CN112501065B

CN112501065B - 弗雷德里克斯堡假单胞菌h-9菌株及其应用

Info

Publication number: CN112501065B
Application number: CN202011408654.XA
Authority: CN
Inventors: 刘国; 胡子涵; 湛小静; 谢鸿观; 武夏溦; 樊笑; 刘力源; 夏文静
Original assignee: Chengdu Univeristy of Technology
Current assignee: Chengdu Univeristy of Technology
Priority date: 2020-12-05
Filing date: 2020-12-05
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2040-12-05
Also published as: CN112501065A

Abstract

本发明公开弗雷德里克斯堡假单胞菌H‑9菌株及其应用。弗雷德里克斯堡假单胞菌H‑9菌株CGMCC No.20965自四川广元苍溪县垃圾填埋场渗滤液污染的地下水中筛选得到，能够去除培养基中的总氮，特别地是硝态氮。在实验室条件下经72h培养，在硝态氮‑反硝化培养基实验组与亚硝态氮‑反硝化培养基实验组的平均去除率分别是55.84％、98.47％。菌株除氮培养条件是：pH 5～9、温度15～35℃、C/N＝3:1～15:1、转速60～180rpm。本发明同时提供弗雷德里克斯堡假单胞菌H‑9菌株在硝态氮去除中的应用，以及以弗雷德里克斯堡假单胞菌H‑9菌株为去除总氮效用成分的总氮去除产品。

Description

弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种弗雷德里克斯堡假单胞菌，特别是涉及一种能够应用于去除硝态氮的弗雷德里克斯堡假单胞菌，属于工业微生物技术领域。

背景技术

氮素是造成水体污染的主要原因之一，受人类活动影响，全球出现不同程度水体氮污染问题，如何有效去除水体中含氮物质成为国内外水处理领域学者关注的热点和难点。环境中总氮去除包括硝态氮去除、亚硝态氮去除、氨氮去除。硝酸盐是水体中有机氮无机化的最终产物，也是水体氮素存在的最稳定的形式。在一定条件下硝酸盐氮与亚硝酸盐氮可以相互转化。硝酸盐的危害主要表现为：饮用水中高浓度的硝态氮在微生物的作用下还原成亚硝态氮进而引起高铁血红蛋白症和蓝婴综合症，使人体内血红蛋白失去复氧能力。

生物脱氮法以其安全、高效、经济等特点被视为最具发展前景的污水脱氮有效方法。传统生物脱氮理论认为，反硝化作用是指依靠反硝化细菌利用有机碳源为电子供体，硝态氮为电子受体，将硝态氮还原为气态氮排出水体的过程，所以反硝化过程只能在厌氧或者缺氧条件下才能进行。因此，传统生物脱氮工艺往往是采用空间或时间分隔的方式为两类功能菌群提供最适的生长条件来维持他们对氮素的降解和代谢效率，然后再人为地将两个过程串联起来形成完整的生物脱氮工艺。因此，传统生物脱氮技术存在控制操作复杂、运行成本高、所需污泥龄较长、有机物的去除和氮素的降解不能兼顾等缺点。

生物脱氮的理想工业细菌是异养硝化－好氧反硝化菌。这类细菌能够在有氧条件下把氨氮转化为硝态氮或者亚硝态氮，最终转化成气态氮产物进行脱氮反应，具有同步硝化与反硝化的特性，并且还具有对水处理环境适应能力强、对氧浓度胁迫不敏感、可以同时兼顾有机物和氮素的去除等优点，能够大大简化生物脱氮工艺。尤其是异养硝化－好氧反硝化细菌，相比传统的自养细菌在废水生物脱氮中占有明显优势，具有良好的应用前景。

弗雷德里克斯堡假单胞菌（Pseudomonas frederiksbergensis）是假单胞菌属（Pseudomonas）的一类。现有技术尚未发现其可以单独用于硝态氮去除。

