CN110907445A - 一种微流控生物芯片检测装置及制备方法和检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种微流控生物芯片检测装置及制备方法和检测方法，包括由上向下依次设置的上层盖片、中间层和下层垫片，其中，上层盖上开设有进样孔和排气孔，中间层上设置有若干检测通道，每个检测通道包括进样池、第一反应池、第二反应池和废液池；进样池与进样孔连通；排气孔与废液池相连；进样池、第一反应池、第二反应池以及废液池通过微流道连通。该装置利用寡营养单胞菌XM‑1对2,4‑二硝基酚降解过程中产生的亚硝酸根离子的反应显色来对污染物进行定性检测。该装置操作简单，便捷高效、成本低廉，可实现现场取样、处理和快速检测，并且不会带来二次污染。

Description

一种微流控生物芯片检测装置及制备方法和检测方法
技术领域
本发明涉及一种微生物芯片，具体涉及一种微流控生物芯片检测装置及制备方法和检测方法。
背景技术
随着经济社会的发展，环境污染问题越来越严重，引起了人们的高度重视。环境污染的监测是环境污染治理和修复的基础工作，简便有效的检测手段能够为环境污染的治理提供有力的支撑，为公共卫生健康的安全与预防提供必要的依据和有效的评价。
硝基酚是一类重要的化工原料，广泛的应用于各种精细化工中间体的生产，如医药、染料合成、炸药、杀虫剂、农药和橡胶等。硝基酚类物质化学性质稳定，不易被降解，可以在环境中长久滞留，造成水和土壤的污染。硝基酚类物质一般都具有高毒性，其在生产和使用过程中，会被排放到环境中，进而对人类健康造成威胁，所以一些硝基酚比如2,4-二硝基酚，被美国环保署列为优先污染物。在生物化学领域内，2,4-二硝基酚一般作为解偶联剂而用作氧化磷酸化和电子传递链研究的试剂，可以抑制许多生物学机能，是重要的环境污染物之一。目前对环境污染物2,4-二硝基酚的检测已经有很多成熟的技术和检测仪器，比如色谱法、免疫检测法、生物检测法等。这些方法虽然检测精度高，但大多需要昂贵的仪器，或者专业的操作人员，检测周期比较长，不能满足野外现场快速检测等缺点。
生物防治特别是微生物降解由于成本低，效果好，避免多重污染等特点成为检测治理芳烃污染物的有效方式之一。近些年来随着大量的能够降解各种污染物的菌株的分离，科学家对这些菌株是如何代谢污染物的分子机理进行了深入的研究。
发明内容
本发明针对目前现场快速检测存在的问题，其目的在于提供一种操作简单、检测结果稳定可靠的微流控生物芯片检测装置及制备方法和检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种微流控生物芯片检测装置，包括由上向下依次设置的上层盖片、中间层和下层垫片，其中，上层盖上开设有进样孔和排气孔，中间层上设置有若干检测通道，每个检测通道包括进样池、第一反应池、第二反应池和废液池；进样池与进样孔连通；排气孔与废液池相连；进样池、第一反应池、第二反应池以及废液池通过微流道连通。
本发明进一步的改进在于，上层盖片为聚二甲基硅氧烷基片。
本发明进一步的改进在于，中间层为双面胶膜。
本发明进一步的改进在于，下层垫片为透明玻璃片。
一种如上所述的微流控芯片检测装置的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：在聚二甲基硅氧烷基片上切割进样孔和排气孔，然后对聚二甲基硅氧烷基片表面进行等离子体处理，形成上层盖片；
步骤2：在DSA膜上切割若干检测通道，每个检测通道包括进样池、第一反应池、第二反应池与废液池，形成中间层，将上层盖片放在中间层顶部，将下层垫片放在中间层底部，进样孔与进样池相连通，排气孔与废液池相连通，并且进样池、第一反应池、第二反应池与废液池之间通过微通道相连通；
