CN114874957B - 一株百菌清高效降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物降解技术领域，具体公开了一株百菌清高效降解菌，所述降解菌为Pseudomonas aeruginosa T1，该菌株已于2022年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2022386。本发明还提供了上述百菌清高效降解菌的应用。本发明提供的百菌清高效降解菌用于海南地区百菌清污染土壤的生物修复，对于丰富百菌清生物降解微生物资源具有十分重要的意义。

Description

一株百菌清高效降解菌及其应用

技术领域

本发明属于生物降解技术领域，尤其涉及一株百菌清高效降解菌及其应用。

背景技术

百菌清(Chlorothalonil)，别称四氯间苯二腈，是一种取代苯类广谱性杀真菌剂，主要用于果蔬上锈病、炭疽病、白粉病、霜霉病等的病害防治。百菌清的在农业上的广泛应用存在以下危害：

(1)在水体、土壤、果蔬农产品中均能检测到百菌清残留。

(2)百菌清在环境中残效期长，土壤中的半衰期最长可达到6个月(根据土壤理化性质不同而有所差异)。

(3)有研究表明，百菌清具有明显的蓄积毒性，可致动植物发生遗传性突变，对人和动物内分泌系统产生干扰作用，影响动物和人的生殖繁衍，对鱼类、鸟类和水生无脊椎动物有高毒性，对大鼠肾脏具有致癌、致突变作用，美国环保署已将其列为潜在的致癌物质。

(4)有研究指出4-羟基-2,4,5-三氯间苯二腈(TPN-OH)是百菌清在自然界中的主要代谢物质之一，毒性是母体的30倍，且持久性和移动性也远超母体，因此，百菌清的代谢毒性也越来越受到人们的关注。

综上，基于百菌清在环境中残效期长及其代谢毒性等问题，目前百菌清的污染修复工作是学者关注的重点。

通过物理化学方法和生物修复方法可以对环境中的百菌清进行降解修复，其中生物修复方法是一种公认的安全、有效、廉价和无二次污染的方法，具有广阔的应用前景。利用土壤微生物或酶进行污染修复是百菌清在环境中消解的主要途径。

目前，关于农药的微生物降解已有不少报道，包括一些降解性微生物的分离，对这些微生物上的降解性基因进行定位，详细地解析降解途径、降解机制。迄今为止，国内外已经报道筛选到多株高效降解百菌清的微生物，包括形杆菌(Proteus terrae)、瑞氏溶杆菌(Lysobacter ruishenii)、苍白杆菌 (Ochrobactrum lupini)、微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)等，但针对海南地区百菌清污染土壤的微生物，目前还未见到报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株百菌清高效降解菌及其应用，以解决上述技术问题之一。

为了达到上述目的，本发明目的之一在于提供：一株百菌清高效降解菌，所述降解菌为 Pseudomonas aeruginosa T1，该菌株已于2022年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国.武汉.武汉大学），保藏编号CCTCC NO：M2022386。

本发明目的之二在于提供：上述百菌清高效降解菌在海南地区土壤中降解百菌清的应用。

本发明的有益效果：

本发明中所筛选得到的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa T1用于海南地区百菌清污染土壤的高效生物修复，对于丰富百菌清生物降解微生物资源具有十分重要的意义。

附图说明

图1为菌株Pseudomonas aeruginosa T1生长曲线和降解曲线的关系；

图2为菌株Pseudomonas aeruginosa T1在平板培养基上的形态；

图3为菌株Pseudomonas aeruginosa T1在液体培养基上的颜色；

图4为百菌清在海南地区酸性土壤中的降解情况；

图5为菌株Pseudomonas aeruginosa T1在场发射扫描电子显微镜照片；

图6为菌株Pseudomonas aeruginosa T1 PCR图片；

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

1.1主要试验试剂

百菌清原药，纯度≥99.0％(德国Dr Ehrenstorfer公司)。

石油醚、正己烷(HPLC级，美国Fisher)；

氯化钠(分析纯，广州试剂公司)，其他无机试剂均为分析纯。

1.2培养基配方

LB培养基：酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1L，pH值7.0，高压蒸汽灭菌 121℃，20min。

