CN111172144A - 一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂及其在土壤污染修复中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂及其在土壤污染修复中的应用，该微生物菌剂为含有约氏不动杆菌AJ6菌悬液的固定化微生物菌剂。本发明公开的约氏不动杆菌AJ6菌株对土壤中和无机盐培养基中四环素的降解效果最好，其次是土霉素。本发明为抗生素污染修复提供了重要的微生物菌种资源，为能够根据主要抗生素残留类型、与介质原生微生物菌群兼容情况等具体应用情况选择不同的抗生素降解菌种提供可能。本发明利用固定化载体将菌体固定，快速、大量增殖微生物的技术，使微生物高度密集并保持生物活性，并延长菌体寿命。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂及其在土壤污染修复中的应用，属于环境污染物生物处理技术领域。
【背景技术】
由于其低成本，低毒性和理想的有效抗菌性，四环素类抗生素作为一种重要的广谱抗生素已被广泛应用于人类和动物疾病的预防和治疗，特别是用作水产养殖中和畜牧业的生长促进剂。已经证明，一旦进入细胞内，它们可逆地结合易感生物的30S核糖体亚基受体，阻止氨酰基转移酶与DNA结合，进而抑制蛋白质合成，阻止细胞生长。然而，大部分四环素类抗生素在人类和动物的人体中吸收较差，约30％-90％的抗生素剂量以活性形式(母体或代谢产物)随排泄物排出体外，释放到环境中。此外，由于缺乏有效的环境管理和及时、有效的降解或消除，不恰当或滥用四环素类抗生素导致环境中四环素类抗生素的大量残留，这不仅会导致生物受到慢性毒害，更会使得环境中微生物耐药性增强，产生各种抗性菌和抗性基因。抗性基因在环境中会发生转移进入其他生物体中，从而严重危害生态环境和人体健康。
由于其强大的结合能力，土壤被认为是各种污染物在环境中的最终归宿。据报道，污染物在土壤中的转移和转化是确定土壤环境中污染物命运的关键过程。因为一旦释放到环境中，抗生素的行为和转化将不仅取决于它们的物理化学性质，包括水溶性，挥发性，亲脂性和吸附能力，还取决于土壤性质，如pH，离子强度，有机物含量和阳离子交换容量和环境条件。然而，由于土壤成分的复杂性，土壤中污染物的转移和转化尚不清楚。
四环素类抗生素通过两个渠道进入农田，一是畜禽粪便和鱼塘污泥作为有机肥施用到农田，二是粪便中抗生素经雨水径流和养殖场废水排放等进入水体，并用于农田灌溉。土壤中长期大量累积的四环素类抗生素，导致土壤四环素类抗生素污染严重。因此，清除土壤中四环素类抗生素污染对生态环境和人体健康造成的危害已成为目前迫切需要解决的问题之一。
鉴于土壤中四环素类抗生素的污染对生态环境和人类健康的危害性与常规去除四环素类抗生素技术的局限性，人们迫切找到一种有效且经济的去除土壤四环素类抗生素的修复技术。虽然物理、化学的方法对有机污染物降解具有速度快、设备和方法简单等优点，但由于其相对成本高，处理效果不彻底产生次级降解产物二次污染环境的可能，所以实际应用起来比较困难。而生物修复技术的出现，为治理环境污染带来了希望。
生物修复技术是清除和治理环境污染的一种生物工程技术，主要利用生物特有的分解有毒和有害物质的能力，去除环境中污染物，达到净化的目的，是当前环境污染治理研究的热点之一。生物修复技术具有条件简单、容易控制、成本较低、专一性较强、降解彻底、无二次污染等特点，因此成为了现阶段处理抗生素污染的最理想的方法。然而，目标污染物的低生物利用度和艰难的的环境如缺乏营养物质，土著微生物的竞争，不利土壤条件的侵害和污染物对生物体的生长毒性将大大降低游离微生物降解污染物的效率。