步骤3：在第一反应池和第二反应池中各加入显色溶液，并在第二反应池中加入OD600为3.0的菌液，然后冷冻干燥，制得微流控生物芯片检测装置；其中，菌液中细菌为寡营养单胞菌XM-1。
本发明进一步的改进在于，聚二甲基硅氧烷基片等离子体处理的具体条件为：采用室内空气，在0.3mbar的压强下，80-90℃下，热烘15-30min。
一种如上所述的微流控生物芯片检测装置对硝基酚污染物的检测方法，包括以下步骤：
1)将待测溶液通过进样孔注入到进样池中，通过进样通道，在第一反应池中与显色剂混合，观察记录亚硝酸根离子颜色，与比色卡比较，估算初始浓度；
2)随后反应液进入到第二反应池中与菌液反应，反应30min后，观察记录亚硝酸根离子颜色，与比色卡比较，估算反应后浓度；
3)通过两次比色卡颜色比较，估算出亚硝酸根离子的浓度，进而预估出待测溶液中2,4-二硝基酚污染的程度。
本发明进一步的改进在于，比色卡通过以下过程制得：
配制亚硝酸钠标准溶液，加入亚硝酸盐显色剂，根据标准溶液生成的偶氮化合物颜色的深浅来制作比色卡；其中，亚硝酸盐显色剂通过以下过程制得：将对氨基苯磺酸0.5g加入到质量浓度10％的稀醋酸150mL中，得到A液；将α-萘胺0.1g与蒸馏水20mL加入到质量浓度10％的稀醋酸150mL中，得到B液，将等体积的A液和B液混合均匀，得到亚硝酸盐显色剂。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：本发明设计了环境中2，4-而硝基酚的一种微流控生物芯片检测装置，该装置利用寡营养单胞菌XM-1对2,4-二硝基酚降解过程中产生的亚硝酸根离子的反应显色来对污染物进行定性检测，在不同的反应池中，待测水样可以与显色剂发生反应而发生颜色变化。该装置操作简单，便捷高效、成本低廉，方便大众使用，可实现现场取样、处理和快速检测，并且可以在检测的同时降解2,4-二硝基酚污染物，不会带来二次污染。
进一步的，下层垫片由透明的材料制作的，便与直观的观察显色反应，同时配有显色卡，可以很方便的估算污染物的浓度。
本发明利用微生物显色法快速检测水和土壤中硝基酚浓度，该方法能够一次检测一种或多种硝基酚污染物，可实现野外现场取样、处理和快速检测，并且可以在检测的同时降解2,4-二硝基酚污染物，从而达到不会带来二次污染的目的。
附图说明
图1为本发明硝基酚污染物微芯片的三层结构示意图。
图2为本发明微芯片的结构剖面图。
图3为本发明微芯片中间层的结构示意图。
图4为实施例中设计的高通量检测芯片示意图。
图5为本发明的预实验结果图。
图6为实施例中设计的比色卡。
图中标记：1为上层盖片，2为中间层，3为下层垫片，4为进样孔，5为进样池，6为微流道，7为第一反应池，8为第二反应池，9为废液池，10为排气孔。
图5各标记为：①2,4-二硝基酚溶液；②2,4-二硝基酚溶液+显色剂；③2,4-二硝基酚溶液+菌液；④2,4-二硝基酚溶液+菌液+显色剂。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细说明。
寡营养单胞菌XM-1是从化工厂污水中分离得到的一株非致病性的革兰氏阴性好氧细菌，以2,4-二硝基酚为唯一的碳源、氮源以及能源进行生长。菌株在XM-1降解2,4-二硝基酚的过程中会释放两分子亚硝酸根离子(NO2 -)，所以，测定出亚硝酸根离子的浓度，就可以推算出2,4-二硝基酚的污染浓度。
c(2,4-硝基酚)＝c(亚硝酸根离子)*2
