CN108455734A - 施氏微杆菌在污水净化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了施氏微杆菌在污水净化中的应用。其属于污水净化技术领域。本发明提供施氏微杆菌在去除污水中的NH₄ ⁺‑N、总磷(TP)和/或化学需氧量(COD)中的应用。本发明通过实验证实，施氏微杆菌具有易培养、生长速度快、环境适应能力强、污水处理效果好的优点，对人工合成污水、富营养化水体和养猪污水厌氧出水等污水均具有较好的净化效果，为污水治理提供了新的菌种源。

Description

施氏微杆菌在污水净化中的应用

技术领域

本发明属于污水净化技术领域，更具体地说，本发明涉及将施氏微杆菌用于净化污水。

背景技术

随着经济和社会的快速发展，人类对水生态系统带来的影响日益加剧，尤其近年来我国养猪业集约化和规模化快速发展，规模化猪场排放的粪尿污水也在剧增，粪尿污水经厌氧发酵处理，大部分有机质得到去除，但N、P和COD等指标仍很高。过量氮、磷等营养物质流入水体，使得藻类和其它浮游动物迅速繁殖，水体透明度和溶解氧发生变化，水质不断恶化，从而使水体生态系统和水功能受到阻碍和破坏。而且，猪场排放的粪尿污水中含有Cu(铜)、Pb(铅)等金属元素，如得不到有效去除，将对环境造成不良影响。

目前富营养化水体治理和修复有物理、化学和生物等手段。物理方法工程量大、耗能高且不彻底。投加化学药剂短期效果明显，但容易发生水质反弹并造成水体二次污染，会对水体的整体生态环境造成一定的不良影响。微生物富营养化水体修复技术通过微生物之间的食物链关系建立相应的微生态系统，加快水中的能量流动和物质循环，强化微生物对水体中过量氮、磷的吸附、转化和降解圈，以此修复水体自净功能，减轻水体富营养化程度。由于微生物修复技术的投入低于传统环境工程技术，且具有环境友好，无二次污染，处理效率高，处理时间短，操作简便等优势，因而成为关注的焦点。不同种类微生物对各类物质的代谢和利用能力相差较大，所以从环境中寻找环境友好且治污能力强的微生物资源具有重要的现实意义。

发明内容

本发明目的在于：提供了施氏微杆菌(Microbacterium schleiferi)在人工合成污水、富营养化水体和养猪污水厌氧出水等污水净化中的新应用。

本发明将施氏微杆菌用于去除污水中的NH₄ ⁺-N、总磷(TP)和/或化学需氧量(COD)。

更进一步地，本发明还将施氏微杆菌用于去除污水中的Cu、Pb。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明通过实验证实，施氏微杆菌具有易培养、生长速度快、环境适应能力强、污水处理效果好的优点，对人工合成污水、富营养化水体和养猪污水厌氧出水等污水均具有较好的净化效果，为污水治理提供了新的菌种源。

附图说明

图1为施氏微杆菌的营养琼脂平板菌落图。

图2为施氏微杆菌的光学显微镜观察结果(结晶紫染色，×100)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

实施例1施氏微杆菌的分离、纯化和鉴定

1.样品采集：细菌样品采集自福州某内河的底泥沉积物。将采集样品移至灭菌容器，快速置于4℃冰箱保存。

2.菌种分离：

2.1初筛：无菌条件下，称取5g采集的底泥沉积物样品，加入装有200mL反硝化富集培养基的500mL三角瓶中，于25～28℃静置培养，早晚各摇动一次，培养5d，获得第一代富集培养物。将第一代富集培养物转代培养，方法同上，但细菌接种量要逐代减少。转代培养十次左右，获得最终的富集培养物，此时，镜检观察有大量细菌存在。吸取0.1mL富集培养物加入0.8％无菌生理盐水中，得到10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5和10^-6梯度的稀释溶液，吸取不同浓度的稀释溶液各0.2mL涂布于溴百里酚蓝(BTB)选择性培养基，25～28℃培养2～3d。从这几个稀释梯度中挑选出1个最合适的梯度，要求平板上菌落分布清晰均匀(菌落数在20-200个)，从平板上挑取蓝色或周围有蓝色晕圈的单菌落。经重复3次涂布、挑种，至菌落特征一致，无异常菌落出现者，认为是完全纯化。单菌落接种到营养琼脂斜面培养基上培养。从斜面培养基上挑取少量菌体，接种至装有10mL无菌反硝化富集培养基的试管中，以胶塞密闭瓶口，置培养箱中25～28℃恒温培养。每隔一定时间取样1mL，分别加入2只干净试管中，分别滴加二苯胺和格林斯氏试剂0.2mL，根据溶液的颜色变化了解培养基中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的含量变化。依据硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的含量变化定性判断反硝化速率，选取数株反硝化速率较高的菌株。将菌株点种于限磷和磷过量的葡萄糖-MOPS培养基，25～28℃培养2～3d。观测蓝白斑的生长情况。挑取在两种培养基上同时都产生蓝斑的菌株。