微生物修复是一种公认的有效、安全、廉价和无二次污染的方法。而固定化微生物技术主要是指通过物理或化学的方法将分散游离的微生物固定在限定的空间区域，以提高微生物细胞的浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。固定化微生物由于具有微生物密度大、抗毒性强，对目标污染物毒性的耐受性高，目标污染物的去除效率高，比游离微生物更宽的温度和pH范围和耐环境冲击特点，因此，该技术有望克服投加到修复现场中的游离高效降解微生物与土著菌的恶性竞争或难以适应环境的问题，实现高效降解菌有效修复污染土壤。此外，固定化微生物技术利用载体材料提供的有利微环境作为缓冲体系，屏蔽土著微生物的竞争作用和不利土壤条件的侵害作用，从而保证接种的高效降解微生物的良好生长；同时固定化载体作为吸附剂还可以有效地富集土壤中的四环素类抗生素，提高其在载体上的生物有效浓度；此外微生物及其分泌的胞外酶也被富集固定在载体上，增加了与高效降解微生物的接触效率，实现高效降解菌有效修复污染土壤。为此固定化微生物修复有机污染土壤正受到越来越多的关注。但是有关四环素类抗生素微生物降解的报道并不多，如研究表明人苍白杆菌、氨基杆菌、蜡状芽抱杆菌、黄抱原毛平革菌和乙酸钙不动杆菌等对土霉素等四环素类抗生素具有较好的降解作用。但是，目前发现的土霉素降解菌株还比较少，而且利用微生物实现对抗生素进行降解，机理比较复杂。目前未见约氏不动杆菌Acinetobacter johnsonii降解土壤中土霉素等四环素类抗生素的报道。
目前报道的四环素降解微生物种类仍然较少，函需补充新的菌种资源，且现有菌种的应用方法略显单一，降解效率难再提高。因此，开展土霉素等四环素类抗生素污染微生物修复技术研究，筛选不同类型的土霉素等四环素类抗生素的高效降解微生物菌株，扩大抗生素降解微生物菌种库是必不可少，可为减低水土壤中四环素类抗生素残留提供有效手段，为农田土壤环境安全提供技术支持。
【发明内容】
本发明目的是为了克服现有技术的不足，提供一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂，以有效降解土壤中残留的多种四环素类抗生素，减轻对环境的污染。
本发明的另一目的是提供上述微生物菌剂在土壤四环素类抗生素污染修复中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂，其特征在于所述微生物菌剂为含有约氏不动杆菌AJ6菌悬液的固定化微生物菌剂。
本发明中的约氏不动杆菌AJ6菌悬液通过以下方法制备：
将约氏不动杆菌AJ6活化后，接种于固体培养基中，并于28℃的恒温恒湿培养箱培养48h至微生物的生物量达到最大，然后用无菌生理盐水将细菌冲洗下来配制成OD600为0.5±0.01的菌悬液。
本发明中的固定化微生物菌剂通过以下方法制备：
将已洗净烘干磨碎的载体灭菌处理后加入无菌无机盐培养基，再加入约氏不动杆菌AJ6的菌悬液作为接种液接种，混匀密封后于28℃恒温恒湿培养箱培养至生物量最大而制得固定化微生物菌剂。
一般培养3天即可达到微生物生物量最大，表象为生物质载体长满菌即可。
本发明中固定化微生物的载体为甘蔗渣、花生壳和稻草杆中的一种或几种。当载体为甘蔗渣时，无机盐培养基与处理过的甘蔗渣的用量比为7.5mL：1g。
优选地，固定化微生物的载体为甘蔗渣，接种的菌悬液OD600为0.5±0.01，所述菌悬液与处理过的甘蔗渣的用量比为3.5mL：1g。
本发明中约氏不动杆菌AJ6菌株通过以下步骤得到：
a、四环素类抗生素耐受菌的筛选、驯化：用土霉素筛选培养基从猪粪样品的菌悬液中筛选菌种并富集培养驯化获得耐受菌株；
b、四环素类抗生素降解菌的分离和纯化：将驯化获得的耐受菌株采用平板涂布法和平板划线法进行菌株的分离与纯化获得单一菌株，
c、将分离纯化的每一单一菌株接种到含四环素类抗生素唯一碳源的无机盐培养基中进行降解实验筛选获得降解能力最强的菌株，即为约氏不动杆菌。
本发明步骤a中筛选培养基中土霉素的浓度依次是10mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L，每个浓度转接6次。猪粪样品采集于广州某良种猪场。
本发明步骤c中的四环素类抗生素分别为土霉素和四环素。