参见图1、图2、图3和图4，本发明的一种微流控生物芯片检测装置，所述检测装置由依次叠加且密封配合的上层盖片1、中间层2和下层垫片3组成，上层盖片1是聚二甲基硅氧烷(PDMS)基片，中间层2为双面胶膜(即DSA膜)，下层垫片3为透明玻璃片，其中，上层盖1上开设有一进样孔4和排气孔10，中间层上设置有进样池5、第一反应池6、第二反应池8和废液池9；所述进样池5与所述进样孔3连通，且位置对应；排气孔10与废液池9相连；进样池5、第一反应池7第二反应池8以及废液池9之间由一微流道6连通。
制备微流控芯片检测装置的方法，包括以下步骤：
步骤1：首先利用软件设计芯片各层的结构图案，然后使用激光切割机在聚二甲基硅氧烷(PDMS)基片上刻出一个尺寸24mm×50mm×3.175mm的凹槽，然后分别切割出进样孔4和排气孔10。然后对聚二甲基硅氧烷(PDMS)基片表面进行等离子体处理(采用室内空气，在0.3mbar的压强下，80-90℃下，热烘15-30min)，形成上层盖片。
步骤2：在DSA膜上同样由激光切割机切割，形成进样池5、第一反应池7、第二反应池8与废液池9，形成中间层2，将上层盖片1放在中间层2上，将下层垫片3放在中间层底部，进样孔4与进样池5相连通，排气孔10与废液池9相连通，并且进样池5、第一反应池7、第二反应池8与废液池9之间通过微通道6相连通。
步骤3：在第一反应池7和第二反应池8中各加入5μL显色溶液，并在第二反应池8中加入100μL OD600为3.0的菌液，在-80℃冰箱或者液氮中速冻之后，置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥。菌液也细菌为寡营养单胞菌XM-1。
步骤4：将上述芯片用塑料薄膜包裹，放在1MPa真空下15min，抽出残余气体，形成真空状态。
基于上述微流控生物芯片检测装置的对硝基酚污染物的检测方法，包括以下步骤：
首先制备比色卡：
亚硝酸根离子的显色剂采用格里斯试剂，如果体系中含有亚硝酸根离子，亚硝酸根离子与对氨基苯磺酸先发生重氮化反应，再与α-萘胺发生偶合反应，生成紫红色的偶氮化合物，颜色的深浅与含量成正比。格里斯试剂的配制：A液：对氨基苯磺酸0.5g，10％稀醋酸150mL，避光保存；B液：α-萘胺0.1g，蒸馏水20mL，10％稀醋酸150mL避光低温保存。使用时取等体积的A液和B液，置棕色瓶中混合均匀，即得到亚硝酸盐显色剂。配制亚硝酸钠标准溶液，加入显色剂，观察标准溶液生成的偶氮化合物颜色的深浅来制作比色卡(参见图6)。
具体过程如下：
1、配制亚硝酸钠标准溶液
准确称取0.10g干燥的NaNO2溶于100mL水中，定容至500mL，配成0.2g/L溶液。精确移取5mL，在容量瓶中定容至100mL，配成10mg/L溶液作为亚硝酸钠工作液。
2、取8支试管，做好编号，然后准确移取亚硝酸钠工作液0mL、0.2mL、0.5mL 1.0mL、2.0mL、5.0mL、10mL和20mL分别置于100mL试管中，加水稀释至100mL，然后加入2mL格里斯试剂A液，混匀，放置2min，然后加入2mL格里斯试剂B液，混匀放置15min。
3、观察标准溶液生成的偶氮化合物的颜色，根据显色结果利用计算机进行图像扫描、处理得到标准色块，将标准色块按照亚硝酸钠标准液依次排列，然后制成比色卡(见图6)。
为了方便后续观察或者拍照检测结果，下层垫片3也可以选用透明的材料包括但不限于玻璃、石英或塑料等。如需调节反应槽的体积，可以选择不同厚度的下层垫片3或者是调整第一反应池和第二反应池的直径。可以选择上层盖片1的厚度为2～5mm；下层垫片3的厚度为2～5mm。进样孔为圆柱形通孔，直径为4～8mm。为保证所述上层盖片1的厚度在2～5mm范围内，可以根据厚度计算截面积来更改进样孔4的直径，所述进样槽的直径可为4～8mm。所述微流道可为立方体形，长度可为2～5cm，根据测试样品的体积决定；宽度和高度可为0.3～1mm(即截面为长方形)，根据所述进样池的容积确定。所述反应槽可为圆柱形腔室，直径可为1.5～6mm。