反硝化富集培养基：KNO₃ 2.0g，MgSO₄·7H₂0 0.2g，K₂HPO₄ 0.5g，酒石酸钾钠20g，CaCl₂0.02g，H₂O 1000mL，pH 7.2。

溴百里酚蓝(BTB)选择性培养基：琼脂20g，KNO₃ 1g，KH₂PO₄ 1g，FeCl₂·6H₂O 0.5g，CaCl₂·7H₂O 0.2g，MgSO₄·7H₂O 1g，琥珀酸钠8.5g，BTB(1％溶于酒精)1mL；蒸馏水1000mL，用1mol/LNaOH调节pH7.0-7.3。

营养琼脂培养基(NA)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌15min。

限磷和磷过量的葡萄糖-MOPS培养基：100ml的10×MOPS混合物(8.372g MOPS+0.717g tricine+30ml去离子水，10mol L^－1的KOH调节pH至7.4，总体积到44ml，0.01％1ml新制的FeSO₄溶液，按下列顺序加溶液：5ml 1.9mol L^－1NH₄Cl，1ml 0.276mol L^－1K₄SO₄，0.025ml 0.02mol L^－1CaCl₂·2H₂O，0.21ml 2.5mol L^－1MgCl₂·6H₂O，10ml 5mol L^－1NaCl，0.02ml微量元素混合液，38.7ml去离子水，葡萄糖0.1g)，取50ml置于两个500ml的三角瓶中，向一个三角瓶中加入0.0087g K₂HPO₄，成为限磷培养基；向另一个瓶中加入0.1732gK₂HPO₄，成为磷过量的培养基。向两种培养基中均加入thiamine溶液和去离子水，分别用细菌滤器过滤后，分装于已灭菌的150ml的三角瓶中。

微量元素混合液：MnCl₂·4H₂O 12.98g，CuSO₄·5H₂O 1.83g，ZnSO₄·7H₂O 3.20g，FeSO₄ 0.05g，定容到1L。

2.2复筛：分别将初筛获得的脱氮除磷功能菌接入装有200mL合成污水的500mL三角瓶中，菌体接种量为0.05％(v/v)，以不添加菌剂为空白对照组，均设立三个平行组，室温下采用间歇曝气方式，即曝气2h，停曝5h。96h取样测定水体中NH₄ ⁺-N、PO₄ ^3--P和COD的含量。选取其中一株对污水处理效果最佳的菌株，将该菌株命名为NY001。NY001菌株处理污水96h，其NH₄ ⁺-N去除率为83％，PO₄ ^3--P去除率为79％,COD降解率为81％。

合成污水的配制，组成成份(mg/L)：葡萄糖360，酵母膏80.0，KH₂PO₄ 14.0，MgSO₄·7H₂O24.0，NH₄Cl 60.0，CaCl₂ 18.0，NaHCO₃ 24.0，MnSO₄·7H₂O 6.0，FeCl₃ 0.3，NaNO₂ 30.0，KNO₃30.0，溶于1L蒸馏水中，调节pH至7.0。分装于500mL三角瓶中。121℃高压灭菌15min。NH₄ ⁺-N采用纳氏试剂比色法测定；TP采用过硫酸钾氧化-钼酸铵分光光度法测定；COD采用重铬酸盐法测定。

