CN115725438A

CN115725438A - 一株六价铬还原菌及其应用

Info

Publication number: CN115725438A
Application number: CN202210885326.1A
Authority: CN
Inventors: 刘元望; 金国敏; 韩斌; 冯敏敏; 张彩文; 张亚磊; 李焕斋
Original assignee: Yanshan University
Current assignee: Yanshan University
Priority date: 2022-07-26
Filing date: 2022-07-26
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明公开了一株六价铬还原菌及其应用，属于生物技术领域。该六价铬还原菌为假单胞菌(Pseudomonas chengduensis)JGM2，其保藏号为CGMCC No.25221，可应用于还原六价铬来治理铬污染，其方法是将该六价铬还原菌株接种到含有六价铬的体系中培养，实现六价铬的还原。通过培养本发明的六价铬还原菌株，可以处理水土环境中的六价铬的污染，减少六价铬对环境、人类及动植物产生的危害。

Description

一株六价铬还原菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株六价铬还原菌及其应用。

背景技术

重金属铬是重要的工业原料，在皮革工业、纺织、电镀和染料等领域有着广阔的应用，有着极大的经济价值，但其毒性巨大，容易造成环境污染。我国是世界上最大的铬盐生产国之一，铬盐生产厂产生的铬渣如果不合理堆放和填埋，将会使其中包含的可溶性六价铬(Cr (VI))离子溶于雨水中，进而转移到水体和土壤环境中引起污染；此外，电镀、染料、鞣制皮革、纺织等行业的废水不正当排放都会导致铬进入到环境中；还有农药、冶金等生产过程中形成的废气以及各种尺寸的颗粒物排放处理不当，也可能会引起铬污染。据统计，我国农用田地的铬污染浓度较高，有些地区可以高达820mg/kg，严重超标。由于环境中物质在各圈层之间不断循环和流动，导致重金属铬经过一系列作用，在环境中逐渐积累，使环境中的铬含量不断升高，甚至远远高于其本底值，致使环境质量的恶化，产生污染。

相比于Cr(III)，具有较强的氧化性和迁移性的Cr(VI)毒性更强，可以达到Cr(III)的100倍以上，这种程度的毒性对人体细胞有严重致癌性，会被人体吸收并富集于体内，对人体细胞的正常功能有严重破坏性以及致突变性。Cr(VI)对植物的产生的危害也不容小觑，与毒害重金属类似，主要会在根部集中，从而抑制根系吸收营养的过程，并影响营养从根部向上运输，使植物无法进行正常的代谢，表现为植株难以生长较高，发育受到阻碍等。Cr(VI)的危害如此之大，值得我们对其进行更大的关注。

为了解决Cr(VI)污染问题，如何去除环境体系中残留的Cr(VI) 已经成了近年来研究的热点。目前，对含有Cr(VI)的理化处理方法进行了大量的研究和实践，目前的物理和化学法虽然能够有效的去除环境中的Cr(VI)，但通常操作环境要求高、成本高，还可能破坏土壤结构、造成二次污染，相对而言难于控制，具有一定局限性。相比于这两种方法，微生物还原法能够对被污染的环境中Cr(VI) 进行原位、异位或原/异位联合修复，同时这种方式成本较低而且效率高，相对环境友好，符合可持续发展的要求。然而，目前市面上 Cr(VI)还原菌剂较少，还原能力较低，可选择性有限。

发明内容

为了能够提弥补现有技术的不足，提供一种好氧条件下具有高效 Cr(VI)还原能力的菌株以及该菌株还原Cr(VI)的优化条件。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一株铬六价还原菌(Pseudomonas chengduensis) JGM2，其保藏号为CGMCC No.25221，其属于成都假单胞菌，已于 2022年07月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明还提供了该六价铬还原菌在将六价铬还原成三价铬方面的应用。以降低环境中铬元素的毒性。

优选的，包括如下步骤：将六价铬还原菌接种到含有六价铬的环境中，实现对六价铬的还原。

优选的，其接种条件为：六价铬的浓度为50～200mg/L，六价铬还原菌的接种量为1～8％，pH为5～10。

优选的，其接种条件为：六价铬的浓度为50mg/L，六价铬还原菌的接种量为8％，pH为8。

优选的，在接种到含六价铬的体系中之前，还包括对该六价铬还原菌株的预培养，将该六价铬还原菌株接种到营养肉汤培养基中培养 24h左右。

优选的，六价铬还原菌对六价铬的还原率达到90％。

本发明还提供了一种铬还原剂，包括六价铬还原菌。

本发明还提供了一种预防铬污染的试剂，包括六价铬还原菌。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明所筛选得到的六价铬还原菌JGM2对六价铬的还原率能达到90％；可对其进行专门培养，并将该六价铬还原菌株JGM2接种到含有六价铬的体系中，以有效、快速、高效地还原其中的六价铬。因而，可将其应用到被六价铬污染的土壤、含铬电镀废水等环境中，减轻六价铬对自然环境、动植物及人类健康造成的严重危害。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理，其中：