本发明中的筛选培养基组成：K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO4 0.2g，NH4NO3 1.0g，微量元素溶液10mL，蒸馏水1000mL，pH7.2，四环素类抗生素按实验需要量加入。
本发明中的液体培养基组成：K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO4 0.2g，NH4NO3 1.0g，微量元素溶液10mL，蒸馏水1000mL，pH 7.2，四环素类抗生素按实验需要量加入。固体培养基需加20-25g琼脂。
无机盐培养基：K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO4 0.2g，NH4NO3 1.0g，微量元素溶液10mL，蒸馏水1000mL，pH7.2。
微量元素溶液：FeSO4 0.1g/L，MnSO4 0.1g/L，ZnSO4 0.1g/L，Na2MoO4 0.01g/L，CaCl2 0.1g/L，MgSO4 3g/L，CuSO4 0.1g/L。
生理盐水：0.9％的氯化钠溶液，可维持细胞的正常形态。
本发明中各种实验材料实验前必须置于1.5Mpa，120℃的高压灭菌锅中灭菌30min。
本发明中四环素类抗生素降解菌的鉴定，将本发明中筛选获得的降解能力较好生长性能稳定的四环素类抗生素降解菌作为目标菌侏，编号为OTC-6，经过DNA提取，PCR扩增，序列测序及序列对比，菌OTC-6的16SrDNA序列与约氏不动杆菌Acinetobacter johnsonii的同源性达到99％以上，亲缘关系最近。即为约氏不动杆菌Acinetobacter johnsonii 6菌株，简称约氏不动杆菌AJ6。
一种上述微生物菌剂在四环素类抗生素污染土壤修复中的应用，其特征在于所述微生物菌剂的用量为以蔗渣载体1重量份处理其10倍重量份的污染土壤。
与现有技术相比，本发明有如下优点：
在现有技术中，并未见约氏不动杆菌AJ6能够高效降解土壤中四环素类抗生素的报道。本发明公开的约氏不动杆菌AJ6菌株对土壤中和无机盐培养基中四环素的降解效果最好，其次是土霉素。与现有技术相比，本发明公开的菌株的分类种属、降解底物类型以及抗生素降解效率均不同，为抗生素污染修复提供了重要的微生物菌种资源，为能够根据主要抗生素残留类型、与介质原生微生物菌群兼容情况等具体应用情况选择不同的抗生素降解菌种提供可能。
现有技术中未见甘蔗渣固定化约氏不动杆菌AJ6能够高效降解土壤中四环素类抗生素的报道，其对土壤中四环素的降解效果最好，处理一个月降解率高达80.32％，其次是土霉素，处理一个月降解率达78.07％。本发明固定化微生物菌剂所用载体生物质材料甘蔗渣成本低，固定化微生物菌修复土壤四环素类抗生素土霉素和四环素污染安全有效、环保无害、绿色廉价，不会造成二次污染，同时可提高四环素类抗生素的生物可利用性，进而提高微生物降解四环素类抗生素的效率。
本发明微生物菌剂能够有效去除水体和土壤等不同环境介质中的四环素类抗生素污染，与物理吸附和化学降解等方法相比，具有高效节能和环保等优点。本发明利用固定化载体将菌体固定，快速、大量增殖微生物的技术，使微生物高度密集并保持生物活性，并延长菌体寿命。本发明对消除水体和土壤中四环素类抗生素污染，避免四环素类抗生素污染通过食物链的传递对人类健康构成的威胁有着十分重要的意义。
【附图说明】
图1为固定化微生物菌剂和微生物菌剂悬液降解土壤中土霉素的效果图；
图2为固定化微生物菌剂和微生物菌剂悬液降解土壤中四环素的效果图；
图3为非灭菌和灭菌土壤对固定化微生物菌剂降解土壤中土霉素的影响；
图4为非灭菌和灭菌土壤对固定化微生物菌剂降解土壤中四环素的影响；
图5为重金属离子Pb2和Cd2+对固定化微生物菌剂降解土壤中土霉素的影响；
图6为重金属离子Pb2和Cd2+对固定化微生物菌剂降解土壤中四环素的影响；
其中，图1中各条曲线代表的意义为：
—■—对照处理(不加菌)
—●—固定化微生物菌剂处理土壤中土霉素的降解率
