移到具塞锥形瓶中，80℃水浴反应16h，得到氢氧化镁纳米材料前驱液。
(6)纳米材料@微生物制备：量取上述铁基纳米材料前驱液400mL和镁基纳米材料前驱液100mL，混合制备成铁基/镁基纳米材料前驱液，35℃下培养48h，制备得到微生物菌剂。
实施例3
(1)取某重金属污染场地土样，自然风干后研磨过20目筛，分装在250mL的锥形瓶中，121℃下灭菌30min，共3次，每次间隔2h，灭菌后备用。
(2)将实施例1中的微生物菌剂在PDA斜面中培养5d活化后，用无菌水20mL及吐温20(0.05％)冲洗，收集新鲜孢子悬浮液(待用生物淋洗剂)，稀释成107个/mL后待用。
(3)选择合适的菌剂淋洗剂和某铬污染场地土壤，按不同菌剂淋洗剂配比(菌株：纳米材料＝1.0g：0.5g、1.0g：1.0g、1.0g：2.0g)、不同土壤/淋洗剂的固液比例(如m：V＝10.0g：50mL、10.0g：100mL、10.0g：150mL)分别加入250mL三角瓶中，在30℃下，180r·min-1(模拟淋洗环境)下培养1d，检测淋洗后土壤铬浓度，计算重金属去除率。
结果表明，菌株：纳米材料的配比为1:1和1:2时均有较高的重金属去除率，随着土壤/淋洗剂固液比例越高，重金属去除率有所提高，综合考虑实际成本，可选择土壤/淋洗剂固液比例为1:5。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微生物-纳米材料复合菌剂制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：
利用污染场地本源微生物培养微生物菌株；
利用铁基和/或镁基纳米材料作为微生物营养物质和重金属吸附固定材料；
通过微生物菌株与铁基和/或镁基纳米材料耦合，制备微生物-纳米材料复合菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种微生物-纳米材料复合菌剂制备方法，其特征在于：所述的微生物菌株与铁基和/或镁基纳米材料耦合，通过如下方法实现：
称取适量上述的铁基纳米材料和/或上述的镁基纳米材料溶于无菌水中，制备得到铁基纳米材料溶液和/或镁基纳米材料溶液，构建成具有铁源和/或镁源的微生物培养液，再加入微生物菌株，在微生物生长的同时形成纳米材料，所述纳米材料沉积在微生物体内或表面，自发的形成微生物-纳米材料协同体系。
3.根据权利要求2所述的一种微生物-纳米材料复合菌剂制备方法，其特征在于：所述铁基纳米材料溶液的浓度为1～10g/L；所述镁基纳米材料溶液的浓度为0.5～5g/L；所述微生物菌株在微生物培养液中的浓度为0.4～4g/L。
4.根据权利要求1所述的一种微生物-纳米材料复合菌剂制备方法，其特征在于：所述的微生物属于芽孢杆菌属。
5.根据权利要求1所述的一种微生物-纳米材料复合菌剂制备方法，其特征在于：铁基纳米材料为纳米零价铁和硫化亚铁纳米颗粒中的一种或两种，所述镁基材料包括为氢氧化镁纳米材料。
6.根据权利要求5所述的一种微生物-纳米材料复合菌剂制备方法，其特征在于，所述的纳米零价铁，其通过如下方法制备得到：
称取七水合硫酸亚铁溶于无氧水中，制备得到0.005～0.05mol/L的硫酸亚铁溶液，接着加入适量聚乙烯吡咯烷酮，使质量比PVP：FeSO4·7H2O＝(5～10)：1，搅拌得到溶液A；称取硼氢化钠溶于无氧水中，得到0.015～0.15mol/L的硼氢化钠溶液B；在不断搅拌下，将溶液B入到等体积的溶液A中，待混合溶液变为黑色时停止搅拌，用磁选法选出，分别用无氧水和丙酮依次洗涤和干燥，得到目标产物纳米零价铁。
7.根据权利要求5所述的一种微生物-纳米材料复合菌剂制备方法，其特征在于，所述的硫化亚铁纳米颗粒，其通过如下方法制备得到：
在氮气保护氛围下，称取硫酸亚铁溶于无氧水中，得到0.3982～3.982g/L硫酸亚铁溶液A，称取硫化钠溶于无氧水中，得到4.08～40.8g/L的硫化钠溶液B，按照溶液A和溶液B体积比(10～15):1，将溶液B加入溶液A中，搅拌得到100～1000mg/L纳米硫化亚铁悬浊液，经过60～80℃的真空干燥处理后，得到目标产物硫化亚铁纳米颗粒。
8.根据权利要求5所述的一种微生物-纳米材料复合菌剂制备方法，其特征在于，所述的氢氧化镁纳米材料，其通过如下方法制备得到：
称取氢氧化钠溶于无氧水中，制备得到0.5～2.0mol/L的氢氧化钠溶液，并按照0.5～2.0g/L的投加量加入对硝基偶氮间苯二酚，得到溶液A；称取硫酸镁溶于无氧水中，制备得到0.1～0.5mol/L的硫酸镁溶液，作为溶液B；然后将溶液A和溶液B按体积比1:(1～4)混合，搅拌均匀，在70～90℃水浴反应12～20h，经过转速为4000～5000r/min的离心处理3～5min，使反应产物离心分离，用无氧水洗涤和干燥，得到目标产物氢氧化镁纳米材料。
9.权利要求1～8任一项所述方法制备得到微生物-纳米材料复合菌剂。
10.根据权利要求9所述的一种微生物-纳米材料复合菌剂作为一种生物淋洗剂应用于重金属污染土壤淋洗。
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