CN102527712B - 硝基酚同分异构体污染环境的原位微生物修复方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用微生物混合菌群对硝基酚同分异构体污染环境的原位修复方法及应用。其步骤是：A、微生物混合菌群的构建：a.配制无机盐培养基：b.菌种的诱导培养c.菌体的收集；B、不同微环境模型的构建：a．土壤微环境模型的构建：b．生物反应器的制备：C、土壤样品置于30℃，生物反应器置于室温，定时取样检测污染物浓度变化。本发明可以实现40ppm硝基酚每毫克干重土壤的原位修复，以及50毫克每升生物反应器中三种硝基酚的生物修复，并且几种接入菌都可以在土壤和反应器中持续稳定的存在，证明了此种修复方法可以应用到含有硝基酚同分异构体污染的土壤、水体的环境治理中，为环境污染物的治理提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及环境有机污染物治理技术领域，具体涉及一种利用微生物进行有机污染物的生物修复的方法。更具体涉及利用Alcaligenes sp.NyZ215，Cupriavidus necator JMP134和Pseudomonas sp.WBC-3三种菌株组成混合菌群在三种硝基酚同分异构体污染环境中进行原位生物修复，同时还涉及微生物降解菌群在硝基酚同分异构体原位生物修复中的用途，达到有效去除污染物的目的。
背景技术
硝基酚(nitrophenols)属于硝基类芳香烃化合物，包括3个同分异构体：4-硝基酚(对硝基酚，p-nitrophenol，PNP)、3-硝基酚(间硝基酚，m-nitrophenol，MNP)和2-硝基酚(邻硝基酚，o-nitrophenol，ONP)，它们都是重要的化工原料，常作为医药、染料、农药等的合成前体，还广泛应用于光化学品生产过程中和用作生化检测试剂。硝基酚在环境中稳定，水溶性较高，而且自然条件下难以降解，它可抑制许多生物学机能，影响人体物质代谢，危害人类健康，是重要的环境污染物质之一，其中邻、对硝基酚被美国环境保护署(USEPA)列为优先环境污染物(Priority Pollutant List)。
生物增强(bioaugmentation)跟传统的化学、物理修复相比有很大的优势，最根本特点是消除污染物而不是分离转移污染物，从而在根本上解决环境问题，被誉为21世纪治理环境污染的优选技术，具有广泛的发展和应用前景。有关对硝基酚(PNP)在土壤中的生物修复有一些相应的报道，对于邻硝基酚(ONP)和间硝基酚(MNP)的土壤原位生物修复目前没有相关报道，更没有有关同时降解土壤中存在的三种硝基酚同分异构体的生物修复的报道。
在以前相关的报道中，菌株Alcaligenes sp.NyZ215(Xiao Y et al.，2007，J.Bacteriol.189：6587-6593)，Cupriavidus necator JMP134(Yin Y et al.，ApplMicrobiol and Biotechnol，2010，87：2077-2085)，Pseudomonas sp.WBC-3(Zhang JJ et al.，J Bacteriol，2009，191：2703-2710)是分别能以2-硝基酚、3-硝基酚和4-硝基酚为唯一碳、氮、能源生长的微生物。其中WBC-3菌株通过对苯二酚降解4-硝基酚，并伴有亚硝酸根(NO2 -)释放；而NyZ215菌株通过氧化途径降解2-硝基酚，中间产物是邻苯二酚，同时释放亚硝酸根；JMP134菌株通过还原途径分解代谢3-硝基酚，中间产物为苯三酚，并释放铵根(NH4 +)。ONP单加氧酶(ONP 2-monooxygenase：OnpA)，MNP硝基还原酶(MNP nitroreductase：MnpA)和PNP单加氧酶(PNP4-monooxygenase：PnpA)分别是三种污染物微生物代谢过程涉及到的起始酶。
菌株Alcaligenes sp.NyZ215和Pseudomonas sp.WBC-3由中国典型培养物保藏中心保藏(CCTCC)，保藏号分别为M206121和M201027，Cupriavidusnecator JMP134由德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)保藏，保藏号为DSMZ4058。