—▲—微生物菌剂悬液处理土壤中土霉素的降解率
图2中各条曲线代表的意义为：
—■—对照处理(不加菌)
—●—固定化微生物菌剂处理土壤中四环素的降解率
—▲—微生物菌剂悬液处理土壤中四环素的降解率
图3中各条曲线代表的意义为：
—■—非灭菌土对照处理(不加菌)
—●—灭菌土对照处理(不加菌)
—▲—非灭菌土固定化微生物菌剂处理土壤中土霉素的降解率
—▼—灭菌土固定化微生物菌剂处理土壤中土霉素的降解率
图4中各条曲线代表的意义为：
—■—非灭菌土对照处理(不加菌)
—●—灭菌土对照处理(不加菌)
—▲—非灭菌土固定化微生物菌剂处理土壤中四环素的降解率
—▼—灭菌土固定化微生物菌剂处理土壤中四环素的降解率
图5中各条曲线代表的意义为：
—■—对照处理(不加菌)
—●—固定化微生物菌剂处理土壤中土霉素的降解率
—▲—Pb2++固定化微生物菌剂处理土壤中土霉素的降解率
—▼—Cd2++固定化微生物菌剂处理土壤中土霉素的降解率
图6中各条曲线代表的意义为：
—■—对照处理(不加菌)
—●—固定化微生物菌剂处理土壤中四环素的降解率
—▲—Pb2++固定化微生物菌剂处理土壤中四环素的降解率
—▼—Cd2++固定化微生物菌剂处理土壤中四环素的降解率。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：
一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂，为含有约氏不动杆菌AJ6菌悬液的固定化微生物菌剂。本发明微生物菌剂的制备方法为：
1.将约氏不动杆菌AJ6活化后，接种于固体培养基中，并于28℃的恒温恒湿培养箱培养48h至微生物的生物量达到最大，然后用无菌生理盐水将细菌冲洗下来配制成OD600为0.5±0.01的菌悬液；
2.将已洗净烘干磨碎的载体灭菌处理后加入无菌无机盐培养基，再加入约氏不动杆菌AJ6的菌悬液作为接种液接种，混匀密封后于28℃恒温恒湿培养箱培养至生物量最大而制得固定化微生物菌剂。
本发明中约氏不动杆菌AJ6由猪粪中筛选、驯化得到，具体步骤如下：
a、用土霉素筛选培养基从猪粪样品的菌悬液中筛选菌种并富集培养驯化获得四环素类抗生素耐受菌株：
取1.5g左右的猪粪样品于含有玻璃珠的100mL无菌水中振荡使样品和水充分混合，打散猪粪颗粒，将细胞分散形成均匀的菌悬液，将菌悬液接种到含有10mg/L土霉素的半凝固状态筛选培养基中，于28℃恒温培养箱中进行恒温培养7d，定时每两天观察筛菌情况，将筛得的菌转接于固体富集培养基中，以土霉素10mg/L的浓度转接6次，以使其中的土霉素降解菌在数量上占有绝对优势，接着以土霉素浓度依次是50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L的筛选培养基在相同培养条件下继续培养驯化，每个浓度转接6次，以最终获得可以耐受并降解较高浓度土霉素的微生物菌株；
b、将驯化获得的耐受菌株采用平板涂布法和平板划线法进行菌株的分离与纯化：将耐受菌株用生理盐水洗至液体培养基中制成耐受菌培养液，取适量耐受菌培养液，用无菌水分别稀释至10-4、10-5、10-6和10-7的稀释液，然后分别进行平板涂布培养，培养条件是28℃恒温培养箱，48h后待培养基长出菌落后，从平板上挑取单菌落进行下一步划线分离培养，利用划线法转接培养6次，菌株得以纯化，最终获得单一菌株；
c、将分离纯化的每一单一菌株接种到含四环素类抗生素唯一碳源的无机盐培养基中进行降解实验筛选获得降解能力最强的菌株，即为目标菌株。
本发明中的四环素类抗生素降解能力测试方法为：
将纯化后的每一单一菌株接种于固体培养基中，并将于28℃的恒温恒湿培养箱培养48h至微生物的生物量达到最大，然后用无菌生理盐水将细菌冲洗下来制成OD600为0.5±0.01的菌体悬液作为接种液，将接种液接种至分别以250mg/L土霉素和四环素为唯一碳源的无机盐培养基中，其中每100mL无机盐培养基投菌量为1ml/L，置于28℃，摇床转速为160rpm条件下避光培养，设置3个平行样，定时取样检测四环素类抗生素降解的残留量。
