CN101213022B - 自动医学诊断盒体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测包括一个或多个核酸序列的样本中目标核苷酸序列的存在、缺失和/或量的盒体。盒体包括可相互连接的第一元件和第二元件，第一元件包括至少第一流体开口和第一密封面，第二元件包括至少第二流体开口和第二密封面。在第一元件和第二元件连接时，第一流体开口和第二流体开口可成流体连通地放置、且第一密封面和第二密封面可相互紧靠地放置以密封第一流体开口与第二流体开口之间的流体连通。本发明特征在于，盒体包括用于沿着第一密封面方向偏压第二密封面的偏压装置。

Description

自动医学诊断盒体
技术领域
本发明涉及用于检测特定DNA或RNA序列存在、缺失或量的盒体(cartridge)。本发明也涉及有选择地包括盒体以检测特定DNA或RNA序列存在、缺失或量的系统的使用。
发明背景
自DNA发现以来，有关在样本中检测特定DNA或RNA序列存在、缺失或量的技术已有巨大进展。尤其是PCR即聚合酶链反应已为检测DNA或RNA序列的存在和缺失的各种类型测定的发展作出了巨大贡献。目前已能够从生物体采集包含DNA的样本并检测其中某一特定DNA序列(目标序列)的存在、缺失或量。可获得同时进行这种多重目标序列分析即称为目标序列多重检测的技术，从而提高处理能力。
目前还没有在如糖尿病情况下血糖含量测量等常规基础上进行这种类型分析。通常需要机构完善的实验室，还必须采用细致的规程，以避免交叉污染并确保所得结果的可靠性，即将试验的假阳性或假阴性读数减至最低。然而，由于仍涉及大量经培训和监督人员的许多手工劳动，因而本领域仍需要克服目前DNA或RNA分析方法的上述缺点。尤其是已知RNA分析非常难，因为大气中和熟练分析员手上存在少量RNA所以很易于发生污染。而且，目前的分析方法既费力又耗时。典型地，由于取样、从样本中离析DNA或RNA、随后对样本中目标序列存在、缺失或量分析的化验、对所获得任何结果的处理和对结果相应展现等各个系统间的处理，传统DNA或RNA分析的有效程序约需要六个小时。
用于DNA检测的基于盒体的系统已被公开。
如美国专利5,882,903公开的一种DNA检测系统。该系统包括具有一个或多个反应室的第一组件和包括多个流体室的第二组件。每一流体室均装有DNA检测过程中所使用的流体。这些流体包括清洗流体、溶解流体和含有扩增缓冲剂及合适引物的扩增液。反应室用于进行如清洗、溶解和扩增等不同检测步骤。
已知盒体的第一组件为盘形元件，第二组件为可放在盘形元件外部的环形元件。所述盘形元件包括在其周边的外圆柱形密封面，外圆柱形密封面紧靠环形元件内圆柱形密封面放置。在密封面中设置流体开口以使流体室与反应室流体连通，使得不同流体可在它们之间交换。
已知盒体的缺点在于第一和第二组件必须被非常精密地制造，以设置第一和第二密封面之间的适当密封。因此重要的是第一和第二组件必须相对于彼此可活动，以使第一组件和第二组件的不同流体开口可流体连通，但同时当第一组件的流体开口与第二组件的流体开口流体连通时应获得适当的密封。由于对第一和第二组件尺寸的精确要求，盒体易于不适当密封，从而造成第一和第二组件之间的污染。
发明内容
本发明的目的是设置没有上述问题的盒体。
该目的通过依照权利要求1前序部分的盒体实现，其特征在于，盒体包括用于向着第一密封面的方向偏压第二密封面的偏压装置。通过向着第一密封面方向偏压第二密封面，可能在这些密封面之间获得导致更好密封的更好配合。例如偏压装置可包括可在所述方向上对第二元件的至少一部分施加力的弹簧状元件。