在微生物修复研究中，目前，分子生态学研究已经逐渐成为生物修复效果评价标准和监测手段。传统的微生物生态学研究方法(如微生物分离和菌落计数)只限于环境样品中不到1％可培养的微生物类群，而随着实时定量PCR(Real-timePCR)、T-RFLP(Terminal restriction fragment length polymorphism，末端限制性片段长度多态性)、荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)和变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)等技术的出现，研究者可以从群体水平、细胞水平和分子水平对微生物的多样性及其种群结构进行生态学研究。其中，Real-time PCR技术不仅实现了对DNA或RNA模板的定量，而且具有灵敏度高、具实时性和准确性等特点，故可用于监测环境中的目标微生物和目的基因表达情况。这种微生物生态学分析方法，能够检测生物修复过程中微生物生态结构的整体变化，为此类技术的安全性提供证据，并为大面积推广应用提供技术支持。
发明内容：
本发明的目的之一在于提供了一种利用微生物进行有机污染物的生物修复的方法。利用三种菌种Alcaligenes sp.NyZ215，Cupriavidus necator JMP134和Pseudomonas sp.WBC-3构建了人工菌群，对土壤、水体环境中的三种硝基酚同分异构体污染物进行生物修复，可以成功的去除土壤和水体中硝基酚污染物的存在，该方法费用低，操作简便，不会形成二次污染。
本发明的另一个目的是在于提供了一种利用微生物降解菌群在硝基酚同分异构体原位生物修复中的应用。该操作有效地去除了土壤和水体中硝基酚污染物的存在，针对性强，实施时间相对较短，对周围干扰少，并且降解菌可以在修复的过程中稳定的存在。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种利用微生物进行有机污染物的生物修复的方法，其步骤是：
A、微生物混合菌群的构建：
三种微生物菌株分别培养，Alcaligenes sp.NyZ215(CCTCC：保藏号M206121)，Cupriavidus necator JMP134(DSMZ：保藏号DSMZ4058)，Pseudomonas sp.WBC-3(CCTCC：保藏号M201027)的制备方法，包括如下步骤：
a.配制无机盐培养基：成分为磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)14.3g，磷酸二氢钾(KH2PO4)3.0g，硫酸镁(MnSO4·H2O)0.28mg，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.3mg，硫酸镁(MgSO4)0.06mg，氯化钙(CaCl2)1mg，硫酸铜(CuSO4)0.05mg，硫酸锌(ZnSO4)0.05mg和硼酸(H3BO3)0.05mg，将其以双蒸水定容至1000ml，调pH为7.0，121℃，灭菌20分钟，在250ml三角烧瓶中加入50ml上述无机盐培养基；
b.菌种的诱导培养：在上述无机盐培养基中分别补加0.5mM 2-硝基酚，3-硝基酚，4-硝基酚，按2％的接入量分别接入经LB培养基培养的Alcaligenes sp.strain NyZ215，Cupriavidus necator JMP 134，Pseudomonas sp.strain WBC-3，恒温30℃培养至对数后期，收集菌液；
c.菌体的收集：离心收集菌体，用0.85％生理盐水清洗菌体1-3次；
B、微环境模型的构建：
a.土壤微环境模型的构建：
设置了5组不同土壤处理组：A：自然土壤natrual soil(NS)B：自然土壤+三种硝基酚同分异构体(NS+NPs)C：自然土壤+三种硝基酚同分异构体+三种接入菌(NS+NPs+3inocula)D：灭菌土壤(sterile soil)+三种硝基酚同分异构体(SS+NPs)E：灭菌土壤+三种硝基酚同分异构体+三种接入菌(SS+NPs+3inocula)。在带有塑料可旋盖的250ml玻璃瓶中准备不同的土壤微环境，每组3个重复。每组取114.5g的天然土壤或灭菌土壤，相当于100g的土壤干重，30℃孵育48h。接种量约为1×108cfu(cfu：colony formineunit，菌落形成单位)/g土壤干重。按1∶1∶1的比例接种到相应的处理组中；
b.生物反应器的制备：
平均水力停留时间为3天。空气流速控制在200-300ml min-1，溶解氧浓度为7.8mg l-1。诱导培养的菌株接入的量为3×107cells L-1。将聚氨酯泡沫剪成3cm见方的小块。每个聚氨酯泡沫小块的质量控制在0.5-0.6g。利用铁丝将10个小块串成一串固定于反应器中，作为固定微生物的载体；