无机盐培养基：MgSO₄·7H₂O 0.4g，FeSO₄·7H₂O 0.002g，KH₂PO₄ 0.2g，(NH₄)2SO₄0.2g，CaSO₄ 0.08g，蒸馏水1L，pH值7.0，高压蒸汽灭121℃，20min。

pH值7.0缓冲溶液：0.2mol/L Na₂HPO₄ 61mL；0.2mol/L NaH₂PO₄ 39mL；蒸馏水1L；高压蒸汽灭菌121℃，20min。

1.3实验方法

S1、驯化分离

1、第1次培养：从海南省农药厂(海南省海口市秀英区)的污水处理池周边土壤处采集活性污泥30g，将采集的活性污泥于含100mL无机盐培养基(含百菌清100mg/L)的250mL三角瓶中，30℃间歇振荡培养30d，每天振荡3次，每次30min。

2、第2次培养：吸取三角瓶中2mL土壤悬浮液于含100mL无机盐培养基(含百菌清100mg/L) 的250mL三角瓶中，30℃间歇振荡培养15d。

3、第3-5次培养：按上述方法再培养3次，百菌清浓度每次加倍增加。

4、将菌液在固体无机盐培养基(含百菌清50mg/L)上划线分离筛选。30℃培养2d后，挑选出单菌落接种于固体无机盐培养基(含百菌清50mg/L)上，经过几个周期的反复平板划线分离后，镜检得到纯化菌株T1。

S2、菌株降解实验

1、实验菌的培养与收集

接LB平板上单菌落T1于50mL LB培养基中(50mg/L百菌清)，150r/min，30℃振荡培养过夜， 9000g离心5min收集处于对数生长期的菌体，弃上清液，用2×30mL、pH值7.0缓冲液洗涤下层菌体，并悬浮于5mL同一缓冲液中备用。

2、降解菌的生长曲线及降解曲线的测定

100mL灭菌的三角瓶中加入20mL无机盐培养基，分别添加百菌清质量浓度至100mg/L，接种菌株Pseudomonas aeruginosa T1(菌浓度OD_600nm＝0.2，6.67×10⁶CFU/mL)，150r/min，30℃黑暗振荡培养，每一处理3个重复，同时设不加菌的对照处理，在0、3、6、9、12d进行取样测定，用OD_600nm处测定生长曲线。

菌株Pseudomonas aeruginosa T1接种于无机盐培养基，分别添加百菌清质量浓度至50mg/L， 30℃，150r/min摇床培养，定时取样测定菌体生长量及培养基中的农药质量浓度，结果如图1所示，菌株Pseudomonas aeruginosa T1的生长量逐步增加，在0～3d有一定的延缓，其后持续增长，在9～12 d之间趋于稳定(图1)。在菌株Pseudomonas aeruginosaT1处理中，百菌清的半衰期为3.73d，结果表明：菌株Pseudomonas aeruginosa T1对百菌清均有一定的降解能力，且其降解符合一级动力学方程(见表1)。

表1菌株Pseudomonas aeruginosa T1降解百菌清一级动力学参数

通过驯化分离得到Pseudomonas aeruginosa T1。

菌株Pseudomonas aeruginosa T1在LB平板上菌落的周围环状，呈金属光泽(图2)；在液体培养基培养过夜后呈绿色(图3)。

对菌株Pseudomonas aeruginosa T1进行革兰氏染色法鉴定，发现Pseudomonasaeruginosa T1通过革兰氏阴性反应呈红色，说明菌株Pseudomonas aeruginosa T1为革兰氏阴性细菌。在扫描电镜上显示为长1～2μm，宽0.3±0.1μm(图5)。

S3、为探讨菌株Pseudomonas aeruginosa T1的适应能力，开展土壤中的降解试验

采自中国热科院(儋州试验场基地)0-15cm的新鲜土样(土壤理化性质见表2)，去除杂草树根、石砾等杂质，过2mm筛，晾干备用。

取1500g(干重)土壤，考察温度、湿度、浓度对降解能力的影响，按照正交(表3)设计试验：

因子1表示温度，三水平为(20℃、30℃、40℃)；

因子2表示湿度，三水平为(田间最大持水量的40％、60％、80％)；

因子3表示百菌清浓度(10、25、50mg/L)。分别按照正交表相应浓度的百菌清，调节相应的田间最大持水量；

处理组(T1-9)(表3)加入降解菌(菌浓度约为6.67×10⁶CFU/g)，过筛(孔径2mm)2次，尽可能使降解菌及百菌清与土壤混匀，置于培养盆中，覆盖锡纸(留5个小孔通气)，在不同温度条件下黑暗培养。此处处理组(T1-9)中的“T”为“treatment”的缩写。

