CN107916238B - 一株百菌清高效降解菌及其在棚室土壤环境中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株可高效降解杀菌剂百菌清的降解菌BJ1及其在棚室环境下土壤中的应用，属于生物降解技术领域，该降解菌鉴定为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)，菌种保藏号为CCTCC NO：M2011475。该菌株是一株可以利用百菌清为唯一碳源的降解菌，在无机盐培养液中7天后对50mg/L的百菌清降解率可达93.2％。在高温高湿的棚室环境中，菌株BJ1的施入可以促进百菌清在土壤中的降解，降解速率可提高45.6％，且能显著降低百菌清诱导的土壤基因毒性。本发明主要用于土壤特别是棚室环境下土壤中百菌清残留的生物净化，降低百菌清对环境造成的危害，起到修复百菌清污染土壤，保护生态环境的作用。

Description

一株百菌清高效降解菌及其在棚室土壤环境中的应用
技术领域
本发明属于生物降解技术领域，涉及一株百菌清高效降解菌及其在棚室土壤环境中的应用。
背景技术
百菌清(Chlorothalonil)，化学名为2，4，5，6-四氯-1，3-苯二甲腈，分子式为C8Cl4N2，分子量为265.91。百菌清作为一种高效广谱氯代苯芳香族农用杀菌剂，广泛用于蔬菜、果树、水稻、小麦、棉花等多种作物，对霜霉病、白粉病、灰霉病、炭疽病等多种真菌病害具有良好的防治效果。在我国，百菌清年产量接近9000t，是使用第二多的杀菌剂。百菌清在环境中比较稳定，在农田土壤生态系统中半衰期长达6个月以上，同时由于其广泛使用，土壤中尤其是棚室土壤中检测到百菌清已有许多报道，且发现其能诱导土壤基因毒性的发生。另有研究表明，百菌清具有明显的蓄积毒性，对鸟类、鱼类及水生无脊椎动物毒性高，对大鼠肾脏具有致癌、致突变作用，对人及动物内分泌系统会产生干扰作用，美国环保署已将其列为潜在的致癌物质。鉴于百菌清在农田土壤生态系统中具有较长的半衰期以及对土壤生态系统健康具有潜在的威胁，其污染土壤的修复已成为科研工作者广泛关注的课题。
环境中的百菌清可以通过物理化学方法和生物修复方法进行降解修复，其中物理化学方法工程大，成本较高，且易造成二次污染，不适合面源污染的修复。生物修复方法具有高效安全，成本低及无二次污染等优点。在众多生物修复方法中，由于微生物广泛存在于土壤生态系统中，且可以将农药等有机污染物作为生长的营养源，对其进行分解，具有安全、效率高、廉价和无二次污染等特点，因此利用微生物进行有机物污染环境的修复具有非常广阔的应用前景。迄今为止，国内外已经报道筛选到多株高效降解百菌清的微生物，且多以细菌为主。已报道的可降解百菌清的菌株主要有蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、苍白杆菌(Ochrobactrum lupini)、黄杆菌(Flavobacterium)、微球菌 (Micrococcus)、阴沟肠杆菌(Enterobater cloacae)等。但是，关于本发明中利用微嗜酸寡养单胞菌Stenotrophomonas acidaminiphila对棚室环境下百菌清污染土壤的生物修复目前没有报道。本发明中所筛选的微嗜酸寡养单胞菌对用于棚室环境下百菌清污染土壤的生物修复，丰富百菌清生物降解微生物资源，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株菌株BJ1用于高效降解土壤中杀菌剂百菌清，该降解菌从土壤中分离获得，通过实验室定向诱导，能够以百菌清为唯一碳源，在偏酸且温度较高的土壤环境中能高效降解百菌清。本发明的另一目的是提供本发明降解菌BJ1的用途，其用途是降解棚室环境下土壤中杀菌剂百菌清。
本发明提供的降解菌株BJ1，根据形态学、生理生化以及16S rDNA基因序列同源性分析，鉴定为微嗜酸寡养单胞菌Stenotrophomonas acidaminiphila，于2011年12月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2011475。该菌为格兰氏阴性菌，不产芽孢，最适生长温度为30℃，单菌落成黄色，中央略凸起，不透明，镜检为杆状(0.4-0.5μm×0.2-0.3μm)。接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，淀粉水解阴性，柠檬酸盐利用呈阴性，可以用葡萄糖，不利用果糖、木糖、甘露糖、蔗糖和麦芽糖，当氯化钠浓度超过7％时生长缓慢。
通过对百菌清降解菌BJ1的降解特性研究发现：百菌清最适生长温度30℃，最适pH为6；在最佳温度和pH下，当将制备好的OD600在1.0的菌悬液按5％体积比接种到含50mg/L百菌清的无机盐培养基中，气相色谱法测定7d内百菌清残留可降低93.2％。
所描述无机盐培养基：NH4NO31.0g，K2HPO41.5g，KH2PO40.5g，NaCl 0.5 g，MgSO40.5g，(NH4)2SO40.5g，去离子水1L，用HCl调节pH值至6，121℃湿热灭菌20min。