发明内容

本发明的目的就是提供一种弗雷德里克斯堡假单胞菌菌株。该菌株具有去除硝态氮的工业用途。

为实现上述目的，本发明首先提供一种弗雷德里克斯堡假单胞菌菌株，其技术方案如下：

一种弗雷德里克斯堡假单胞菌（Pseudomonas frederiksbergensis）H-9菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2020年10月29日，保藏编号CGMCC No.20965。

弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株是自四川广元苍溪县垃圾填埋场渗滤液污染的地下水中筛选得到。该菌株命名为H-9。

菌株H-9在显微镜下观察可见，菌落浅黄色，圆形、水润、边缘较整齐。菌株长杆状，革兰氏染色结果为阴性。

本发明实验数据证明，弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株CGMCC No.20965能够去除培养基中的硝态氮。在实验室条件下经72h培养，在硝态氮-反硝化培养基实验组的平均去除率达到55.84%，在亚硝态氮-反硝化培养基实验组的平均去除率达到98.47%。据此，本发明还提供弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株CGMCC No. 20965用途类技术方案，具体如下：

弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株CGMCC No.20965在硝态氮去除中的应用。

本发明提供的弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株CGMCC No.20965可以进一步依照常规加工工艺加工成硝态氮去除产品，其技术方案如下：

以弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株CGMCC No.20965为去除总氮效用成分的总氮去除产品。

上述产品以加工成总氮去除剂为例，可以将弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株CGMCC No.20965菌株在扩大发酵液体培养基中适宜条件下培养制得液体总氮去除剂。若加工为固体产品，可以麸皮为填充剂，再将液体总氮去除剂与灭菌麸皮按质量比1:1（W/W）混合后，在恒温箱中烘干至控制水分，即为固体总氮去除剂。液体或固体总氮去除剂又可进一步加工包装成多类总氮去除剂产品。

上述总氮去除剂及各类产品可以依习惯称为是硝态氮去除剂及各类产品。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）提供了一种弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株CGMCC No.20965，该菌株具有去除硝态氮的工业用途，且去除效率高。（2）H-9菌株CGMCC No.20965是异养硝化－好氧反硝化功能的细菌，具有工业应用，尤其是水体降氮应用中的技术优势。（3）仅须单一菌株即可应用于生物除氮，具有使用方便，操作工艺简洁、包装、运输便利，易形成商品化的明显的技术优势。（4）H-9菌株CGMCC No.20965是从被硝态氮物质长期胁迫的环境样品中筛选得到，对周围环境不具有生态入侵威胁，符合生物安全法规。

附图说明

图1是H-9菌株基于16SrDNA基因序列的系统发育树。

图2a是H-9菌株在DM1培养基中生长情况及脱氮效果。

图2b是H-9菌株在DM2培养基中生长情况及脱氮效果。

图3是不同碳源下H-9菌株在DM1培养基中生长情况及脱氮效果。

图4是不同C/N下H-9菌株在DM1培养基中生长情况及脱氮效果。

图5是不同pH下H-9菌株在DM1培养基中生长情况及脱氮效果。

图6是不同温度下H-9菌株在DM1培养基中生长情况及脱氮效果。

图7是不同培养转速下H-9菌株在DM1培养基中生长情况及脱氮效果。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。

实施例一

菌株筛选与鉴定。

1、菌株筛选

1.1 样品与培养基

菌株来源：四川广元苍溪县垃圾填埋场渗滤液污染的地下水。

硝态氮－反硝化培养基（DM1培养基）1L：柠檬酸钠 6.6869g，KNO₃ 1g（硝态氮浓度为138.4mg/L），K₂HPO₄•7H2O 1g，KH₂PO₄•7H₂O 1 g，MgSO₄•7H₂O 0.2g，痕量元素0.1%（v/v），pH 7.0，溶解于1000ml去离子水中。