所述偏压装置可包括在第一元件或第二元件的一个中，或两个元件中。但偏压装置也可设置为单独部分。
在一个实施例中，第二元件包括沿着垂直于第二密封面的方向至少是柔性的柔性部分。通过设置沿着垂直于第二密封面的方向至少是柔性的柔性部分，第二密封面可更易于紧靠第一密封面放置。因此，在该实施例中，无需整个第二元件沿着第一密封面的方向被偏压。
在一个实施例中，第二元件包括两个或多个柔性部分，柔性部分分别具有第二流体开口和相关第二密封面、且分别沿着垂直于相应第二密封面的方向至少是柔性的。通过为不同流体开口和相关密封面设置不同的柔性部分，更易于在第一和第二元件之间获得适当密封，因为对于流体开口的每一组合，第一和第二密封面可紧靠放置，而与第一和第二元件的其他流体开口和相关密封面无关。
在一个实施例中，第一元件和第二元件中的每个包括两个或多个流体开口、及对应的第一和第二密封面，第一和第二密封面中的每个大体是扁平的，第一和第二密封面的每个的平面分别大体上相互平行。在该实施例中，所有密封面大体上相互平行，使得沿着特定方向(通常沿着第一元件方向)移动或偏压第二元件将改善所有第一与第二密封面之间的密封。
在一个实施例中，第一元件是盒体的主体部分，第二元件是包括一个或多个热循环室的PCR本体。在优选实施例中，可提供多个不同的PCR本体，可选用其中一个PCR本体与盒体的主体部分相连。这些不同的PCR本体可例如包括不同数目的反应室、不同尺寸的反应室和/或特别设计用于检测特定量细菌等的不同组的引物。
当用户使用这种与主体部分相连的单独PCR本体时，必须易于正确地将PCR本体放置并锁定在主体部分上。为确保易于获得PCR本体的流体开口与主体部分之间的适当密封，从而有利于利用本发明，因此PCR本体的流体开口的密封面被偏压至盒体的主体部分的相关密封面。
在一个实施例中，所述偏压装置包括将第二元件锁定在第一元件上的锁定机构。通过将偏压装置与锁定机构组合，在第一和第二元件连接时可在单一操作中将第二元件锁定在第一元件上，并向第一元件的第一密封面的方向偏压第二元件的第二密封面。锁定机构可包括锁定第一元件和第二元件的任何适当装置，如快接、搭扣和螺钉装置等。
在一个实施例中，在连接之后，第二元件可相对于第一元件至少在第一和第二流体开口流体连通的第一位置、与流体连通被阻隔的第二位置之间移动。在盒体特定实施例中，例如两处理室之间的流体连通可被暂时封闭。由于上述结构，可利用第一元件向第二元件的转换以(暂时)关闭两个流体开口之间的流体连通。这样，由于无需单独的阀机构，两相连处理室之间需要很少空间。这特别有利，因为较少的多余流体将被从一个处理室泵送至另一个处理室。
在一个实施例中，至少第一和第二元件被设置有分别包括第一流体开口和密封面或第二流体开口和密封面的密封元件，阀元件被构造成在第一位置在第一和第二流体开口之间提供流体连通，并在第二位置阻隔流体连通，阀元件还被构造成在第一和第二位置相对环境密封第一和第二流体开口。
本发明提供适于检测DNA和/或RNA存在、缺失或量的盒体。DNA和/或RNA存在、缺失或量的检测表征例如基因、基因的等位基因、基因特征或失调、多态性、单核苷酸多态性(SNP)的存在、缺失或量、或生物体中外源DNA或RNA存在，即生物体中病原体或细菌的存在、缺失或量。通过本发明可开发出用于制备治疗被诊断疾病的制剂的合适药物。例如，在来自生物体(如人类)的样本(如血液)中检测出病原体(如病毒)可作出诊断和相应的治疗(如抗生素)。