菌悬液制备方法：将BJ1接种于30mL的LB培养基中，30℃，150rpm振荡培养24h，然后菌液8000rpm离心8min，沉淀用0.05M Na2HPO4/NaH2PO4(pH 7.0)缓冲液洗涤两次，并稀释到OD600值为1，备用。
该菌在棚室环境下的土壤中能很好的定殖，当将降解菌BJ1按107CFU/g接入到含20mg/kg百菌清的土壤中，与不接菌的对照相比百菌清的降解半衰期从 9.0d缩短至4.9d，降解速率提高了45.6％，且土壤悬液对蚕豆根尖细胞的基因毒性明显降低。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株适用于棚室环境下偏酸性土壤中具有降解百菌清能力的降解细菌BJ1；可通过直接投加或添加菌体发酵液应用于土壤中残留百菌清的降解；添加菌株BJ1于污染百菌清的土壤后，土壤基因毒性显著降低。含有该菌株的菌剂制备工艺简单、效率高、成本低、无二次污染，应用前景光明。
本发明提供的可高效降解百菌清的菌株的用途：该菌可高效降解农用杀菌剂百菌清，可用于大田特别是棚室环境下被百菌清污染土壤的生物净化。
附图说明
图1可以反映棚室环境下菌株BJ1在百菌清污染土壤中的定殖与土著微生物竞争共存的情况；
图2为百菌清在棚室环境下加菌与不加菌土壤中的残留消解动态情况；
图3为蚕豆根尖细胞微核实验结果，反映菌株BJ1对减轻百菌清诱导土壤基因毒性的效果。图中星号表示处理与对照之间的差异显著性(P<0.05)，双星号表示处理NC与NCB之间的差异显著性(P<0.05)。
具体实施方式
实施例1菌株BJ1在以百菌清为唯一碳源无机盐培养基中的生长及对百菌清的降解效果
配置OD600值为1的菌种母液，以体积比5％的接种量接种至含有50mg/L百菌清为唯一碳源的无机盐培养基中，装液量为30mL，初始pH值为6，培养温度为30℃，转速为180rpm/min，以不接菌为对照，每个处理设3个平行。培养1、3、5、7d后，气相色谱法检测培养液中百菌清的含量。结果表明，接种百菌清降解菌BJ1后，随着时间的推移百菌清在培养基中的残留量逐渐减少，7 d后百菌清残留量为3.4mg/L，降解率达到93.2％。(表一)
表一无机盐培养基中菌株BJ1对百菌清的降解效果
Figure BDA0001448238670000041
实施例2菌株BJ1在棚室环境中土壤的定殖
该实验在青岛农业大学农业示范园温室大棚中进行。所用土壤取自该示范园，为棕壤土，经气相色谱法检测土壤中未检出杀菌剂百菌清，理化性质为： pH，6.32；总有机碳，17.5g/kg；总氮，1.35g/kg；总磷，1.04g/kg。将过40目筛的土壤转入到3L的棕色花盆中，每个花盆中放入1.5kg土壤，共设置3个处理：不加农药和菌的土壤为对照(CK)、仅加农药不加菌的土壤(NC)、加农药和菌的土壤(NCB)。每个处理设3个平行，共计9个花盆。土壤中添加百菌清初始浓度为20mg/kg，土壤中加入菌株BJ1的量为107cfu/g土壤。将所有处理土壤置于温室大棚中培养，并隔天喷洒水分，保持土壤含水量在最大持水量的60％左右。分别于处理后7和14d提取土壤和菌BJ1中总DNA，以总DNA 为模板，GC-338F和518R为引物进行PCR扩增，扩增产物进行变性梯度凝胶电泳，分析菌BJ1在百菌清污染土壤中的定殖情况(图1)。通过图1可知，BJ1 在温室环境下土壤中能够很好的定殖，并随着时间的推移与土壤中土著微生物建立了良好的竞争关系。
实施例3棚室环境下菌株BJ1对土壤中百菌清的降解作用
土壤处理、百菌清添加浓度、菌BJ1添加量及其培养条件与实例2中NC和 NCB处理相同。处理后2h、3、7、10、14、21、28d分别取样利用气相色谱法检测土壤中百菌清的残留量。结果如图2所示，菌株添加到百菌清污染的土壤后，百菌清降解速率明显提高，降解半衰期从9.0d缩短至4.9d，降解效果较好。
实施例4菌株BJ1对土壤中百菌清毒性的去除效应
土壤处理、百菌清添加浓度、菌BJ1添加量及其培养条件与实例2中NC和 NCB处理相同。处理后7和14d分别测定不同处理土壤悬浮液对蚕豆根尖细胞微核率的影响。结果如图3所示，菌株BJ1添加到土壤7和14d后，蚕豆根尖细胞微核率与不添加菌株的处理相比显著降低，但到14d时，添加菌株BJ1的处理中蚕豆根尖细胞微核率已恢复至对照水平。这说明菌株添加到百菌清污染的土壤后，能显著降低百菌清诱发的土壤基因毒性。
综上所述，高效百菌清降解菌BJ1能在棚室环境下百菌清污染的土壤中成功定殖，且对百菌清降解具有明显的促进作用，明显降低百菌清对土壤和环境的危害。本发明主要针对棚室环境下土壤的应用展开研究，取得的成果对菌株 BJ1应用于棚室环境下土壤中百菌清的降解修复和土壤环境安全具有一定的积极意义和很好的应用前景。

Claims (1)

1.一株可降解杀菌剂百菌清的降解菌BJ1在土壤中降解百菌清的应用，所述降解菌BJ1分类名为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)，该菌株已于2011年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2011475，所述的百菌清降解菌BJ1可降解农用杀菌剂百菌清。
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