BTB培养基：2%琼脂粉，KNO₃ 1 g，KH₂PO₄1 g，FeCl₂•6H₂O 0.5 g，CaCl₂•7H₂O 0.2g，MgSO₄•7H₂O 1 g，柠檬酸钠5 g，溴百里酚蓝（BTB）（1%乙醇溶液溶解）1 mL，pH 7.0，溶解于1000ml去离子水中。：

以上培养基使用前均在121℃高压蒸汽灭菌锅灭菌20min。

1.2 富集、分离、纯化菌株

菌种富集：量取菌株来源水样10ml，加至装有90mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中（250mL），在恒温摇床上以28℃、120rpm震荡30min，取出后静置；吸取1mL菌肥浸出液，装入100mLDM1培养基的250mL的锥形瓶中，28℃、120rp震荡条件下，暗培养2d。完成一次富集培养。然后取10mL培养液转入新的DM培养基中，在相同的条件下继续富集培养一次，得到菌种富集液。

菌株分离：菌种富集液采用梯度稀释法经BTB培养基于28℃条件下遮光培养3d，分离获得的单一菌株再经BTB培养基进行纯化，将生长快、生长量大的菌株接于斜面上，4℃低温保存备用。进一步接种至DM1培养基中，每天测定培养基中硝态氮去除能力，最后得到一株对硝态氮有较好去除能力的菌株，命名为H-9。

菌株纯化：取一环分离后的单一菌株，在BTB培养基中多次进行平板划线，将菌株进行纯化。

2、菌株鉴定

2.1 菌株形态、生长特征及16SrDNA序列分析

取上述菌株H-9在BTB平板培养后观察其形态特征：菌落浅黄色，圆形、水润、边缘较整齐。菌株长杆状，革兰氏染色结果为阴性。

经多组培养实验，确定菌株H-9的生长pH范围为5～9，最适pH＝7；生长温度范围为15℃～35℃，最适生长温度为25℃；生长培养基碳氮比范围为3:1～15:1，最适为12:1；生长最佳转速为60rpm～180rpm，最适转速为80rpm。部分生理生化特征见表1。

表1 菌株H-9部分生理生化特征

采用细菌全基因组快速抽提试剂盒提取上述纯菌株的全基因组，以通用引物17F/1429R进行16S rDNA序列扩增，扩增的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳和紫外光分光光度计检测浓度与纯度合格后进行测序分析。测序结果在NCBI上进行BLAST比对，结果显示与弗雷德里克斯堡假单胞菌（Pseudomonas frederiksbergensis）的序列同源性100%。利用MEGA 5.05软件进行多重序列比对分析，并采用Neighbor-joining法构建系统发育树进行系统发育分析，建立H-9菌株基于16SrDNA序列的系统发育树（图1）。

2.2 确定纯化菌株的种名

综合纯化菌株形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析（如SEQ ID NO.1），确定该纯化菌株为弗雷德里克斯堡假单胞菌（Pseudomonas frederiksbergensis），命名为弗雷德里克斯堡假单胞菌（Pseudomonas frederiksbergensis）H-9。

上述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所菌保中心，邮编100101；保藏日期2020年10月29日，保藏编号CGMCC No20965。

实施例二

本发明供弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株CGMCC No.20965应用于硝态氮去除。

1、菌液、溶液、培养基

H-9菌株菌悬液：将经富集培养至对数生长期的菌株H-9菌液以1000rpm离心3min，倒掉上清液，用无菌去离子水洗涤余留在离心管里的菌体3次，并加入无菌去离子水进行稀释。

痕量元素（1L）：CuSO₄•5H₂O 4g，FeSO₄•7H₂O 0.7g，FeCl₃•7H₂O 7g，CoCl₃•6H₂O0.2g，NaMoO₄•2H₂O 3.4g，CaCl₂•2H₂O 2g，溶解于1000ml去离子水中。