C、硝基酚同分异构体浓度的检测：
a.土壤中硝基酚同分异构体浓度的检测：
微环境模型置于30℃培养，定时取样。利用高效液相色谱检测步骤B中的a步中提到的几种处理组中的硝基酚同分异构体污染物的浓度。具体处理样品的方法为：取0.50g土壤样品加1ml的甲醇，涡旋振荡1min，200rpm振荡培养30min，12,000g离心10min，移取700μl的上清到另一个1.5ml离心管中，然后再12,000g离心10min，再移取200μl的上清液到另一个1.5ml离心管中，取20μl进样，HPLC检测。具体检测条件为：C18反相色谱柱(5μm，4.6by 250mm；Agilent Technologies，流动相采用体积比60％的甲醇和40％的1％(体积比)冰乙酸，流速1ml/min。检测波长为280nm。ONP、MNP、PNP的保留时间(retention time)分别是17.0、12.5、11.2min。
b.生物反应器中硝基酚同分异构体浓度的检测：
反应器于室温(20-25℃)开启，定时取样。具体处理样品的方式：移取700μl的上清到另一个1.5ml离心管中，然后再12,000g离心10min，再移取200μl的上清液到另一个1.5ml离心管中，取20μl进样，HPLC检测。高效液相色谱检测硝基酚同分异构体浓度与C步骤中的a步中提到的方法相同；
D、硝基酚污染物的去除：
a.土壤中硝基酚的去除：
相对于未加入制备的混合菌群的处理，生物修复的处理中三种硝基酚都降解的要快得多，在整个30天的实验中，生物修复处理中40ppm的4-硝基酚8天时全部降完，而无生物修复的处理30天之后也只降了71％(质量比)；经过生物修复的处理中40ppm的3-硝基酚10天内全部降完，而未修复的污染处理中30天只降了81.5％(质量比)；生物修复处理中2-硝基酚也只需8天全部降完，但是未进行生物修复的污染处理中仅有51.2％(质量比)消失，证明了生物修复确实加快了土壤中硝基酚污染物的去除速度。
b.生物反应器中硝基酚的去除：
在为期18天中，共进行了6次降解循环，未进行生物修复的处理中硝基酚的浓度仍然很高，而加入了制备的混合菌群的处理中硝基酚均被完全降解，降解率达100％。而对生物修复第五次循环进行了更细致的监测，菌体密度O.D.600吸收值由0.02升至0.07，同时检测到铵根离子、亚硝酸根离子的释放。这表明该菌群在生物反应器中仍然可以利用硝基酚为唯一碳源、氮源、能源生长，并彻底降解三种底物。
一种利用发明内容的步骤A中制备的微生物降解菌群在硝基酚原位生物修复中的应用，其步骤是：
A、微生物混合菌群的构建：
三种微生物菌株分别培养，Alcaligenes sp.NyZ215(CCTCC：保藏号M206121)，Cupriavidus necator JMP134(DSMZ：保藏号DSMZ4058)，Pseudomonas sp.WBC-3(CCTCC：保藏号M201027)的制备方法，包括如下步骤：
a.配制无机盐培养基：成分为磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H20)14.3g，磷酸二氢钾(KH2PO4)3.0g，硫酸镁(MnSO4·H2O)0.28mg，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.3mg，硫酸镁(MgSO4)0.06mg，氯化钙(CaCl2)1mg，硫酸铜(CuSO4)0.05mg，硫酸锌(ZnSO4)0.05mg和硼酸(H3BO3)0.05mg，将其以双蒸水定容至1000ml，调pH为7.0，121℃，灭菌20分钟。在250ml三角烧瓶中加入50ml上述无机盐培养基。
b.菌种的诱导培养：在上述无机盐培养基中分别补加0.5mM 2-硝基酚，3-硝基酚，4-硝基酚，按2％的接入量分别接入经LB培养基培养的Alcaligenes sp.strainNyZ215，Cupriavidus necator JMP 134，Pseudomonas sp.strain WB C-3，恒温30℃培养至对数后期，收集菌液。
c.菌体的收集：离心收集菌体，用0.85％生理盐水清洗菌体2次；
B、针对制备的微生物混合菌群进行的几个应用：
a.三种硝基酚的共降解——摇瓶实验
将诱导培养的三种菌株按2％的接种量接入同时含有0.5mM 2-硝基酚，3-硝基酚，4-硝基酚的无机盐培养基中，恒温30℃摇床培养。在84小时之内三种硝基酚均被完全降解，降解率达100％，并且明显可见菌体量增加。
b.三种硝基酚的共降解——生物反应器降解：