根据检测结果可知，编号为OTC-6菌株对四环素类抗生素降的具有最强的降解能力，在5d内对250mg/L四环素去除效率最高，达到99.12％，其次是土霉素，去除率为95.46％。
最后筛选获得编号为OTC-6的降解能力较好生长性能稳定的四环素类抗生素降解菌作为目标菌株。
本发明中，筛选培养基组成：K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO4 0.2g，NH4NO3 1.0g，微量元素溶液10mL，蒸馏水1000mL，pH7.2，四环素类抗生素按实验需要量加入。
液体培养基组成：K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO4 0.2g，NH4NO31.0g，微量元素溶液10mL，蒸馏水1000mL，pH 7.2，四环素类抗生素按实验需要量加入。固体培养基需加20-25g琼脂。
无机盐培养基：K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO4 0.2g，NH4NO3 1.0g，微量元素溶液10mL，蒸馏水1000mL，pH7.2。
微量元素溶液：FeSO4 0.1g/L，MnSO4 0.1g/L，ZnSO4 0.1g/L，Na2MoO4 0.01g/L，CaCl2 0.1g/L，MgSO4 3g/L，CuSO4 0.1g/L。
生理盐水：0.9％的氯化钠溶液，可维持细胞的正常形态。
本发明中各种实验材料实验前必须置于1.5Mpa，120℃的高压灭菌锅中灭菌30min。
四环素类抗生素降解工程菌(目标菌株OTC-6)的鉴定。
菌株OTC-6的分子鉴定:菌株OTC-6的分子鉴定委托广州天一辉远基因科技有限公司进行。经过DNA提取，PCR扩增，序列测序及序列对比，菌OTC-6的16SrDNA序列与约氏不动杆菌Acinetobacter johnsonii的同源性达到99％以上，亲缘关系最近，简称约氏不动杆菌AJ6。
实施例1：约氏不动杆菌AJ6微生物菌剂对土壤中土霉素的耐受和土霉素污染土壤的修复试验
将约氏不动杆菌AJ6活化后，接种于固体培养基中，并将于28℃的恒温恒湿培养箱培养48h至微生物的生物量达到最大，然后用无菌生理盐水分别将细菌冲洗下来制成OD600为0.5±0.01菌悬液作为接种液。
供试赤红壤取自华南农业大学树木园，其质地为粉沙质土壤，pH值(水/土＝2.5/1)为4.52，有机质为0.57g/kg，含水率为0.85％，氮、磷、钾为别0.71g/kg、0.72g/kg、2.61g/kg，土霉素未检出，过2mm筛；在100g过2mm筛的土壤中加入溶解于甲醇的土霉素溶液，搅拌均匀，室内风干后再与900g过2mm筛的土壤混合均匀，即制得人工模拟土霉素污染土壤。暗箱培养污染土壤4周，实验前测定污染土壤中土霉素的初始浓度为100.12mg/kg。
甘蔗渣固定化微生物体系的制备：称取已洗净烘干磨碎甘蔗渣1g于100mL烧杯中，每组平行三个，同时准备空的100mL烧杯用作游离微生物的培养，烧杯灭菌冷却到室温，然后于每个烧杯中各加入7.5mL无菌的无机盐培养基和3.5mLAJ6菌接种液，混匀密封贴标后置于28℃的恒温恒湿的培养箱中培养，3天后分别加入10g土霉素污染土壤进行修复实验。
土霉素污染土壤修复试验设置以下2种处理：
处理1：对照处理(不加菌)；
处理2-1：固定化微生物菌剂处理(甘蔗渣1g+3.5mL AJ6接种液)；
处理2-2：微生物菌剂悬液处理(加3.5mL AJ6接种液)。
每种处理下有21个烧杯，分别于第0、5、10、15、20、25和30d取样测定土霉素的残留量，每种处理设置3个平行。试验中通过加入7.5ml无菌的无机盐培养基，保持各处理中受试土壤的含水率为50％左右。处理结束后，根据所测定的各处理污染土壤中土霉素的残留量并计算土霉素的降解率。
