CN114437981A - 一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法 - Google Patents

一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法，涉及环保生物技术领域，采用一级种子培养基、二级发酵培养基对菌种的连续接种培养和补料培养基的补料发酵，实现硫自养反硝化细菌的快速制备。本发明精简了培养流程，同时降低了培养难度。目的在于解决该菌培养过程中遇到的费时、工艺复杂等问题,可实现硫自养反硝化细菌的高密度培养,培养方法简单，选择性强，不易染杂菌，成本低，可实现工业化生产。

Description

一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法
技术领域
本发明属于环保生物技术领域，具体涉及一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法。
背景技术
当今，因人类活动影响，城市河道及相对开放的水域氨氮指标高居不下。由此引发的生态环境问题已经对人类居家环境和城市形象产生重大影响。微生物修复水环境成为目前研究的热点领域，目前在针对污水水体硝酸盐的去除也正在随着对反硝化细菌的研究而逐渐提升到新的层次。
废水中存在着有机氮、氨氮、硝态氮等形式的氮，其中以氨氮和有机氮为主要形式。在生物梳理过程中，有机氮被一样微生物氧化分解，即通过氨化作用转化为氨氮，而后经硝化过程转化为亚硝态氮和硝态氮，最好通过反硝化作用使硝态氮转化为氮气，逸入大气，从而降低废水中N的含量。
尽管反硝化工艺研究较多,但对于C/N低于1的水体,采用该工艺将导致运行费用高及运行管理困难等问题。自养反硝化细菌特别是脱氮硫杆菌(Thiobacillusdenitrificans)的发现引起了研究者的普遍关注，脱氮硫杆菌作为硫自养反硝化菌,其生物特性和硝酸盐降解特性的研究对于该菌在实际生产中的开发应用具有重要指导意义。而现阶段生物脱氮存在以下不足：一方面，生物脱氮技术存在着菌种生长周期长，繁殖速度慢，不易调试，理论研究与实际应用相脱节等主要问题；另一方面，现有的微生物培养主要在工艺复杂及价格昂贵的发酵罐中进行，造成微生物培养成本增加，一定程度上阻碍了生物脱氮技术在污水处理领域的推广应用。因此，结合污水处理微生物菌剂应用的特点，研究适宜快速的大规模培养方法，为进行含氮废水的微生物脱氮奠定物质基础。为此，我们提出了一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有微生物培养技术中微生物培养时间过长、操作繁琐、菌种密度过低的问题，而提供一种专门用于发酵硫自养反硝化细菌的快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法，该方法，精简了培养流程，同时降低了培养难度。目的在于解决该菌培养过程中遇到的费时、工艺复杂等问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法，采用培养基对菌种的连续接种和补料发酵，实现硫自养反硝化细菌的快速制备；
上述培养基包括：
一级种子培养基：
硝酸钠1g/L，碳酸氢钠2g/L，硫代硫酸钠2g/L，氯化镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.05-0.1g/L，氯化钠0.05g/L。
二级发酵培养基：
硝酸钠5-10g/L，碳酸氢钠10-15g/L，硫代硫酸钠1-2g/L，氯化镁0.5-1g/L，磷酸氢二钾1-2g/L，硫酸亚铁0.05-0.1g/L，硫酸锰0.05-0.1g/L，麸皮5-10g/L，椰壳粉1-5g/L，碳酸钙0.5-1g/L。
补料培养基为硝酸钠10g/L，碳酸氢钠15g/L，硫代硫酸钠20g/L。
快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法步骤如下：
1)、采用菌种来源自缺氧池的活性污泥，麸皮粉经过该活性污泥浸泡一周取出清洗，用一级种子液进行连续培养。培养过程中通过搅拌器连续搅拌24H，搅拌转速60rpm/min，随后停止搅拌；培养温度25-30℃，pH6.5-7.5，待产生大量气泡，且麸皮粉漂浮为止，结束一级种子液的培养。
2)、向培养容器中加入上述一级种子培养液，按一级种子培养液：二级发酵培养基培养基＝1:50的比例进行接种；接种于二级发酵培养基中，其培养条件为30℃，溶解氧0.5-1mg/l，pH6-8，培养时间为24H，同时加以搅拌，搅拌转速60rpm/min，目的是使培养基内部物质均匀流动，保证细菌充分繁殖附着于麸皮。
3)、待培养基培养24H后，对培养基进行第一次流加补料，补料培养基的补料体积为发酵液体积的10％左右，连续发酵10h后，进行第二次流加补料，补料培养基的补料体积为发酵液体积的5％左右，继续发酵培养8H结束，即得到硫自养反硝化细菌发酵液。
4)、通过稀释涂布的方法对硫自养反硝化细菌发酵液细菌的浓度进行检测。