反应器在室温(20-25℃)下按序批式运行，三种硝基酚负载量为50mg/(L·d)，平均水力停留时间为3天。空气流速控制在200-300ml min-1，溶解氧浓度为7.8mg l-1。诱导培养的菌株接入的量为3×107cells L-1。将聚氨酯泡沫剪成3cm见方的小块，作为固定微生物的载体。在为期18天中，共进行了6次降解循环，硝基酚均被完全降解，降解率达100％。
c.利用三种接入菌对三种硝基酚同分异构体污染的土壤进行生物修复：
设置了5组不同土壤处理组：A：自然土壤natrual soil(NS)B：自然土壤+三种硝基酚同分异构体(NS+NPs)C：自然土壤+三种硝基酚同分异构体+三种接入菌(NS+NPs+3inocula)D：灭菌土壤(sterile soil)+三种硝基酚同分异构体(SS+NPs)E：灭菌土壤+三种硝基酚同分异构体+三种接入菌(SS+NPs+3inocula)。其中三种污染物浓度均为40ppm。30℃培养，定时取样进行污染物降解监测，证明通过接种降解菌到硝基酚同分异构体污染土壤中，能够完成污染物的去除，达到原位生物修复的目的。
本发明所涉及的细菌菌株添加方法，包括但不仅限于降解菌发酵液直接添加的方法，还可以将降解菌作为主要活性成分制备各种微生物制剂(可湿性粉剂、乳剂、水剂)，其制备方法为农药的常规制备方法，然后添加到污染的环境中。
本发明所涉及的生物修复环境，包括但不仅限于土壤，还可以直接应用于水体、森林、湿地等各种含有一种或者三种硝基酚污染物的环境。
本发明所涉及的生物修复方法，包括但不仅限于原位修复，还可以应用于生物反应器等异位生物修复中。
本发明所涉及的生物修复方法，包括但不仅限于微生物修复，还可以用于植物-微生物、动物-微生物联合生物修复中。
本发明所涉及的生物修复的污染物种类，包括但不仅限于三种硝基酚，还可以用于以硝基酚为代谢中间产物的污染物的生物修复。
利用本方法进行多种硝基酚污染环境的生物修复，具有如下优点：
(1)针对同时含有硝基酚三种同分异构体的土壤、水体，进行目标明确的生物修复；
(2)利用本方法进行硝基酚同分异构体污染的生物修复，能够不破坏植物生长所需的土壤环境以及水体环境，不会形成二次污染或导致污染物的转移，并可最大限度地降低污染物浓度；
(3)可在原地降解清除污染物，而且费用低，并且操作简便，操作人员可以避免受污染物直接影响，修复时间相对较短，对周围环境干扰少。跟传统的化学、物理修复相比有很大的优势，最根本特点是消除污染物而不是分离转移污染物，从而在根本上解决环境问题，被誉为21世纪治理环境污染的优选技术，具有广泛的发展和应用前景。
附图说明
图1为一种三种硝基酚同分异构体共降解的摇瓶实验示意图。
横坐标为时间(小时)，纵坐标是土壤中的硝基酚的浓度(毫摩尔)。每个处理设置了3个重复。结果表明，84小时之内三种0.5mM硝基酚均被微生物菌群完全降解。ONP、MNP和PNP分别表示2-硝基酚、3-硝基酚和4-硝基酚。
图2为一种生物反应器中三种硝基酚同分异构体的降解示意图。
横坐标为时间(天)，纵坐标是反应器中的硝基酚的浓度(毫摩尔)。降解循环持续18天，先后加入6批次硝基酚，分别在图上以cycle显示。三种硝基酚均被完全降解，降解率达100％。(A.2-硝基酚的浓度随着时间变化；B.3-硝基酚的浓度随着时间变化；C.4-硝基酚的浓度随着时间变化)
图3为一种土壤中三种硝基酚污染物的生物修复示意图。横坐标为时间(天)，纵坐标是不同土壤处理中三种硝基酚同分异构体浓度(单位是毫克每克干重土壤)以及离子的浓度(单位是微克每克干重土壤)变化。(a.4-硝基酚；b.3-硝基酚；c.2-硝基酚；d.NH4 +；e.NO2 -)
图4为一种硝基酚同分异构体降解过程中接入菌的代谢过程中第一个酶的基因丰度变化图以及土壤中总的细菌16S rRNA基因丰度变化示意图。
横坐标为时间(天)，纵坐标是土壤样品中降解菌的降解第一个基因数量(pnpA、mnpA和onpA)以及土壤中总细菌16S rRNA基因的数量的对数值。(a.4-硝基酚4端加氧酶(PNP 4-monooxygenase)；b.3-硝基酚硝基还原酶(MNP nitroreductase)；c.2-硝基酚2端加氧酶(ONP 2-monooxygenase)；d.16SrRNA基因)
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
所有实施例中的培养基及分子生物学操作方法参考Sambrook等“分子克隆”(实验室手册，冷泉港，1989)及“精编分子生物学实验指南”(美/F.奥斯伯等著，颜子颖等译，北京，科学出版社，1998)。
实施例1.