盒体可以是能装于可再用仪器中的可更换型。这种盒体可以是一次性、在经过清洗之后可循环利用或可再用。通过设置可更换的盒体，所有可与样本接触的部分均可在检测过程结束后从仪器中取出，且盒体可互换或在下次使用前被清洗。在其它实施例中，盒体可为每次使用后被清洗的可再用仪器的整体部分。
在特定实施例中，仪器包括用以控制离析装置、扩增装置和/或检测装置的控制单元。控制单元能自动控制DNA的离析、DNA的扩增和扩增的DNA的检测。
盒体包括一个或多个室，在检测过程中样本被容纳在室内。这种室可包括用以将样本引入盒体的引入室、用以溶解样本中细胞的溶解室、用于清洗的清洗室、用于DNA扩增的一个或多个热循环室、以及能进行检测的检测室。还能设置单个室用于实现所述有关室的一种或多种功能。在该实施例中，引入室、溶解室、清洗室、热循环室和检测室中的两个或多个室可结合在单个室中。
在检测过程的不同步骤中，样本将被放在相应室中。为此，在两个处理步骤之间样本将从一个室转移至另一室。为实现这种转移，每一室通过流体通道至少与另一室连通。在至少一个但优选在每一这些流体通道中可设置一个阀装置，优选地阀装置通常关闭流体通道，但在致动阀装置时打开流体通道从而使相应两个室流体连通。阀装置可被设计为单向阀。
在特定实施例中，阀装置由阀致动机构致动。阀致动机构优选布置在可再用仪器中。
在特定实施例中，设置泵送装置，用于将样本或其他任何用于检测过程的流体如溶解缓冲剂、试剂、清洗和离析缓冲剂、预扩增缓冲剂等从一个室泵送至另一室。这些泵送装置可由泵致动装置致动，泵致动装置优选布置在可再用仪器中。
在特定实施例中，该系统包括用于数据采集的装置和/或数据处理的装置。这些装置将用于已检测DNA的分析和/或对结果的解释。特别是在特定实施例中，数据处理装置能够将目标核酸的存在、缺失或量(或其组合)与特定诊断联系起来。例如这种数据处理装置可以是具有数据库的计算机的形式。
在特定实施例中，该系统还包括用于引入一个或多个样本的装置。这种样本引入装置可包括如用于从注射器或吸液管等引入样本的夹持或对接机构的任何适用机构，并且例如可包括单向入口阀、隔膜、过滤器和溢水口。
在特定实施例中，该系统还可包括溶解机构。在可受控制单元控制的溶解机构中，样本经过处理以提供处于可从样本中离析的形式的样本中的任何核酸。该溶解步骤典型包括细胞的溶解，以使细胞和/或核膜破裂从而释放出其内所包含的核酸。不仅可利用物理或机械操作装置进行溶解步骤，还可利用如溶解缓冲剂等化学装置进行样本中细胞的溶解。可设置混合装置来混合样本和溶解缓冲剂。本领域教科书中已知细胞溶解方法。如果需要，这种方法可适用于本系统。溶解步骤产生的任何废物均可被丢弃至例如废物机构。
在特定实施例中，样本插入机构和溶解机构可被组合。
在特定实施例中，该系统也可包括有选择地受控制单元控制的浓缩机构。浓缩机构使得DNA从已溶解样本中离析。为此，浓缩机构配备如磁性颗粒等的DNA离析装置。在该实施例中，本发明的DNA或RNA被吸引到磁性颗粒上。被吸引的核酸物质可经过一个或多个清洗、排放和/或净化步骤，以除去任何不需要的物质，如包含在样本中的生物物质残余物和非DNA和/或RNA的其他样本成分。当被吸引的DNA或RNA为所需纯度时，其可从磁性颗粒被解吸或洗提。浓缩机构也可配备用于混合、分离和离析DNA或RNA的物理或机械操作流体的装置。