3.菌种的鉴定：取培养至对数生长期的菌液5mL，8000r/min离心15min，倾去上清液，收集菌体。采用CTAB/NaCl法提取菌体基因组DNA。步骤如下：菌体中加入1.35mLTE溶液(pH 8.0)，悬浮，加入0.3mL 10％十二烷基硫酸钠(SDS)和150μL 100mg/ml溶菌酶和150μL100mg/mL蛋白酶K，混匀，60℃水浴1h，加0.25mL 5mol/L NaCl和0.2mL CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min，以等体积的苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇各抽提3次，10000r/min离心10min，吸取上清液，加入0.6倍体积异丙醇，放置于-20℃沉淀DNA，DNA溶于50μL TE中，-20℃保存备用。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA完整性。采用16S rRNA基因的通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对提取的DNA进行PCR扩增。将扩增后的DNA产物送至上海生物工程有限公司进行测序。用BLAST软件与NCBI的GenBank数据库收录的16SrRNA序列进行比对分析，Blast搜索同源序列。NY001与施氏微杆菌Microbacterium schleiferistrain 5S8的16S rRNA基因序列的相似性为99％，综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，确定菌株NY001为施氏微杆菌Microbacterium schleiferi，其16S rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。

施氏微杆菌于2018年3月13日保藏于福建省微生物研究所，其保藏号为：FIM-20180313001。

实施例2施氏微杆菌的制备

(1)斜面培养：

将实施例1所得施氏微杆菌接种至营养琼脂培养基上，于28℃培养箱培养2～3d。营养琼脂培养基配方同实施例1。

(2)发酵培养：

用接种环挑起少量斜面培养基上的施氏微杆菌体接入发酵培养基中，于28℃、120r/min的摇床上振荡培养3～5d。

发酵培养基配方(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化钠10.0，余量为水，pH自然，将上述成份混合均匀后，灭菌备用。

实施例3施氏微杆菌对富营养化水体的净化试验

富营养化水取自富营养化池塘水体。取实施例2制备的施氏微杆菌菌液5～10mL，8000r/min离心5min，弃上清液得到菌体。用0.8％生理盐水洗去菌体上的培养基，用无菌水溶解，离心，重复3次得湿菌体。量取3L富营养化水加入到处理容器中，投加0.05％(v/v)的施氏微杆菌菌体，处理液中NH₄ ⁺-N、TP和COD的初始值分别为：18.3mg/L、1.5mg/L和87mg/L。以不添加菌剂为空白对照组，均设立三个平行组。在室温下采用间歇曝气方式，即曝气2h，停曝5h。96h后取样测定水体中NH₄ ⁺-N、TP和COD的含量。此时空白对照组处理液中的NH₄ ⁺-N、TP和COD的值分别为：13.4mg/L、1.0mg/L和56.6mg/L。而添加菌剂的处理液中的NH₄ ⁺-N、TP和COD的值分别为：1.6mg/L、0.2mg/L和12.2mg/L。

结果表明，与不添加施氏微杆菌相比，添加施氏微杆菌的处理液中NH₄ ⁺-N去除率为91％，TP去除率为87％，COD降解率为86％。说明施氏微杆菌对富营养化水的净化效果显著。

实施例4施氏微杆菌对猪场污水厌氧出水的净化试验

取实施例2制备的施氏微杆菌菌液5～10mL，8000r/min离心5min，弃上清液得到菌体。用0.8％生理盐水洗去菌体上的培养基，用无菌水溶解，离心，重复3次得湿菌体。量取3L猪场污水厌氧出水处理液(50mL厌氧出水+150mL自来水)加入到处理容器中，投加0.1％(v/v)的施氏微杆菌菌体，处理液中NH₄ ⁺-N、TP、COD、Cu和Pb的初始值分别为：339.7mg/L、5.6mg/L、513mg/L、0.58mg/L和0.03mg/L。以不添加菌剂为空白对照组，均设立三个平行组。在室温下采用间歇曝气方式，即曝气2h，停曝5h。96h后取样测定水体中NH₄ ⁺-N、TP、COD、Cu和Pb的含量。此时空白对照组处理液中的NH₄ ⁺-N、TP、COD、Cu和Pb的值分别为：248mg/L、4.2mg/L、420.7mg/L、0.58mg/L和0.03mg/L。而添加菌剂的处理液中的NH₄ ⁺-N、TP、COD、Cu和Pb的值分别为：64.5mg/L、0.8mg/L、148.8mg/L、0.29mg/L和0.01mg/L。