同时设置另外一组不投加降解菌的对照组(CK1-9)(表3)。处理和对照各为3个重复，分别在0、 3、6、9、12、15d取土壤样品。此处处理组(CK1-9)中的“CK”为“control check”的缩写。

表2.土壤理化性质

表3.正交设计表

表4.菌株在海南地区酸性土壤中降解百菌清的一级动力学参数

菌株对土壤中百菌清的降解活性试验在正交试验条件下进行，结果如图4和表4所示，其降解符合一级动力学方程，可应用于百菌清污染土壤的生物修复。在不加菌的对照组(CK1-9)中降解速率在0.01641～0.02994/d范围内，在加菌的处理组(T1-9)中降解速率在0.13258～0.22464/d范围内，处理组明显有加速百菌清降解的作用，其半衰期明显缩短。从半衰期来分析差异显著，T8的降解速率最高，说明在百菌清浓度为10mg/L，田间最大持水量的60％，在40℃条件下培养时，降解菌株能发挥最大作用，半衰期T_1/2(d)仅3.0856。

S4、Pseudomonas aeruginosa T1的总DNA提取、测序

采用细菌16S rDNA通用引物27f和1492r进行PCR扩增细菌的16S rDNA片段来对菌株 Pseudomonas aeruginosa T1的总DNA进行提取，提取和测序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

27f：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′；

1492r：5′-AAGGAGGTGA TCCAG CCGCA-3′。

菌株Pseudomonas aeruginosa T1质粒大小在1500～2000bp之间(图6)。

通过16S rDNA gene通用引物进行PCR扩增，最终得到约1.4bp的16S rDNA gene部分保守序列，测序结果在NCBI利用GenBank Blast软件进行序列同源性比对，表明菌株Pseudomonas aeruginosa T1 与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有高度同源性。

S7、无机盐培养基和土壤中添加回收率试验

无机盐培养基前处理：将S2三角瓶中的全部培养液转入50mL离心管中，用20mL乙腈振荡提取，取上清液1mL(根据情况稀释)供GC-MS/MS分析。GC-MS/MS是气相色谱串联质谱仪器，用于定量测定农药残留量的。

土壤前处理：取5g(干重)土壤于50mL离心管中，用25mL乙腈超声30min，加入萃取盐包(Agilent 公司，0.5g半水柠檬酸氢二钠、1g二水合柠檬酸三钠、1g NaCl、4g MgSO₄)震荡提取，取上清液 1mL(根据情况稀释)经有机系微孔滤膜过滤后，待GC-MS/MS分析。

添加回收率与精密度测定：分别称取3组空白样品(无机盐培养基、土壤)，每组5个重复。在空白样品中分别添加浓度水平为0.1、1、10、50、100mg/L的百菌清标准溶液，加标回收试验按照上述方法进行提取。根据试验回收率结果评价百菌清的检测方法是否符合农药残留分析要求。

1、测试条件：气相色谱三重四级杆串联质谱联用仪(ThermoScientifi Trace1310-TSQ 9000)。

2、分析条件：

毛细管气相色谱柱：TG-5SILMS(30m×0.25mm，0.25μm，Thermo公司)。

温度条件：初始温度100℃，以20℃/min升温至210℃，再以10℃/min升温至250℃，再以15℃/min 升温至300℃。

总运行时间：13min。

载气：氦气，纯度≥99.999％。

进样量：1μL。

进样口温度：280℃。

进样方式：不分流进样。

百菌清的保留时间6.86min。

表5.SRM模式下百菌清的检测条件

无机盐培养基和土壤中添加回收率试验表明，在0.1、1、10、50、100mg/L水平范围内，百菌清的添加回收率在75.8％～102.6％，变异系数<5.36，表明百菌清的检测方法符合农药残留分析要求。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一株百菌清高效降解菌，其特征在于，所述降解菌为Pseudomonas aeruginosa T1，该菌株已于2022年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2022386。

2.根据权利要求1所述的百菌清高效降解菌在土壤中降解百菌清的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述土壤为海南地区酸性土壤。

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