然后按下述步骤进行检测：
1)在30℃恒温条件下，将待测溶液通过进样孔4注入到进样池中5，通过进样通道6，在第一反应池7中与显色剂混合，观察记录亚硝酸根离子颜色，与比色卡(图5)比较，估算初始浓度；
2)随后反应液进入到第二反应池8中，与菌液反应，反应30min中后，观察记录亚硝酸根离子颜色，与比色卡(参见图6)比较，估算反应后浓度；
3)通过两次比色卡颜色比较，估算出反应过程中亚硝酸根离子的浓度，进而可以预估出待测溶液中2,4-二硝基酚污染的程度，起到定性和半定量的作用，同时可以将污染物分解，在检测的同时不产生有毒的残液。
在实验室的EP管中进行预实验：
1)配制含有一定浓度2,4-二硝基酚的溶液，稀释10倍之后分装在2个1.5mL EP管中，分别标记为1和2；
2)在EP管2中加入的OD600为3.0的菌液，30℃静置30min；
3)加入EP管1和2中分别加入显色剂，30℃静置10min，结果如图5所示，图5各标记为：①为2,4-二硝基酚溶液；②为2,4-二硝基酚溶液+显色剂；③为2,4-二硝基酚溶液+菌液；④为2,4-二硝基酚溶液+菌液+显色剂。未加入菌液的EP管1未出现紫红色(图5中的②，①为②的对照)，加入菌液的EP管2出现紫红色(图5中的④，③为④的对照)并对上述溶液进行拍照，然后与NaNO2标准浓度溶液制作的比色卡(见图6)的颜色进行比对。
4)通过两次比色卡颜色比较，估算出反应过程中产生亚硝酸根离子的浓度，大约在1-2mg/L之间，进而可以预估出待测溶液中2,4-二硝基酚污染的浓度范围，约在20-40mg/L。
c(2,4-硝基酚)＝c(亚硝酸根离子)*2*n(稀释倍数)
通过预实验，说明本发明的检测方法是可行的。
下面为具体实施例。
实施例1：用于检测化工厂污水中2,4-二硝基酚的微芯片
1)取样：采集化工厂污水口的污水，高速离心2min中或者静置10min，稀释成3个浓度梯度的待测溶液。
2)进样：采用手动进样，添加200uL待测溶液通过进样孔4注入到进样池中5，待测液沿着微通道6中依次进入第一反应池7和第二反应池8中，记录第一反应池7的颜色，30℃恒温下反应30min，记录第二反应池8的颜色。
3)比对：将第一反应池7与第二反应池8的颜色与比色卡(图6)进行比对，估算2,4-二硝基酚的污染程度。
4)其他浓度的待测液依次重复上述的步骤。
实施例2：手动检测农田土壤中2,4-二硝基酚的微芯片
1)取样：采集打了农药的田地的土壤1g，溶于无污染的纯净水中或者配制的PBS缓冲液，高速离心2min或者静置10min，稀释成3个浓度梯度的待测溶液。
2)进样：采用手动进样，添加200uL待测溶液通过进样孔4注入到进样池中5，通过进样通道，待测液沿着微通道中依次进入第一反应池7与第二反应池8中，记录第一反应池7的颜色，30℃恒温下反应30min，记录第二反应池8的颜色。
3)比对：将第一反应池7与第二反应池8的颜色与比色卡(图6)进行比对，估算2,4-二硝基酚的污染程度。
4)其他浓度的待测液依次重复上述的步骤。
实施例3：采用自动进样来检测2,4-二硝基酚的微芯片
精确、稳定的流体控制是微流控分析重复性的保证。为了精确进样，可以采用自动进样来精准控制进样体积，提高检测结果的准确性。可以设计并制作简单操作的芯片内部微柱塞泵，考虑到过高的液体流速会在反应腔室引入气泡，需要控制液体的流速在10μL/s以内。其他操作与手动进样类似。
实施例4：高通量检测2,4-二硝基酚的微流控芯片