图1为本发明初筛得到的4株六价铬还原菌对六价铬Cr(VI) 的还原效果图，其中，横坐标1～4分别代表JGM1-JGM4；

图2为接种量对六价铬还原菌株JGM2还原Cr(VI)的影响；

图3为初始Cr(VI)浓度对六价铬还原菌株JGM2还原Cr(VI) 的影响；

图4为pH对本发明提供的六价铬还原菌株JGM2还原Cr(VI) 的影响；

图5为六价铬还原菌株JGM2的菌落形态；

图6为六价铬还原菌JGM2的革兰氏染色结果；

图7为六价铬还原菌株JGM2的系统发育树。

具体实施方式

下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同结构。为了简化本发明的公开，下文中对特定例子的部件和设置进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施方式和 /或设置之间的关系。

实施例用的试剂和材料：

表1主要试剂一览表

六价铬还原菌株的筛选材料：秦皇岛污水处理厂活性污泥。

实验例

一、六价铬还原菌的筛选

(1)菌源活化富集：取10g活性污泥样品于锥形瓶中，加入一定量的葡萄糖，摇匀，另取10g活性污泥样品于锥形瓶中，不加葡萄糖。将两组污水样品放入恒温振荡器中培养，设置恒温振荡器的温度为35℃、转速为150r/min。静置一段时间，取上清液供后续实验使用。

(2)六价铬还原菌株的分离和纯化：在超净工作台，向已灭菌的试管中加入9mL无菌水，分别取两组处理好的污水样品各1mL 加入试管中，混匀后从高浓度的试管中用移液枪移取1mL梯度稀释，之后借助移液枪分别移取100μL的稀释倍数为10^-1、10^-3、10^-5、10^-7、10^-8、10^-9稀释液到灭菌后的固体培养基上。之后将经过稀释的菌液通过涂布器在平板上涂布均匀，并将该平板倒置于35℃恒温培养箱中，进行一定时间的恒温培养，直到平板表面出现单菌落。后续在无菌条件下，将单菌落置于固体培养基进行画线分离的步骤使其纯化，具体就是每株菌画三个平板，将平板倒置于35℃恒温培养箱，该过程直至固体培养基上出现形态特征一致的单菌落，最终得到4株六价铬还原菌，分别将它们命名为：JGM1、JGM2、JGM3、JGM4。此后便可将单菌落进行划线，接种到斜面培养基上，放入冰箱中进行冷藏保存。

(3)六价铬还原菌株的筛选：在超净工作台，将固体平板上的不同菌落用接种环挑出，在NB培养基中进行富集培养24h后，将其接种在含有100mg/L Cr(VI)的NB培养基中，接种量为1％，培养 2d和4d，分别取样检测培养基中的剩余Cr(VI)浓度，计算还原率。结果如图1所示，随着时间的延长，六价铬还原菌株对Cr(VI) 的还原率有所上升。通过比较不同六价铬还原菌株的Cr(VI)还原率发现，四株六价铬还原菌的还原能力大小为：JGM2>JGM1>JGM4>JGM3。其中六价铬还原菌株JGM2还原能力最强，在第4d 还原率达到了30％以上，故将JGM2作为六价铬还原菌，用于后续优化实验。

二、菌株还原条件优化研究

采用控制变量法研究接种量、初始Cr(VI)浓度、pH对六价铬还原菌株生长和还原性能的影响，从而对该菌株的还原条件进行优化，以提高菌株的还原能力。

(1)接种量对JGM2菌种生长和还原的影响

选用NB培养基，调节pH为7.0，将JGM2菌悬液分别按1％、2％、3％、4％、5％、8％的接种量接种到NB培养基中，调Cr(VI) 浓度为50mg/L，锥形瓶中液体量为100mL。放入温度为35℃、转速为150r/min的恒温振荡器中培养，分别在培养1d、3d、5d、7d 后取样测定剩余Cr(VI)含量和细胞在OD600下的吸光度，计算其还原率，探究接种量对JGM2菌株生长和还原效果的的影响；做三组平行实验。