对于同等土霉素污染水平的土壤，处理30d后，土霉素的降解率在对照处理(不加菌)、固定化微生物菌剂和微生物菌剂悬液处理中分别为：4.99％，78.07％和61.20％(见图1)。实验结果表明，AJ6菌株可耐受土霉素，且对土霉素有高效的降解活性。以不加菌对照为参比，固定化微生物菌剂的土霉素的降解率提高了73.08％，比微生物菌剂悬液的土霉素的降解率高出了16.87％，这说明固定化微生物菌剂对土壤中土霉素的降解效果大大优于微生物菌剂悬液。
实施例2：微生物菌剂对土壤中其他四环素类抗生素(如四环素)的耐受和其他四环素类抗生素污染土壤的修复试验
将约氏不动杆菌AJ6活化后，接种于固体培养基中，并将于28℃的恒温恒湿培养箱培养48h至微生物的生物量达到最大，然后用无菌生理盐水分别将细菌冲洗下来制成OD600为0.5±0.01菌悬液作为接种液。
供试赤红壤取自华南农业大学树木园，其质地为粉沙质土壤，pH值(水/土＝2.5/1)为4.52，有机质为0.57g/kg，含水率为0.85％，氮、磷、钾为别0.71g/kg、0.72g/kg、2.61g/kg，四环素未检出，过2mm筛；在100g过2mm筛的土壤中加入溶解于丙酮的四环素溶液，搅拌均匀，室内风干后再与900g过2mm筛的土壤混合均匀，即制得人工模拟四环素污染土壤。暗箱培养污染土壤4周，实验前测定污染土壤中土霉素的初始浓度为83.25mg/kg。
甘蔗渣固定化微生物体系的制备：称取已洗净烘干磨碎的甘蔗渣1g于100mL烧杯中，每组平行三个，同时准备空的100mL烧杯用作游离微生物的培养，将烧杯灭菌冷却到室温，然后于每个烧杯中各加入7.5mL无菌的无机盐培养基和3.5mLAJ6接种液，混匀密封贴标后置于28℃的恒温恒湿的培养箱中培养，3d后分别加入10g四环素污染土壤进行修复实验。
四环素污染土壤修复试验设置以下2种处理：
处理1：对照处理(不加菌)，
处理2-1：固定化微生物菌剂处理(甘蔗渣1g+3.5mL AJ6接种液)，处理2-2：微生物菌剂悬液处理(加3.5mL AJ6接种液)。
每种处理下有21个烧杯，分别于第0、5、10、15、20、25和30d取样测定四环素的残留量，每种处理设置3个平行。试验中通过加入7.5ml无菌的无机盐培养基，保持各处理中受试土壤的含水率为50％左右。处理结束后，根据所测定的各处理污染土壤中四环素的残留量并计算四环素的降解率。
对于同等四环素污染水平的土壤，处理30d后，四环素的降解率在对照处理(不加菌)、固定化微生物菌剂处理和微生物菌剂悬液处理中分别为：5.40％，80.32％和66.59％(见图2)。实验结果表明，AJ6菌株也可耐受其他四环素类抗生素，且对其他四环素类抗生素也有高效的降解活性。相比于不加菌对照组，固定化微生物菌剂的四环素的降解率高出了74.92％，比微生物菌剂悬液的四环素的降解率高出了13.73％，这说明固定化微生物菌剂对土壤中其他四环素抗生素的降解效果大大优于微生物菌剂悬液。
基于固定化微生物菌剂和微生物菌剂悬液降解土壤中土霉素和四环素的效果比较的结果可知，固定化微生物菌剂修复四环素类抗生素污染土壤的效果优于微生物菌剂悬液。
实施例3：非灭菌和灭菌土壤的影响试验
接种液制备同实施例1，各处理所加菌均为固定化微生物菌剂，供试土壤和甘蔗渣固定化微生物体系的制备同实施例1和实施例2，实验前测定污染土壤中的土霉素和四环素的初始浓度为100.12mg/kg和83.25mg/kg。
本实施例设置以下4个处理：
处理1：非灭菌土对照处理(不加菌)，
处理2：灭菌土对照处理(不加菌)，
处理3：非灭菌土加固定化微生物菌剂处理，
处理4：灭菌土加固定化微生物菌剂处理。
每种处理下有21个烧杯，分别于第0、5、10、15、20、25和30d取样测定土霉素和四环素的残留量，每种处理3个平行。试验中保持各处理中受试土壤的含水率为50％左右。处理结束后，测定各处理污染土壤中土霉素和四环素的残留量并计算土霉素和四环素的降解率。