在特定实施例中，该系统也可包括浓缩步骤(即DNA或RNA离析)所需的试剂，如缓冲剂、清洗液、水、过滤剂、磁珠等。
在特定实施例中，该系统还可包括用于容纳浓缩步骤产生的任何废物例如用过的缓冲剂、清洗液等的废物机构。
在特定实施例中，系统的不同废物机构可以对不同的目的或容量而是分离的。在特定实施例中，此处所述两个或多个废物机构可被组合以容纳采用本发明方法产生的所有废物。
在特定实施例中，该系统还包括有选择地受控制单元控制的预扩增机构。例如，预扩增机构可用于增加待分析DNA或RNA的总量。从离析步骤中得到的DNA或RNA经预扩增步骤可增加DNA总量。这是有利的，尤其在对离析的DNA进行多重测试以例如在一个样本中同时检测多个病原体的存在、缺失或量等的多重分析的情况下。本领域有可获得的适用技术以增加DNA量，这通常被称为全基因组扩增。
在预扩增机构中，离析和净化的DNA或RNA可用预扩增缓冲剂进行预处理，在全基因组扩增情况下用酶和DNTPs进行预处理。预扩增机构可与用于处理材料的废物机构相连。
在特定实施例中，预扩增机构也可用于进行特定核酸检测的特定化验。实例如Applera(SNPplex)、Keygene(SNPWave)和MRC-Holland(MPLA)提供的OLA-PCR类技术。
在特定实施例中，系统包括扩增机构。扩增机构可受控制单元控制。如本文其它地方描述为有选择地被预处理的离析DNA在扩增机构中经扩增机构中的扩增处理。扩增处理包括使离析DNA与专用于目标核酸的一组PCR引物、诸如一个或多个聚合酶的PCR酶和dNTPs接触。
在特定实施例中，扩增机构有多个室。多个室使得离析或预扩增的DNA或RNA被分成多个部分并分布在各室。在每一室中，可用不同组的引物进行扩增步骤。如此可提供多重分析，因为一个样本可用于不同目标核酸的存在、缺失或量的分析。在多重分析情况下，每一目标核酸的引物组配备有可检测的不同标记，即不同的荧光光谱。
在特定实施例中，系统也可包括用于扩增离析DNA的试剂，如酶、DNTPs等。
在特定实施例中，所述系统还可包括检测机构。检测机构可受控制单元控制。检测机构适用于检测扩增的DNA或RNA并优选地检测包括在扩增产物中的标记。
所述检测机构可基于标记、长度、迁移率、核苷酸序列、质量或其组合进行检测。在特定实施例中，检测机构可基于光学、电化学、磁性或迁移率(凝胶电泳)进行检测。原则上可采用现有技术已知的任何适用的检测机构。
在特定实施例中，所述系统还包括数据采集机构以采集从检测机构获得的数据。
在特定实施例中，所述系统还包括用于处理数据的数据处理机构。
在本发明的一个方面，提供用于检测包括一个或多个核酸序列的样本中目标核苷酸序列存在、缺失和/或量的方法，其中所述方法包括以下步骤：
--提供来自生物体的样本；
--进行从样本离析核酸序列的步骤；
--进行核酸序列(或其部分)的扩增步骤从而提供扩增子；
--在样本的核酸序列中检测与目标核苷酸序列对应的扩增子的存在、缺失和/或量。
在特定实施例中，所述方法在本发明所限定的盒体中进行。
在特定实施例中，目标核苷酸序列可从包含DNA、基因组DNA、RNA、mRNA、cDNA、转基因DNA等的组中选择。在特定实施例中，生物体是人类、非人类动物、微生物或植物。
在特定实施例中，样本是组织、诸如唾液、精液、血液、尿液的体液、和/或排泄物。
在特定实施例中，目标核苷酸序列为外源序列。
在特定实施例中，目标核酸序列为病原体。