硝态氮－反硝化培养基（DM1培养基）1L：同实施例一。

亚硝态氮－反硝化培养基（DM2培养基）1L：柠檬酸钠 4.8255g ，NaNO₂0.493g（亚硝态氮浓度为100mg/L），K₂HPO₄•7H2O 1g，KH₂PO₄•7H₂O 1 g，MgSO₄•7H₂O 0.2g，痕量元素0.1%（v/v），pH 7.0，溶解于1000ml去离子水中。

以上培养基使用前均在121℃高压蒸汽灭菌锅灭菌20min。

2、实验方法

将H-9菌株的菌悬液按1%（v/v）接种量分别接入100mL硝态氮-反硝化培养基（DM1）与亚硝态氮－反硝化培养基（DM2）。设置三个重复组，分别为组1、组2、组3，同时设置三个空白对照。表2为培养72h后，培养基中硝态氮与亚硝态氮的残余浓度。

表2

3、实验结果

在培养72h后，硝态氮-反硝化培养基实验组的平均去除率达到55.84%，亚硝态氮-反硝化培养基实验组的平均去除率达到98.47%。图2a是H-9菌株在DM1培养基中生长情况及脱氮效果；图2b是H-9菌株在DM2培养基中生长情况及脱氮效果。

实施例三

不同碳源对H-9菌株CGMCC No.20965硝态氮态除效果的影响。

设计与实施例二硝态氮-反硝化培养基（DM1）相同的处理。培养条件除碳源不同以外，其余与实施例二硝态氮-反硝化培养基（DM1）相同。设置5个不同碳源，分别为葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠。每个处理设置3个重复，同时每种培养基设置三个空白对照。分别培养72h。

图3是不同碳源下H-9菌株在DM1培养基中生长情况及脱氮效果。图3显示，不同碳源对硝态氮去除率为丁二酸钠>柠檬酸钠>乙酸钠>葡萄糖>蔗糖。优选为丁二酸钠。

实施例四

不同碳氮比（C/N）对H-9菌株CGMCC No.20965硝态氮去除效果的影响。

设计与实施例三相同的处理。碳源设为丁二酸钠，培养条件除C/N以外，其余与实施例三相同。设置5个不同的C/N处理，初始硝态氮浓度138.4mg/L保持不变，C/N分别是3、6、9、12、15，培养基中对应的丁二酸钠质量分别为：1.4477g、2.8953g、4.3430g、5.7906g、7.2383g。每个处理设置3个重复，同时每种培养基设置三个空白对照，培养72h。

图4是不同C/N下H-9菌株在DM1培养基中生长情况及脱氮效果。图4显示，不同C/N对硝态氮去除率为12> 15 > 9 > 6 > 3。优选C/N=12。

实施例五

不同pH对H-9菌株CGMCC No.20965硝态氮去除效果的影响。

设计与实施例四除pH值以外相同的处理，且C/N＝9，pH条件设置5个处理，分别为5、6、7、8、9。每个处理设置3个重复，同时每种培养基设置三个空白对照，培养72h。

图5是不同pH下H-9菌株在DM1培养基中生长情况及脱氮效果。图5显示，不同pH对硝态氮去除率为pH= 7>6>5>8>9。优选pH=7。

实施例六

不同温度对H-9菌株CGMCC No.20965硝态氮去除效果的影响。

设计与实施例五除温度条件外相同的处理，pH=7。设置5个温度梯度，分别为15°C、20°C、25°C、30°C、35°C。每个处理设置3个重复，同时每种培养基设置三个空白对照。分别培养72 h。

图6是不同温度下H-9菌株在DM1培养基中生长情况及脱氮效果。图6显示，不同温度对硝态氮去除率为pH=25°C >20°C >30°C >35°C >15°C。优选为25°C。

实施例七

不同培养转速对H-9菌株CGMCC No.20965硝态氮去除效果的影响。

设计除培养转速外与实施例六相同的处理，pH＝7.0。设置5个不同的转速处理，分别是60 rpm、80rpm、120 rpm、150 rpm、180 rpm。每个处理设置3个重复，同时每种培养基设置三个空白对照，培养72h。