对于同等土霉素污染水平的土壤，无论土壤灭菌与否加菌处理前15d，土霉素的降解率迅速增加，15d后土霉素的降解率缓慢增大(见图3)。加入固定化微生物菌剂处理30d后，不管土壤是否灭菌，土壤中土霉素的降解率相差很小，非灭菌土中土霉素的降解率达到78.07％，高于灭菌土中土霉素的降解率75.45％，由此可见，土壤中土著微生物对固定化微生物菌剂降解土壤中的土霉素的影响较小。
对于同等四环素污染水平的土壤，无论土壤灭菌与否加菌处理前15d，四环素的降解率迅速增加，15d后四环素的降解率缓慢增大，25d后降解率变化趋于平缓(见图4)。加入固定化微生物菌剂处理30d后，不管土壤是否灭菌，土壤中四环素的降解率相差很小，非灭菌土中四环素的降解率达到80.32％，略高于灭菌土中四环素的降解率77.15％，由此可见，土壤中土著微生物对固定化微生物菌剂降解土壤中的四环素的影响较小。
实施例5：土壤中重金属离子Pb2+和Cd2+的影响实验
接种液制备同实施例1，各处理所加菌均固定化微生物菌剂，供试土壤和甘蔗渣固定化微生物体系的制备同实施例1和例2，此外设置两个不同土壤环境，设置Pb2+和Cd2+浓度分别为291.3mg/kg、131.4mg/kg，实验前测定污染土壤中的土霉素和四环素的初始浓度为100.12mg/kg和83.25mg/kg。
本实施例设置以下4个处理：
处理1：对照处理(不加菌)，
处理2：加固定化微生物菌剂处理，
处理3：Pb2++加固定化微生物菌剂处理(Pb2++固定化微生物菌剂(1ml：1g))，
处理4：Cd2++加固定化微生物菌剂处理(Cd2++固定化微生物菌剂(1ml：1g))。
每种处理下有21个烧杯，分别于第0、5、10、15、20、25和30d取样测定土霉素和四环素的残留量，每种处理3个平行，试验中保持各处理中受试土壤的含水率为50％左右。处理结束后，测定各处理污染土壤中土霉素和四环素的残留量并计算土霉素和四环素的降解率。
土壤中重金属离子Pb2+和Cd2+的存在对固定化微生物菌剂修复土霉素和四环素污染土壤均有一定的影响。
由图5可见，对于同等土霉素污染水平的土壤，加入固定化微生物菌剂处理30d后，无重金属离子加菌处理、Pb2++加菌处理和Cd2++加菌处理降解率分别为78.07％、75.44％和74.08％，Pb2+存在时土壤中土霉素的降解率较无Pb2+存在时的降解率降低了2.63％，Cd2+存在时土壤中土霉素的降解率较无Cd2+存在时的降解率降低了3.99％，即便土壤中存在重金属离子Pb2+和Cd2+，固定化微生物菌剂对土壤中土霉素的降解率仍可达到74％以上，仅仅比无Pb2+和Cd2+存在低了4％，可见重金属离子Pb2+和Cd2+对固定化微生物菌剂降解土壤中土霉素影响比较小，固定化微生物菌剂具有较好的环境适应能力。
由图6可见，对于同等四环素污染水平的土壤，加入固定化微生物菌剂处理30d后，无重金属离子加菌处理、Pb2++加菌处理和Cd2++加菌处理降解率分别为80.32％、76.02％和76.90％，Pb2+存在时土壤中四环素的降解率较无Pb2+存在时的降解率降低了4.30％，Cd2+存在时土壤中四环素的降解率较无Cd2+存在时的降解率降低了3.42％，即便土壤中存在重金属离子Pb2+和Cd2+，固定化微生物菌剂对土壤中四环素的降解率仍可达到76％以上，仅仅比无Pb2+和Cd2+存在低了4％，可见重金属离子Pb2+和Cd2+对固定化微生物菌剂降解土壤中四环素的影响比较小，固定化微生物菌剂具有较好的环境适应能力。
本发明中以甘蔗渣为载体，构建高效稳定的生物质材料固定化微生物体系。本发明生物质材料甘蔗渣固定化微生物菌剂是一种微生物密度大、抗毒性强，对目标污染物毒性的耐受性高，目标污染物的去除效率高，比游离微生物具有更宽的温度和pH范围和耐环境冲击的微生物菌剂。其生物质载体不仅可以屏蔽土著微生物的竞争和克服对微生物存活构成严重威胁的不利土壤环境条件，从而保证接种的高效降解微生物的良好生长，进而提高引入的微生物的存活率和活性，还可吸附富集土壤中的四环素类抗生素污染物，从而增加四环素类抗生素的生物可利用性，提高固定在其表面上的微生物降解四环素类抗生素的效率。