优选地，二级发酵培养基：硝酸钠5g/L，碳酸氢钠10g/L，硫代硫酸钠1g/L，氯化镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.05g/L，麸皮5g/L，椰壳粉3g/L，碳酸钙0.5g/L。
优选地，所述补料培养基在121℃条件下，灭菌20-30min处理。
与现有技术相比，本发明提出的一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法，有益效果在于：该培养方法，简单，选择性强，不易染杂菌，成本低，可实现工业化生产。具体地：
本发明的快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法，可实现硫自养反硝化细菌的高密度培养，经过连续接种和补料发酵其最终产品的活菌数达到1×109CFU/ml，高于目前市场上大多数产品的活菌数，且培养周期相较于普通高密度培养周期缩短至3天。
同时，本发明采用麸皮作为培养硫自养反硝化细菌的载体，麸皮是一种良好的固定化载体，其性质稳定，耐降解，传质好，比表面积大等优点。以麸皮作为载体培养硫自养反硝化细菌能有效的去除硝态氮，耗时短。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：
图1是本发明的工艺流程图；
图2是本发明实施例1中培养72H后硫自养反硝化细菌显微图片；
图3是本发明实施例2中取样测OD420值随时间的变化直线图。
具体实施方式
现结合说明书附图，详细说明本发明的结构特点。
一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法,包括：
一级种子培养基：
硝酸钠1g/L，碳酸氢钠2g/L，硫代硫酸钠2g/L，氯化镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.05g/L，氯化钠0.05g/L。
二级发酵培养基：
硝酸钠5g/L，碳酸氢钠10g/L，硫代硫酸钠1g/L，氯化镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.05g/L，麸皮5g/L，椰壳粉3g/L，碳酸钙0.5g/L。
一级种子液在进行发酵培养过程中还涉及到补料操作，其中所需补料培养基为硝酸钠10g/L，碳酸氢钠15g/L，硫代硫酸钠20g/L。
该方法包括如下步骤：
S1、培养基制备：按照上述培养基配方进行培养基的配制,并在121℃，灭菌20-30min，备用。
S2、菌株采集：硫自养反硝化系来源由本实验室于2021年4月采集于南京市某水质提水站缺氧池的活性污泥，取麸皮粉适量经过该活性污泥浸泡一周取出清洗。
S3、一级种子液培养：用一级种子培养基对上述麸皮粉进行连续培养，培养过程中通过搅拌器连续搅拌24H，随后停止搅拌，待产生大量气泡，且麸皮粉漂浮为止，结束一级种子液的培养，得到一级种子培养液。
S4、二级发酵培养：向培养容器中加入步骤2中得到的一级种子培养液，按照一级种子培养液：二级发酵培养基＝50:1的比例进行接种，培养时间为24H，同时加以搅拌。
S5、补料培养：待种子液发酵至48h后，流加补料培养基为发酵液体积的10％左右，连续发酵10h后，进行第二次流加补料，补料体积为发酵液体积的5％左右。继续发酵培养8H结束，即得到硫自养反硝化细菌发酵液。
其中，发酵参数设定：一级种子液培养温度为25-30℃，pH值为6.5-7.5，二级发酵培养条件为30℃，溶解氧0.5-1mg/L，pH6-8，一级种子液培养和二级发酵培养的搅拌转速为60rpm/min。其中溶解氧的控制通过流加饱和亚硫酸钠溶液来控制；温度由反应器外部的控温夹套来稳定。
细菌活菌数的检测：细菌的浓度检测均可通过稀释涂布的方法进行检测。
实施例1
表1列出了具有代表性的硫自养反硝化细菌的五种培养方式：1、温度差异；2、培养基差异；3、溶解氧和培养基差异；4、pH及培养基差异；5、本发明提供方法，同时接种本发明的一级种子培养液进行接种试验，考察活菌的增长情况。结果表明，硫自养反硝化细菌的菌量最大时相差3个数量级，由本发明提供的培养方式在培养72H后，最终活菌数为9.8x108CFU/mL。其他方式的培养并未到达该种数量级，或者更低。这种菌量增长的差异反映出不同培养方式下的发酵方式对细菌的自我繁殖能力存在显著差异。
培养方式编号 活菌数个/mL
1 3.2x10<sup>8</sup>CFU/mL
2 2.4x10<sup>7</sup>CFU/mL
3 5.6x10<sup>6</sup>CFU/mL
4 1.9x10<sup>5</sup>CFU/mL
5 9.8x10<sup>8</sup>CFU/mL
实施例2
按上述配方配制二级发酵培养基，置入三角瓶中进行高压湿热灭菌，在121℃，灭菌30min，取出冷却至室温。使用上述灭菌营养液，温度为30℃，pH7条件下硫自养反硝化细菌接种量为5％，进行摇床培养(60rpm/min)，分别在0h，8h，16h，24h，32h，40h，48h，56h，64h，72h取样测OD420，用未接种的灭菌营养液作为对照组。结果如图所示，表明：在本发明的培养基条件下细菌生长迅速，在16h内保持在延滞期，菌体数目略有增长，24h细菌进入对数生长期，在此阶段细菌大量繁殖。40h后菌种进入稳定期，稳定期能够维持较长时间，生长72h后，随着营养盐的消耗，细菌进入衰亡期。