图7是不同培养转速下H-9菌株在DM1培养基中生长情况及脱氮效果。图7显示，不同培养转速对硝态氮去除率为80 rpm > 120 rpm > 150 rpm >180 rpm >60 rpm。优选转速为80 rpm。

在实验室最佳条件下：碳源：丁二酸钠，pH：7，温度：25°C，C/N：12，转速：80rpm，总氮和硝态氮的平均去除率为：72.88%，100%。

序列表

<110> 成都理工大学

<120> 弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株及其应用

<130> 2020.12.5

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1370

<212> DNA

<213> 弗雷德里克斯堡假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensisH-9)

<400> 1

ttagactagc tacttctggt gcaacccact cccatggtgt gacggcggtg tgtacaaggc 60

ccgggaacgt attcaccgcg acattctgat tcgcgattac tagcgattcc gacttcacgc 120

agtcgagttg cagactgcga tccggactac gatcggtttt atgggattag ctccacctcg 180

cggcttggca accctctgta ccgaccattg tagcacgtgt gtagcccagg ccgtaagggc 240

catgatgact tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt ctccttagag 300

tgcccaccat tacgtgctgg taactaagga caagggttgc gctcgttacg ggacttaacc 360

caacatctca cgacacgagc tgacgacagc catgcagcac ctgtctcaat gctcccgaag 420

gcaccaatcc atctctggaa agttcattgg atgtcaaggc ctggtaaggt tcttcgcgtt 480

gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt catttgagtt 540

ttaaccttgc ggccgtactc cccaggcggt caacttaatg cgttagctgc gccactaaga 600

gctcaaggct cccaacggct agttgacatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa 660

tcctgtttgc tccccacgct ttcgcacctc agtgtcagta tcagtccagg tggtcgcctt 720

cgccactggt gttccttcct atatctacgc atttcaccgc tacacaggaa attccaccac 780

cctctaccat actctagctc gacagttttg aatgcagttc ccaggttgag cccggggatt 840

tcacatccaa cttaacgaac cacctacgcg cgctttacgc ccagtaattc cgattaacgc 900

ttgcaccctc tgtattaccg cggctgctgg cacagagtta gccggtgctt attctgtcgg 960

taacgtcaaa acaatcacgt attaggtaac tgcccttcct cccaacttaa agtgctttac 1020

aatccgaaga ccttcttcac acacgcggca tggctggatc aggctttcgc ccattgtcca 1080

atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctggaccgtg tctcagttcc agtgtgactg 1140

atcatcctct cagaccagtt acggatcgtc gccttggtga gccattacct caccaactag 1200

ctaatccgac ctaggctcat ctgatagcgc aaggcccgaa ggtcccctgc tttctcccgt 1260

aggacgtatg cggtattagc gttcgtttcc gaacgttatc ccccactacc aggcagattc 1320

ctaggcatta ctcacccgtc cgccgctcgc caccaggtac aagtacccgt 1370

Claims

1.弗雷德里克斯堡假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis)H-9菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2020年10月29日，保藏编号CGMCCNo.20965。

2.权利要求1所述的弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株CGMCC No.20965在总氮去除中的应用。

3.权利要求1所述的弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株CGMCC No.20965在硝态氮去除中的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：适用的去除培养条件pH 5～9、15℃～35℃。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：适用的去除培养条件pH 7、25℃。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：适用的去除培养条件还包括：碳氮比3:1～15:1、转速80rpm～120rpm。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：适用的去除培养条件还包括：碳氮比12、转速80rpm。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：适用的去除培养条件中碳源是丁二酸钠或柠檬酸钠或乙酸钠中的一种或几种。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：适用的去除培养条件中碳源是丁二酸钠。

10.以弗雷德里克斯堡假单胞菌H-9菌株CGMCC No.20965为效用成分的总氮/硝态氮去除剂/产品。