生物质材料甘蔗渣是农业废弃物，具有多孔性质、机械强度高、含有丰富的C、N等营养元素；能够提供必需的有机物和营养物以支持微生物生长；可向土壤释放天然有机质，改善土壤理化性质，促进土壤微生物存活率和活性，增强四环素类抗生素的去除；对微生物有很高的亲和性；在土壤中可自然降解、易于处理、简单环保，不会造成二次污染；且价格低廉易得。在本发明中，将筛选出来的降解工程菌约氏不动杆菌Acinetobacter johnsonii(AJ6)固定在甘蔗渣载体上可以使得微生物能够快速、大量增殖，同时给微生物提供一个良好的生长微环境，从而能够高效降解土壤中的四环素类抗生素。
Claims (10)
1.一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂，其特征在于所述微生物菌剂为含有约氏不动杆菌AJ6菌悬液的固定化微生物菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂，其特征在于所述的菌悬液通过以下方法制备：
将约氏不动杆菌AJ6活化后，接种于固体培养基中，并于28℃的恒温恒湿培养箱培养48h至微生物的生物量达到最大，然后用无菌生理盐水将细菌冲洗下来配制成OD600为0.5±0.01的菌悬液。
3.根据权利要求1或2所述的一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂，其特征在于所述的固定化微生物菌剂通过以下方法制备：
将已洗净烘干磨碎的载体灭菌处理后加入无菌无机盐培养基，再加入约氏不动杆菌AJ6的菌悬液作为接种液接种，混匀密封后于28℃恒温恒湿培养箱培养至生物量最大而制得固定化微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂，其特征在于所述的载体为甘蔗渣、花生壳和稻草杆中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂，其特征在于所述载体为甘蔗渣时，所述无机盐培养基与处理过的甘蔗渣的用量比为7.5mL：1g。
6.根据权利要求4或5所述的一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂，其特征在于接种的菌悬液OD600为0.5±0.01，所述菌悬液与处理过的甘蔗渣的用量比为3.5mL：1g。
7.根据权利要求1所述的一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂，其特征在于所述约氏不动杆菌AJ6菌株通过以下步骤得到：
a、四环素类抗生素耐受菌的筛选、驯化：用土霉素筛选培养基从猪粪样品的菌悬液中筛选菌种并富集培养驯化获得耐受菌株；
b、四环素类抗生素降解菌的分离和纯化：将驯化获得的耐受菌株采用平板涂布法和平板划线法进行菌株的分离与纯化获得单一菌株；
c、将分离纯化的每一单一菌株接种到含四环素类抗生素唯一碳源的无机盐培养基中进行降解实验筛选获得降解能力最强的菌株，即为约氏不动杆菌AJ6。
8.根据权利要求7所述的一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂，其特征在于所述步骤a中筛选培养基中土霉素的浓度依次是10mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L，每个浓度转接6次。
9.根据权利要求7所述的一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂，其特征在于所述步骤c中的四环素类抗生素分别为土霉素和四环素。
10.一种权利要求1所述降解四环素类抗生素的微生物菌剂在土壤污染修复中的应用，其特征在于所述微生物菌剂的用量为以蔗渣载体1重量份处理其10倍重量份的污染土壤。
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