实施例3
硫自养反硝化细菌的脱氮应用：
将上述发酵的发酵液投加于南京市六合区某生活污水处理泵站的自养脱氮装置中，该装置日处理污水300立方。将本发明的制剂投加入反硝化池中；初始投加量为100L，第5日投加50L，第10日投加50L，实时监测水质变化，记录亚硝酸盐及硝酸盐的含量。结果如下所示(见表2)：
表2 硫自养反硝化细菌处理生活污水总氮的的效果：
Figure BDA0003504876700000071
对照组(不加菌)：
Figure BDA0003504876700000072
由表可以得出结论，在投加该菌剂后，在第10天总氮去除率已经达到75.1％，而对照组虽然也出现总氮去除率的降低，但效果较差。
本发明的培养方法实现了硫自养反硝化细菌的高密度培养，经过连续接种和补料发酵其最终产品的活菌数为1×109CFU/ml，高于目前市场上大多数产品的活菌数，且培养周期较普通高密度培养周期缩短了。该培养方法，简单，选择性强，不易染杂菌，成本低，可实现工业化生产。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法，其特征在于，采用一级种子培养基、二级发酵培养基对菌种的连续接种培养和补料培养基的补料发酵，实现硫自养反硝化细菌的快速制备；
其中，一级种子培养基包括硝酸钠1g/L，碳酸氢钠2g/L，硫代硫酸钠2g/L，氯化镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.05-0.1g/L，氯化钠0.05g/L；
二级发酵培养基包括硝酸钠5-10g/L，碳酸氢钠10-15g/L，硫代硫酸钠1-2g/L，氯化镁0.5-1g/L，磷酸氢二钾1-2g/L，硫酸亚铁0.05-0.1g/L，硫酸锰0.05-0.1g/L，麸皮5-10g/L，椰壳粉1-5g/L，碳酸钙0.5-1g/L；
补料培养基包括硝酸钠10g/L，碳酸氢钠15g/L，硫代硫酸钠20g/L；
该方法具体包括如下步骤：
步骤1、培养基制备：按照所述一级种子培养基、二级发酵培养基和补料培养基的配方进行配制，在121℃，灭菌20-30min，备用；
步骤2、一级种子液培养：采集缺氧池的活性污泥，麸皮粉经过该活性污泥浸泡一周取出清洗，用一级种子培养基进行连续培养，培养过程中通过搅拌器连续搅拌24H，随后停止搅拌，待产生大量气泡，且麸皮粉漂浮为止，结束一级种子液的培养，得到一级种子培养液；
步骤3、二级发酵培养：向培养容器中加入步骤2中得到的一级种子培养液，按照一级种子培养液：二级发酵培养基＝50:1的比例进行接种，培养时间为24H，同时加以搅拌；
步骤4、补料培养：待二级发酵培养基培养24H后，对培养基进行第一次流加补料，补料培养基的补料体积为发酵液体积的10％左右，连续发酵10h后，进行第二次流加补料，补料培养基的补料体积为发酵液体积的5％左右，继续发酵培养8H结束，即得到硫自养反硝化细菌发酵液；
步骤5、细菌活菌数的检测：通过稀释涂布的方法对硫自养反硝化细菌发酵液细菌的浓度进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法，其特征在于，所述二级发酵培养基包括硝酸钠5g/L，碳酸氢钠10g/L，硫代硫酸钠1g/L，氯化镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.05g/L，麸皮5g/L，椰壳粉3g/L，碳酸钙0.5g/L。
3.根据权利要求1所述的一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法，其特征在于，在步骤2、3中，搅拌转速为60rpm/min。
4.根据权利要求1所述的一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法，其特征在于，在步骤2中，接种于一级种子培养基中进行连续培养的培养温度控制在25-30℃，pH值控制在6.5-7.5。
5.根据权利要求1所述的一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法，其特征在于，在步骤3中，接种于二级发酵培养基中进行连续培养的培养温度控制在30℃，溶解氧控制在0.5-1mg/l，pH值控制在6-8。
6.根据权利要求1所述的一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法，其特征在于，溶解氧的控制通过流加饱和亚硫酸钠溶液来控制，温度由反应器外部的控温夹套来稳定。
7.根据权利要求1所述的一种快速培养硫自养反硝化细菌的发酵方法，其特征在于，补料培养基在121℃条件下，灭菌20min处理。
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