为了实现多个样品的快速检测，可以设计高通量微芯片来检测样品中污染物。如图4所示，在芯片中设计平行并列3组检测通道，同时进行3组样品的检测。在检测装置易携带的条件下，调节装置的大小以及反应槽的尺寸，可以并列设计多组检测反应通道，达到简便、高效的目的。
上述实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

Claims (8)

1.一种微流控生物芯片检测装置，其特征在于，包括由上向下依次设置的上层盖片(1)、中间层(2)和下层垫片(3)，其中，上层盖(1)上开设有进样孔(4)和排气孔(10)，中间层上设置有若干检测通道，每个检测通道包括进样池(5)、第一反应池(7)、第二反应池(8)和废液池(9)；进样池(5)与进样孔(4)连通；排气孔(10)与废液池(9)相连；进样池(5)、第一反应池(7)第二反应池(8)以及废液池(9)通过微流道(6)连通。
2.根据权利要求1所述的一种微流控生物芯片检测装置，其特征在于，上层盖片(1)为聚二甲基硅氧烷基片。
3.根据权利要求1所述的一种微流控生物芯片检测装置，其特征在于，中间层(2)为双面胶膜。
4.根据权利要求1所述的一种微流控生物芯片检测装置，其特征在于，下层垫片(3)为透明玻璃片。
5.一种如权利要求1所述的微流控芯片检测装置的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：在聚二甲基硅氧烷基片上切割进样孔(4)和排气孔(10)，然后对聚二甲基硅氧烷基片表面进行等离子体处理，形成上层盖片；
步骤2：在DSA膜上切割若干检测通道，每个检测通道包括进样池(5)、第一反应池(7)、第二反应池(8)与废液池(9)，形成中间层(2)，将上层盖片(1)放在中间层(2)顶部，将下层垫片(3)放在中间层(2)底部，进样孔(4)与进样池(5)相连通，排气孔(10)与废液池(9)相连通，并且进样池(5)、第一反应池(7)、第二反应池(8)与废液池(9)之间通过微通道(6)相连通；
步骤3：在第一反应池(7)和第二反应池(8)中各加入显色溶液，并在第二反应池(8)中加入OD600为3.0的菌液，然后冷冻干燥，制得微流控生物芯片检测装置；其中，菌液中细菌为寡营养单胞菌XM-1。
6.根据权利要求5所述的微流控芯片检测装置的制备方法，其特征在于，等离子体处理的具体条件为：采用室内空气，在0.3mbar的压强下，80-90℃下，热烘15-30min。
7.一种如权利要求1所述的微流控生物芯片检测装置对硝基酚污染物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将待测溶液通过进样孔(4)注入到进样池中(5)，通过进样通道(6)，在第一反应池(7)中与显色剂混合，观察记录亚硝酸根离子颜色，与比色卡比较，估算初始浓度；
2)随后反应液进入到第二反应池(8)中，与菌液反应，反应30min中后，观察记录亚硝酸根离子颜色，与比色卡比较，估算反应后浓度；
3)通过两次比色卡颜色比较，估算出亚硝酸根离子的浓度，进而预估出待测溶液中2,4-二硝基酚污染的程度。
8.一种根据权利要求7所述的对硝基酚污染物的检测方法，其特征在于，比色卡通过以下过程制得：
配制亚硝酸钠标准溶液，加入亚硝酸盐显色剂，根据标准溶液生成的偶氮化合物颜色的深浅来制作比色卡；其中，亚硝酸盐显色剂通过以下过程制得：将对氨基苯磺酸0.5g加入到质量浓度10％的稀醋酸150mL中，得到A液；将α-萘胺0.1g与蒸馏水20mL加入到质量浓度10％的稀醋酸150mL中，得到B液，将等体积的A液和B液混合均匀，得到亚硝酸盐显色剂。
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