在特定实施例中，含有核酸序列的样本被溶解以释放所包含的核酸序列。在特定实施例中，如本领域已知且标准教科书中所述，溶解的样本经过一系列清洗和采集步骤，目的是从样本中离析核酸。这些步骤可以在单独中进行或在一系列多重步骤中进行。核酸从样本中离析后，使用选择性地检测目标核酸的引物，使核酸进行扩增反应。
核酸扩增方法通常使用两种引物，dNTPs和(DNA)聚合酶。优选的扩增方法是PCR。“PCR”或“聚合酶链反应”是一种用于特定DNA片段体外酶扩增的快速过程。通过加热样本，使待扩增DNA变性。在DNA聚合酶和多余脱氧三磷酸核苷存在时，低聚核苷酸特定地与目标序列引物杂交形成新DNA合成物。一轮合成导致确切长度的新链，就如亲代链，可在变性和退火时与引物杂交。变性、退火和合成的第二循环产生两个单链产物，它们共同组成不连续的双链产物，恰好为引物两端之间长度。这种不连续产物随连续每轮扩增呈指数形式积聚。经20至30个周期，可获得不连续片段的数以百万倍的扩增。PCR规程在本领域是已知的、并且描述在标准实验室教材如Ausubel等人的Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons公司(1995)中。可利用的其它多重和/或等温扩增方法包括例如LCR、自主序列复制(3SR)、Q-β-复制酶介导的RNA扩增、滚环扩增(RCA)或链置换扩增(SDA)。
由检测器进行标记的扩增子的检测以产生检测数据。当然，检测器依赖于通用系统进行目标序列扩增子之间的辨别，但也依赖于引物上呈现的如荧光或磷光标记等标记。为辨别样本中的不同目标序列之间的差别，优选利用各相应扩增子的荧光光谱的差别。在特定实施例中，至少有一个引物包括标记，优选为前向引物包括一个标记。标记可从一大群组中选择，其中包括如染料、载色体或酶的荧光和/或磷光基团、抗原、重金属、磁探头、磷光基团、放射性标记、化学发光基团或电化学检测基团。在特定实施例中，标记为荧光或磷光染料。这种染料的实例是FAM、HEX、TET、JOE、NED和(ET-)ROX。染料如FITC、Cy2、德州红(TexasRed)、TAMRA、Alexa fluor 488TM、氟硼荧FL、若丹明(Rhodamine)123、R6G、氟硼荧530、AlexafluorTM532。
通过采用分别包含不同标记的不同引物组，通过使用附加标记可增加样本中可被辨别的目标序列数目、及因此是样本中可被检测的目标序列数目。在一个样本中可被用于多重方法的标记最大数目主要通过可用检测平台的检测容量限度进行控制。
在特定实施例中，使用具有对样本中目标序列有选择性而对任何其它序列没有选择性的至少一个前向和至少一个后向引物的聚合酶链反应进行扩增。
在特定实施例中，前向或后向引物的至少一个被标记。
在特定实施例中，扩增步骤可被检测样本中核酸的化验抢先或替代。
在特定实施例中，扩增子基于标记、长度、迁移率、核苷酸序列、质量或其组合被检测。
在特定实施例中，扩增子基于光学、电化学或磁性被检测。
附图说明
图1显示了根据本发明实施例的系统的透视图；
图2显示了根据本发明系统的实施例的结构的示意方框图；
图3显示了根据本发明的盒体的实施例的(图4中B-B)示意横截面图；
图4显示了图3中实施例的示意顶视/(图3中A-A)横截面图；
图5显示了根据本发明PCR盘可能实施例的更详细顶视图；
图6显示了图5中PCR盘的横截面图；
图7显示了根据本发明的密封元件的透视详图；和
图8显示了通过锁定机构与盒体主体部分相连的PCR盘的透视图，所述锁定机构包括偏压装置。