一种利用微生物进行有机污染物的生物修复的方法，其步骤是：
A、微生物混合菌群的构建：
三种微生物菌株分别培养，Alcaligenes sp.NyZ215(CCTCC：保藏号M206121)，Cupriavidus necator JMP134(DSMZ：保藏号DSMZ4058)，Pseudomonas sp.WBC-3(CCTCC：保藏号M201027)的制备方法，包括如下步骤：
a.配制无机盐培养基：成分为磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)14.3g，磷酸二氢钾(KH2PO4)3.0g，硫酸镁(MnSO4·H2O)0.28mg，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.3mg，硫酸镁(MgSO4)0.06mg，氯化钙(CaCl2)1mg，硫酸铜(CuSO4)0.05mg，硫酸锌(ZnSO4)0.05mg和硼酸(H3BO3)0.05mg，将其以双蒸水定容至1000ml，调pH为7.0，121℃，灭菌20分钟。在250ml三角烧瓶中加入50ml上述无机盐培养基。
b.菌种的诱导培养：在上述无机盐培养基中分别补加0.5mM 2-硝基酚，3-硝基酚，4-硝基酚，按2％的接入量分别接入经LB培养基培养的Alcaligenes sp.strain NyZ215，Cupriavidus necator JMP 134，Pseudomonas sp.strain WBC-3，恒温30℃培养至对数后期，收集菌液。
c.菌体的收集：离心收集菌体，用0.85％生理盐水清洗菌体2次，待用。
B、微环境模型的构建：
a.土壤微环境模型的构建：
设置了5组不同土壤处理组：A：自然土壤natrual soil(NS)、B：自然土壤+三种硝基酚同分异构体(NS+NPs)、C：自然土壤+三种硝基酚同分异构体+三种接入菌(NS+NPs+3inocula)、D：灭菌土壤(sterile soil)+三种硝基酚同分异构体(SS+NPs)、E：灭菌土壤+三种硝基酚同分异构体+三种接入菌(SS+NPs+3inocula)。灭菌土的制备方法是称取土壤高压灭菌后，30℃培养两天后再次灭菌，反复处理三次，得到无菌土壤，并调节水含量与天然土壤相同。在带有塑料可旋盖的250ml玻璃瓶中准备不同的土壤微环境，每组3个重复。每组取114.5g的天然土壤或灭菌土壤，相当于100g的土壤干重，室温(20-25℃)孵育48h。接种量约为1×108cfu(cfu：colony formine unit，菌落形成单位)/g土壤干重。按1∶1∶1的比例接种到相应的处理组中，
b.生物反应器的准备：
反应器在室温(20-25℃)下按序批式运行，三种硝基酚负载量为50mg/(L·d)，平均水力停留时间为3天。空气流速控制在200-300ml min-1，溶解氧浓度为7.8mg L-1。诱导培养的菌株接入的量为3×107 cells L-1。将聚氨酯泡沫剪成3cm见方的小块。每个聚氨酯泡沫小块的质量控制在0.5-0.6g。利用铁丝将10个小块串成一串固定于反应器中，作为固定微生物的载体。
C、30℃培养并且定时取样检测三种硝基酚污染物浓度的变化，证明接种污染物的消除：
通过高效液体色谱法检测上述中的不同生物修复处理组中的硝基酚
同分异构体污染物的浓度。HPLC检测条件为：C18反相色谱柱(5μm，4.6by 250mm；Agilent Technologies，流动相采用60％(体积比)的甲醇和40％的1％(体积比)冰乙酸，流速1ml/min。检测波长为280nm。ONP、MNP、PNP的保留时间(retention time)分别是17.0、12.5、11.2min。对于土壤中样品处理具体方法为，取0.50g土壤样品加1ml的甲醇，涡旋振荡1min，200rpm振荡培养30min，12,000g离心10min，移取700μl的上清到另一个1.5ml离心管中，然后再12,000g离心10min，再移取200μl的上清液到另一1.5ml离心管中，取20μl进样，HPLC检测。而反应器中，直接取液体样品12,000g离心10min，移取700μl的上清到另一个1.5ml离心管中，然后再12,000g离心10min，再移取200μl的上清液到另一1.5ml离心管中，取20μl进样，HPLC检测。
D.污染环境中硝基酚同分异构体的去除：
a.土壤中硝基酚的去除：