结果表明，添加施氏微杆菌菌体组的处理液中的NH₄ ⁺-N去除率为81％，TP去除率为86％，COD降解率为71％，Cu去除率为50％，Pb去除率为67％。施氏微杆菌NY001对猪场污水厌氧出水的净化效果显著。

Cu、Pb采用原子吸收光谱法测定。

实施例5施氏微杆菌对人工合成污水的净化试验

取实施例2制备的施氏微杆菌菌液5～10mL，8000r/min离心5min，弃上清液得到菌体。用0.8％生理盐水洗去菌体上的培养基，用无菌水溶解，离心，重复3次得湿菌体。量取3L人工合成污水加入到处理容器中，投加0.05％(v/v)的施氏微杆菌菌体，处理液中NH₄ ⁺-N、TP和COD的初始值分别为：25.67mg/L、7.13mg/L和168mg/L。以不添加菌剂为空白对照组，均设立三个平行组。在室温下采用间歇曝气方式，即曝气2h，停曝5h。96h后取样测定水体中NH₄ ⁺-N、TP和COD的含量。此时空白对照组处理液中的NH₄ ⁺-N、TP和COD的值分别为：10.78mg/L、2.85mg/L和75.6mg/L。而添加菌剂的处理液中的NH₄ ⁺-N、TP和COD的值分别为：4.36mg/L、1.57mg/L和43mg/L。

结果表明，与不添加施氏微杆菌相比，添加施氏微杆菌的处理液中其NH₄ ⁺-N去除率为83％，PO₄ ^3--P去除率为78％，COD降解率为74％。

人工合成污水的配制，组成成份(mg/L)：葡萄糖360，酵母膏80.0，KH₂PO₄ 14.0，MgSO₄·7H₂O 24.0，NH₄Cl 60.0，CaCl₂ 18.0，NaHCO₃ 24.0，MnSO₄·7H₂O 6.0，FeCl₃ 0.3，NaNO₂30.0，KNO₃ 30.0，溶于1L蒸馏水中，调节pH至7.0。分装于500mL三角瓶中。121℃高压灭菌15min。

根据上述说明书的揭示和指导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

序列表

<110> 福建省微生物研究所

<120> 施氏微杆菌在污水净化中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1388

<212> DNA/RNA

<213> 施氏微杆菌16S rRNA(Microbacterium schleiferi)

<400> 1

ggctccctcc acagggttgg gccaccggct tcaggtgtta ccgactttca tgacttgacg 60

ggcggtgtgt acaagacccg ggaacgtatt caccgcagcg ttgctgatct gcgattacta 120

gcgactccga cttcatgagg tcgagttgca gacctcaatc cgaactggga ccggcttttt 180

gggattcgct ccaccttacg gtattgcagc cctttgtacc ggccattgta gcatgcgtga 240

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tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 420

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acaccaggaa ttccaatctc ccctaccgca ctctagtctg cccgtaccca ctgcaggccc 840

gaggttgagc ctcgggtttt cacagcagac gcgacaaacc gcctacgagc tctttacgcc 900

caataattcc ggataacgct tgcgccctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960

ccggcgcttt ttctgcaggt accgtcactt tcgcttcttc cctgctaaaa gaggtttaca 1020

acccgaaggc cgtcgtccct cacgcggcgt tgctgcatca ggctttcgcc cattgtgcaa 1080

tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtg tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccgg 1140

tcaccctctc aggccggcta cccgtcgacg ccttggtgag ccgttacctc accaacaagc 1200

tgataggccg cgagctcatc cctgaccgaa attctttcca gctgctgaag atgccttcgc 1260

agctcgtatc cggtattaga cgccgtttcc agcgcttatc ccagagtcag gggcagattg 1320

ctcacgtgtt actcacccgt tcgccactga tccagcagag caagctccgc tttcaccgtt 1380

cgactgca 1388

Claims (4)

1.施氏微杆菌在去除污水中的NH₄ ⁺-N中的应用。

2.施氏微杆菌在去除污水中的总磷中的应用。

3.施氏微杆菌在降解污水中的化学需氧量中的应用。

4.施氏微杆菌在去除污水中的Cu、Pb中的应用。