具体实施方式
图1显示了用于检测包括一个或多个核酸序列的样本中目标核苷酸序列存在、缺失和/或量的系统的实施例，所述系统通常以参考序号1表示。所述系统包括具有壳体3(部分剖开)的可再用仪器2。
仪器2中设置有凹部4。可更换盒体5被可拆卸地设置在该凹部4中。盒体5可以是可再用、可再生或一次性的。
为了可进行检测，盒体5包括用于引入样本的引入装置、用于离析DNA的离析装置、用于扩增DNA的扩增装置、以及用于检测扩增的DNA的检测装置。所述引入装置、离析装置、扩增装置和/或检测装置可布置在盒体上和/或在可再用仪器中。通常优选地将在仪器2中布置系统1所有通常不与样本接触的部分。在检测全过程中样本被容纳在作为起作用盒体的盒体中。
以下描述引入装置、离析装置、扩增装置和/或检测装置的布置的优选实施例。但是，其它实施例也是可能的。
仪器2包括以下将描述的用于自动控制检测过程不同步骤的控制单元7。
此外，所述仪器2包括用于致动布置在盒体上的不同元件的一个或多个致动机构。这些致动机构可包括用于致动用于泵送流体的一个或多个泵送装置的一个或多个泵送装置致动机构、用于致动在盒体流体通道中布置的一个或多个阀的一个或多个阀致动机构、以及用于设置盒体一个或多个部分的例如旋转或平移运动的例如机械致动机构等其它致动机构。
在仪器中设置可检测DNA存在、缺失和/或量的检测机构。为此DNA可放在布置在盒体上的检测室中。检测机构可根据由现有技术已知的光学、电化学或磁性原理工作。也可应用任一其它适用的检测方法。
仪器可还包括数据采集机构和数据处理机构，分别用于采集从检测机构获得的数据和处理这些数据。
仪器2包括支承盒体5的载体6。所述载体6可在较低位置(该处显示载体)和较高位置之间沿着垂直方向移动。在较低位置，盒体5可被放在载体6上或从载体6取下。较高位置是在检测过程中盒体5被放置的工作位置。在该较高位置，盒体被夹紧在载体6与布置在盒体上例如泵送装置、阀、机械装置等的多个机构之间，且检测室可与布置在仪器2中的例如泵送装置、阀、其它机械致动机构等对应机构和检测机构相互配合。
在一替代实施例中，包括对应机构的仪器2的一部分也可能朝向或远离仪器2中的盒体移动。
图2是示意方框图，显示了使用依照本发明方法的检测过程的不同处理步骤。该示意图用于说明盒体5的主要结构以及仪器2和盒体5之间的关系。
在第一步骤(“样本插入”)中，样本被引入盒体5中。为此，盒体5包括样本通过其可被引入盒体5中的引入机构。引入机构可为例如用于从针筒或吸管等引入样本的任一适用机构，并可包括容纳或对接机构、单向入口阀、隔膜、过滤器和溢流口。在引入样本后，该样本可被导入引入室。
在第二步骤(“溶解”)中，样本被处理，以在样本中设置处于可从样本中被离析的形式的任何核酸。该溶解步骤典型地包括细胞的溶解，以使细胞和/或核膜破裂从而释放其中所包含的核酸。溶解步骤在作为溶解机构一部分的溶解室中进行。该溶解室例如通过流体通道与样本引入机构流体连通。可设置泵送装置，用于从引入室向溶解室泵送样本。
在一优选实施例中，引入室和溶解室为同一室。
在一个实施例中，溶解机构包括用于溶解步骤的物理或机械操作装置。在另一实施例或同一实施例中，如溶解缓冲剂等化学制品(也)可用于溶解样本中的细胞。这种溶解缓冲剂可在使用前装在与溶解室流体连通的单独的溶解缓冲剂容器中。在连接溶解缓冲剂容器与溶解室的流体通道中可设置阀，优选为单向阀。
可设置用于混合的装置以混合样本和溶解缓冲剂。这些混合装置可由所述仪器致动。