相对于未加入制备的混合菌群的处理，生物修复的处理中三种硝基酚都降解的要快得多，在整个30天的实验中，生物修复处理中40ppm的4-硝基酚8天时全部降完，而无生物修复的处理30天之后也只降了71％(质量比)；经过生物修复的处理中40ppm的3-硝基酚10天内全部降完，而未修复的污染处理中30天只降了81.5％(质量比)；生物修复处理中2-硝基酚也只需8天全部降完，但是未进行生物修复的污染处理中仅有51.2％(质量比)消失，证明了生物修复确实加快了土壤中硝基酚污染物的去除速度。
b.生物反应器中硝基酚的去除：
在为期18天中，共进行了6次降解循环，未进行生物修复的处理中硝基酚的浓度仍然很高，而加入了制备的混合菌群的处理中硝基酚均被完全降解，降解率达100％。而对生物修复第五次循环进行了更细致的监测，菌体密度O.D.600吸收值由0.02升至0.07，同时检测到铵根离子、亚硝酸根离子的释放。这表明该菌群在生物反应器中仍然可以利用硝基酚为唯一碳源、氮源、能源生长，并彻底降解三种底物。
实施例2：
一种利用微生物降解菌群在硝基酚原位生物修复(环境污染治理)中的应用，其步骤是：
A、微生物混合菌群的构建：
三种微生物菌株分别培养，Alcaligenes sp.NyZ215(CCTCC：保藏号M206121)，Cupriavidus necator JMP134(DSMZ：保藏号DSMZ4058)，Pseudomonas sp.WBC-3(CCTCC：保藏号M201027)的制备方法，包括如下步骤：
a.配制无机盐培养基：成分为磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)14.3g，磷酸二氢钾(KH2PO4)3.0g，硫酸镁(MnSO4·H2O)0.28mg，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.3mg，硫酸镁(MgSO4)0.06mg，氯化钙(CaCl2)1mg，硫酸铜(CuSO4)0.05mg，硫酸锌(ZnSO4)0.05mg和硼酸(H3BO3)0.05mg，将其以双蒸水定容至1000ml，调pH为7.0，121℃，灭菌20分钟。在250ml三角烧瓶中加入50ml上述无机盐培养基。
b.菌种的诱导培养：在上述无机盐培养基中分别补加0.5mM 2-硝基酚，3-硝基酚，4-硝基酚，按2％的接入量分别接入经LB培养基培养的Alcaligenes sp.strainNyZ215，Cupriavidus necator JMP 134，Pseudomonas sp.strain WB C-3，恒温30℃培养至对数后期，收集菌液。
c.菌体的收集：离心收集菌体，用0.85％生理盐水清洗菌体2次；
B.针对制备的微生物混合菌群进行的几个应用：
a.三种硝基酚的共降解——摇瓶试验
将诱导培养的三种菌株按2％的接种量接入同时含有0.5mM 2-硝基酚，3-硝基酚，4-硝基酚的无机盐培养基中，恒温30℃摇床培养。在84小时之内三种硝基酚均被完全降解，降解率达100％，并且明显可见菌体量增加，如图1所示。这表明在摇瓶中利用三种菌株同时降解三种硝基酚同分异构体是可行的。
b.三种硝基酚的共降解——生物反应器降解
反应器在室温(约21-25℃)下按序批式运行，三种硝基酚负载量为50mg/(L·d)，平均水力停留时间为3天。空气流速控制在200-300ml min-1，溶解氧浓度为7.8mg l-1。诱导培养的菌株接入的量为3×107cells L-1。将聚氨酯泡沫剪成3cm见方的小块。每个聚氨酯泡沫小块的质量控制在0.5-0.6g。利用铁丝将10个小块串成一串固定于反应器中，作为固定微生物的载体。
在为期18天中，共进行了6次降解循环，硝基酚均被完全降解，降解率达100％。对其中第五次循环进行了更细致的监测，菌体密度O.D.600吸收值由0.02升至0.07，同时检测到铵根离子、亚硝酸根离子的释放。这表明该菌群在生物反应器中仍然可以利用硝基酚为唯一碳源、氮源、能源生长，并彻底降解三种底物。
用HPLC(高效液相色谱)检测反应器中的三种硝基酚浓度，结果如图2所示。降解循环持续18天，先后加入6批次三种硝基酚均被完全降解，降解率达100％。HPLC检测条件为：C18反相色谱柱(5μm，4.6by 250mm；AgilentTechnologies，流动相采用60％的甲醇和40％的1％冰乙酸，流速1ml/min。检测波长为280nm。ONP、MNP、PNP的保留时间(retention time)分别是17.0、12.5、11.2min。
c.利用三种接入菌对三种硝基酚同分异构体污染的土壤进行生物修复：