如图2所示，JGM2菌株还原Cr(VI)的效率随着接种量的增加呈上升趋势。接种量为1％时，7d后，还原率在60％以上，可能是由于接种量较小，导致培养基内菌株的总体生物量较少，对Cr(VI) 的还原效果不如接种量更高的组；随着接种量的增加，还原率呈上升趋势但差别不大，接种量为8％时还原率最高。这可能是因为Cr(VI) 对该菌株JGM2有毒害作用，当接种量增加时，就有更多的微生物对 Cr(VI)进行还原，同时，随着接种量的增加，JGM2菌体本身能够产生应对不良环境的机制，克服体系中的不利因子但是在特定的培养体系中，因为营养物质有限，细菌不能一直增殖，会随着营养物质的缺少和代谢产物的积累达到饱和，对Cr(VI)的还原效果不再有明显变动。因此，在使用微生物还原Cr(VI)时，合适的接种量对JGM2 菌株的生长和对Cr(VI)的还原至关重要，适宜的接种量为8％。但考虑到节约成本、提高操作效率等方面，将1％的接种量作为本实验的接种量。

(2)初始Cr(VI)浓度对JGM2菌种生长和还原的影响

选用NB培养基，调节pH为7.0，将JGM2菌悬液分别按1％的接种量接种到含Cr(VI)浓度分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、 400mg/L、800mg/L、1600mg/L的NB培养基中，锥形瓶中液体量为100mL。放入温度为35℃、转速为150r/min的恒温振荡器中培养，分别在培养1d、3d、5d、7d后取样测定剩余Cr(VI)含量和细胞在OD600下的吸光度，计算其还原率，探究接种量对JGM2菌株生长和还原效果的的影响；做三组平行实验。

如图3所示，不同初始Cr(VI)浓度对JGM2菌株还原Cr(VI) 的效率差异较大，总的来说，初始Cr(VI)浓度越高，还原率越低。在初始Cr(VI)浓度较低时，JGM2菌株对Cr(VI)可以保持60％以上的还原率，在初始Cr(VI)浓度为50mg/L时，还原率最高，故将50mg/L作为后续实验的初始Cr(VI)浓度。当Cr(VI)浓度提高至200mg/L时，还原率降至低浓度Cr(VI)还原率的一半，当浓度大于400mg/L时，还原率在10％左右，说明可能高浓度的Cr (VI)对菌株产生了毒害作用，使其细胞内蛋白质变性，酶活性降低，抑制了JGM2菌株正常的生长，最终导致其对Cr(VI)的还原率明显降低。在初始Cr(VI)为800mg/L时，JGM2菌株对Cr(VI)仍然具有较低的还原率，在初始Cr(VI)为1600mg/L时，在第7d时， JGM2菌株对Cr(VI)的还原率在5％左右，几乎没有效果。这说明了环境中的Cr(VI)浓度大小对JGM2菌株的还原效果有着显著的影响，适宜的初始Cr(VI)浓度为50mg/L。

(3)pH浓度对六价铬还原菌种生长和还原的影响

选用NB培养基，调节pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，将JGM2菌悬液接种到NB培养基中，接种量为1％，调Cr(VI) 为100mg/L，锥形瓶中液体量为100mL。放入温度为35℃、转速为150r/min的恒温振荡器中培养，分别在培养1d、2d、3d、4d、5 d、6d、7d后取样测定剩余Cr(VI)含量和JGM2菌液的OD600值，计算其还原率，探究pH对JGM2菌株生长和还原效果的的影响；做三组平行实验。

如图4所示，不同pH值对JGM2菌株还原Cr(VI)的效率具有较大差异。当pH为4时，7d内，Cr(VI)的还原率不足20％，并且随着时间的延长，还原率趋于稳定，说明此条件下的JGM2菌株生长受限以及对Cr(VI)的还原能力较弱，可能的原因有两个方面，一方面可能是酸性条件本身影响JGM2菌株的生长进而影响对Cr(VI) 的还原；从另一方面来考虑，也可能是酸性条件会提高Cr(VI)的氧化性，这会使导致其对JGM2菌株的毒害作用增强，极大地影响了 JGM2菌株的生长，使其还原Cr(VI)的效率降低。而随着pH的逐渐升高，还原率也逐渐升高，在pH＝5～7时，第7d时，还原率均达到了60％以上。在pH为8时，7d后还原率达到90％，达到最大，说明偏碱性的环境，更适宜JGM2的生长和对Cr(VI)的还原，故将 pH＝8作为菌株JGM2还原Cr(VI)的最适pH。随着pH继续升高，还原率又开始下降。可能是因为过高的pH抑制了JGM2菌体中某些酶的的活性，使酶功能受损，从而影响JGM2的生长，进而影响对 Cr(VI)的还原效率。这说明菌株JGM2对环境的pH值要求比较敏感，适宜的pH为8。

三、六价铬还原菌的鉴定

(1)形态学鉴定

1)群体形态鉴定

取一定量的Cr(VI)还原菌的JGM2菌液，经稀释、划线分离后，放入温度为35℃、转速为150r/min的恒温振荡器中培养24h，选择长出良好单菌落的平板，对这些平板进行观察，记录这些菌落的各项表现。结果如图5所示，菌株JGM2的菌落呈白色、圆形凸起的特征、其菌落直径大约1mm、有透明度、边缘整齐。