设置了5组不同土壤处理组：A：自然土壤natrual soil(NS)、B：自然土壤+三种硝基酚同分异构体(NS+NPs)、C：自然土壤+三种硝基酚同分异构体+三种接入菌(NS+NPs+3inocula)、D：灭菌土壤(sterile soil)+三种硝基酚同分异构体(SS+NPs)、E：灭菌土壤+三种硝基酚同分异构体+三种接入菌(SS+NPs+3inocula)。其中三种污染物浓度均为40ppm。灭菌土的制备方法是称取土壤高压灭菌后，30℃培养两天后再次灭菌，反复处理三次，得到无菌土壤，并调节水含量与天然土壤相同。
在带有塑料可旋盖的250ml玻璃瓶中准备不同的土壤微环境，每组3个重复。每组取114.5g的天然土壤或灭菌土壤，相当于100g的土壤干重，室温孵育48h。
生物修复的方法如下，菌株NyZ215、JMP134、WBC-3在液体LB培养基中，30℃培养至对数后期，6,000g离心8min收集菌体，用0.85％的生理盐水清洗两次后，按1∶1∶1的比例接种到相应的处理组中，接种量约为1×108cfu(cfu：colony formine unit，菌落形成单位)/g土壤干重。为保持每个土壤微环境组的水分含量和离子含量一致，未接种的处理组加入等体积的0.85％的生理盐水，体系最终含水量约为22％。30℃培养，定时取样进行污染物降解监测，证明通过接种降解菌到硝基酚同分异构体污染土壤中，能够完成污染物的去除，达到原位生物修复的目的。
d.通过高效液体色谱(High Performance Liquid Chromatography：HPLC)检测降解菌株对硝基酚污染物的生物修复过程：
通过高效液体色谱法检测上述中的不同生物修复处理组中的硝基酚同分异构体污染物的浓度，具体方法为，取0.50g土壤样品加1ml的甲醇，涡旋振荡1min，200rpm振荡培养30min，12,000g离心10min，移取700μl的上清到另一个1.5ml离心管中，然后再12,000g离心10min，再移取200μl的上清液到另一1.5ml离心管中，取20μl进样，HPLC检测。
HPLC检测结果如附图3所示，与污染处理组B和D相比，接种菌存在的土壤处理组C和E的三种硝基酚降解消除作用明显，C处理中在8天、10天、8天左右三种硝基酚基本降解完全，而E处理中，三种硝基酚分别与10天、16天、2天降解完全。
这说明，利用上述方法，能够有效的去除土壤中三种硝基酚同分异构体混合物的污染，达到了原位生物修复的目的。
e.硝基酚降解过程中NO2-、NH4+的浓度检测：
NyZ215通过氧化途径降解ONP，WBC-3通过氧化途径降解PNP，这两种底物在降解过程中会伴随的NO2-释放，JMP134通过还原途径降解MNP，会伴随NH4+的释放，通过测定生物修复过程中NO2-、NH4+浓度变化，能够证明土壤中底物的降解，是源于接入菌的降解作用。
NO2-检测方法：土壤样品0.5g中加入3ml的2M的氯化钾溶液，振荡30min，立即离心12,000g，5min，然后取1ml上清，加入1％的氨基苯磺酸和0.02％N-(1-萘)乙二胺，摇匀静置10min后，540nm紫外分光光度计检测。
NH4+检测方法：土壤样品0.5g中加入2.5ml的2M的氯化钾溶液，振荡30min，立即离心12,000g，5min，然后取1ml上清，按2∶3∶3的比例加入0.26M苯酚钠(200μl)，0.01％硝普钠，0.02N次氯酸钠，摇匀静置30min左右后，630nm紫外分光光度计检测。
f.土壤硝基酚污染去除过程中微生物的分子生态学变化
利用荧光定量PCR的方法对降解菌代谢途径的第一个酶基因的表达情况进行定量，分别是ONP单加氧酶(ONP 2-monooxygenase：OnpA)，MNP硝基还原酶(MNP nitroreductase：MnpA)和PNP单加氧酶(PNP4-monooxygenase：PnpA)，分别是三种污染物微生物代谢过程涉及到的起始酶。利用这种方法检测硝基酚同分异构体降解过程中接入菌Alcaligenes sp.NyZ215，Cupriavidus necator JMP134，Pseudomonas sp.WBC-3的存活情况。
具体方法为：利用MoBio UltraCleanTM soil DNA isolation kit(Carlsbad，CA)对0.5g土壤进行DNA提取，作为荧光定量PCR的模板。荧光定量PCR是采用RT-CyclerTM 136(CapitalBio，Beijing，China)仪器，20μl反应体系包括：10μl2×TransStartTM Eco Green qPCR SuperMix(TransGen Biotech，Beijing，China)，1μl模板DNA，0.4μl Passive Reference Dye和0.2mM引物(onpA1/onpA2 for onpA；mnpA1/mnp A2 for mnpA；pnpA1/pnpA2 for pnpA)。具体程序是：95℃，5min；95℃，20s，60℃，20s，72℃，20s，45个循环；然后60℃至94℃进行熔解曲线的分析。
实验结果见图4，(a)(b)(c)是硝基酚同分异构体降解过程中接入菌的代谢过程中第一个酶的基因(pnpA，mnpA和onpA)丰度变化图，(d)为土壤中总的细菌16S rRNA基因丰度变化图。说明污染物修复过程中三个降解基因持续表达，证明污染物降解是由引入的降解微生物引起的，并说明三种接入菌可以在该土壤体系中稳定的存在。这些都为利用该技术进行污染物的降解和环境治理提供了依据。
Claims (2)
1.一种利用微生物菌群进行混合有机污染物的生物修复的方法，其步骤是：
A、微生物混合菌群的构建：
a.配制无机盐培养基：成分为磷酸氢二钠14.3g，磷酸二氢钾3.0g，硫酸镁0.28mg，硫酸亚铁0.3mg，硫酸镁0.06mg，氯化钙1mg，硫酸铜0.05mg，硫酸锌0.05mg和硼酸0.05mg，将其以双蒸水定容至1000ml，调pH为7.0，121℃，灭菌20分钟，在250ml三角烧瓶中加入50ml上述无机盐培养基；
b.菌种的诱导培养：在步骤a的无机盐培养基中分别补加0.5mM 2-硝基酚，3-硝基酚，4-硝基酚，按2%的接入量分别接入经LB培养基培养的Alcaligenes sp.strain NyZ215，Cupriavidus necator JMP 134,Pseudomonas sp.strain WBC-3，恒温30℃培养至对数后期，收集菌液；
c.菌体的收集：离心收集菌体，用0.85%生理盐水清洗菌体2次；
B、微环境模型的构建：
a．土壤微环境模型的构建：
设置了五组不同土壤处理组：A：自然土壤；B:自然土壤加三种硝基酚同分异构体；C:自然土壤加三种硝基酚同分异构体加步骤A中提到的混合菌群；D：灭菌土壤加三种硝基酚同分异构体；E：灭菌土壤加三种硝基酚同分异构体加步骤A中提到的混合菌群，每组取100g干重的天然土壤或灭菌土壤，3个重复，放置带有塑料旋盖的250ml玻璃瓶中，30℃孵育48h，接种量为1×108cfu/g土壤干重，按1：1：1的数量比例接种到相应的处理组中；
b．生物反应器的制备：
平均水力停留时间为3天，空气流速控制在200-300ml min-1，溶解氧浓度为7.8mg l-1，诱导培养的菌株接入的量为3×107cells L-1，将聚氨酯泡沫剪成3cm，每个聚氨酯泡沫小块的质量控制在0.5-0.6g，利用铁丝将10个小块串成一串固定于反应器中，作为固定微生物的载体；
C、硝基酚同分异构体浓度的检测：
a．土壤中硝基酚同分异构体浓度的检测：
微环境模型置于30℃培养，定时取样 ,利用高效液相色谱检测步骤B中的a步中提到的几种处理组中的硝基酚同分异构体污染物的浓度，具体 处理样品的方法为：取0.50g土壤样品加1ml的甲醇，涡旋振荡1min，200rpm振荡培养30min，12,000g离心10min，移取700μl的上清到另一个1.5ml离心管中，然后再12,000g离心10min，再移取200μl的上清液到另一个1.5ml离心管中，取20μl进样，HPLC检测，具体检测条件为：C18反相色谱柱5μm,4.6by 250mm;Agilent Technologies，流动相采用体积比60%的甲醇和40%的1%冰乙酸，流速1ml/min，检测波长为280nm，ONP、MNP、PNP的保留时间分别是17.0、12.5、11.2min；
b．生物反应器中硝基酚同分异构体浓度的检测：
反应器于室温开启，定时取样，具体处理样品的方式：移取700μl的上清到另一个1.5ml离心管中，然后再12,000g离心10min，再移取200μl的上清液到另一个1.5ml离心管中，取20μl进样，HPLC检测，高效液相色谱检测硝基酚同分异构体浓度与C步骤中的a步中提到的方法相同。
2.权利要求1中所述的一种利用微生物菌群进行混合有机污染物的生物修复的方法在硝基酚同分异构体原位生物修复中的应用。
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