2)细胞形态鉴定—革兰氏染色

①涂片固定。用胶头滴管将一滴生理盐水滴入洁净的载玻片的中心，用灼烧灭菌过的接种环挑取少量培养物，置载玻片的水滴中，与水混合做成JGM2菌悬液并涂布成直径约1cm的薄层，在酒精灯的上方来回摇晃，使其固定。

②在固定于载玻片的菌膜上滴加结晶紫溶液，使其完全覆盖菌膜，染色时间为1min。

③水洗。染色1min后，拿住玻片使之与水平方向成45°角，用胶头滴管挤出细小的水流把菌膜上的多余染料冲洗掉，而被菌体所吸附的染料保留了下来。

④媒染。在载玻片的涂面上滴加碘溶液数滴，使其染色1min。在此过程中，碘溶液与染料将形成不溶物，可以增加染料和细菌的亲和力。

⑤水洗。用蒸馏水缓慢地冲洗载玻片，直到载玻片上流下的水流无色为止，再用吸水纸将水吸干。

⑥脱色。将几滴脱色液滴在涂面上，然后轻轻摇晃，将其脱色， 20s后水洗，再用吸水纸吸干。

⑦复染。在涂面上滴加几滴复红复染液，复染1min后，用胶头滴管挤压出细小的水流冲洗。干燥后使用显微镜观察细胞的颜色。

结果如图6所示，发现该JGM2菌株为短杆状，在染色后细胞会呈现红色，判断菌株JGM2为革兰氏阴性菌。

(2)分子生物学鉴定

1)DNA的提取

从固体平板上用无菌牙签挑出将少量纯化后的JGM2菌体，重悬于100μL无菌的ddH₂O中，然后置于沸水浴中煮沸10min。上述步骤结束后，立即放入在-20℃的冰箱30min，以12000r/min的转速离心1min，取上清液作为模板。

2)16S rDNA扩增

正向反应引物为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)(核酸序列如SEQ ID NO.2所示)，反向反应引物为1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)核酸序列如SEQ ID NO.3所示，将引物稀释成10μM的工作液。

①生物学的聚合酶链反应(PCR)扩增体系(26μL)如表2所示

表2 PCR扩增体系

②反应条件如表3所示

表3 PCR反应条件

3)16S rDNA测序分析

将PCR产物送至北京诺赛基因组研究中心有限公司，进行测序分析。

4)系统发育树的建立

利用NCBI数据库，将得到的核苷酸序列输入BLAST中，进行比对分析，获得与目标菌株相关菌株的碱基序列，随后在MEGA软件中构建系统发育树，分析菌株之间的关系，确定菌种类型。

菌株JGM2的基因序列表如下(如SEQ ID NO.1)： CCATGCAGTCGAGCGGATGAGAGGAGCTTGCTCCTTGATTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCG CTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTA TCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGG TCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAA GTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCG TTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTAC GGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAG GAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGTTCCTTGAGAACTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTT GACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGC CCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAGCTC AGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACT CTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTT GCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTG GGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTACCACGAA

测序得到菌株JGM2的基因有效序列长度为1413bp；经NCBI 网站比对，通过Mega6.0软件，邻接法构建系统发育树(图7)。

根据序列对比结果和系统发育树理论，发现该菌株JGM2与假单胞菌(Pseudomonaschengduensis)16S rRNA基因同源性最高，达到 99.9％以上，并稳定的聚在同一分支。因此确定JGM2为假单胞菌 (Pseudomonas chengduensis)。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由权利要求指出。

应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims

1.一株六价铬还原菌，其特征在于，所述六价铬还原菌为成都假单胞菌(Pseudomonaschengduensis)JGM2，其保藏号为CGMCC No.25221。

2.根据权利要求1所述的六价铬还原菌在将六价铬还原成三价铬方面的应用。

3.根据权利要求2所述的六价铬还原菌的应用，其特征在于，包括如下步骤：将所述六价铬还原菌接种到含有所述六价铬的环境中，实现对所述六价铬的还原。

4.根据权利要求2所述的六价铬还原菌的应用，其特征在于，其接种条件为：所述六价铬的浓度为50～200mg/L，所述六价铬还原菌的接种量为1～8％，pH为5～10。

5.根据权利要求4所述的六价铬还原菌的应用，其特征在于，其接种条件为：所述六价铬的浓度为50mg/L，所述六价铬还原菌的接种量为8％，pH为8。

6.根据权利要求5所述的六价铬还原菌的应用，其特征在于，所述六价铬还原菌对所述六价铬的还原率达到90％。

7.一种铬还原剂，其特征在于，包括权利要求1所述的六价铬还原菌。

8.一种预防铬污染的试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的六价铬还原菌。