在仪器2的控制单元的控制下进行溶解及可能的混合。所述阀和泵送装置通过布置在仪器2中的阀和泵送装置致动机构被致动。
溶解步骤所产生的任何废物流体可被丢弃至例如盒体中可能存在的废物机构。这种废物机构可体现为与溶解室流体连通的废物室。在第三步骤(“浓缩”)中，布置在盒体中的浓缩机构使得DNA从溶解的样本中离析。为此，浓缩机构可配备例如磁性颗粒等用于DNA离析的装置。
所述浓缩步骤在与溶解室流体连通的浓缩室中进行。在溶解室与浓缩室之间流体通道中，设置阀使得仅在需要时流通通过流体通道是可能的。所述阀可被仪器中设置的阀致动装置致动。
在本实施例中，本发明的DNA或RNA被吸引在磁性颗粒上。被吸引的核酸材料可经过一个或多个清洗、排水和/或净化步骤以去除任何不需要材料，例如样本中包含的残余生物材料以及非DNA和/或RNA的其它样本成分。该清洗和净化步骤显示为图2中第四步骤“清洗和净化”。但是“清洗和净化”步骤也可被视为“浓缩”步骤的一部分。当被吸引的DNA或RNA为所需纯度，它可被从磁性颗粒解吸或洗提。清洗和净化步骤在清洗室中进行。在本实施例中该清洗室与浓缩室相同。但是，在其它实施例中可设置单独的室。
盒体5设置有用于分别容纳清洗缓冲剂和洗提缓冲剂的一个或多个清洗缓冲剂和洗提缓冲剂容器。这些清洗缓冲剂与洗提缓冲剂容器均与清洗室流体连通，而且提供流体连通的每一流体通道均被设置有阀，优选为单向阀。可为浓缩步骤即DNA或RNA离析所需的其它试剂设置相似容器。
浓缩机构的阀由仪器2的阀致动机构致动且可受控制单元7控制。
在一替代实施例中，浓缩机构也可配备用于混合、分离并离析DNA或RNA的物理或机械式流体操作装置。这种物理或机械操作装置可由仪器2致动机构致动且可受仪器的控制单元7控制。
例如用过的缓冲剂、清洗液等浓缩步骤产生的任何废物可被导入废物机构。作为盒体一部分的该废物机构与溶解机构中所述的废物机构可为相同废物机构。作为替代，溶解步骤和浓缩步骤的废物机构可以不同，以用于不同目的或容积。
在第五步骤(“预扩增”)中，通过使用预扩增机构可增加待分析的DNA或RNA总量。从离析步骤至预扩增步骤获得的受试DNA或RNA可增加DNA总量。这是有利的，特别是对离析DNA进行多重试验的多重分析情况下，例如同时检测一个样本中多种病原体的存在、缺失或量时。
预扩增机构包括在其中进行预扩增的预扩增室。预扩增室与浓缩室和/或清洗室可以是相同室或不同室。预扩增机构受控制单元7控制。
在预扩增机构中，离析和净化的DNA或RNA可用预扩增缓冲剂进行预处理，在全基因组扩增的情况下用酶和DNTPs进行预处理。使用前，该预扩增缓冲剂容纳在与例如清洗室的前一处理室流体连通的缓冲剂容器中。阀可设置在流体通道中，提供流体连通。
预扩增机构可与用于处理材料的废物机构连接。
在第六步骤(“扩增”)中，离析的DNA在扩增机构中被扩增处理，本文其它地方描述为有选择地被预处理。扩增处理包括使离析的DNA与专用于目标核酸的一组PCR引物、诸如一个或多个聚合酶的PCR酶和dNTPs接触。
为此扩增机构包括多个扩增室。多个扩增室使得离析或预扩增的DNA或RNA被分成多个部分、并分布在各室。在每一室中可利用不同组引物进行扩增步骤。按照这种方式，提供多重分析，因为可对一个样本进行不同目标核酸的存在、缺失或量的分析。在多重分析的情况下，每一目标核酸的引物组可配备有可检测到的不同标记，例如具有不同的荧光光谱。
盒体可包括试剂容器，以容纳用于扩增离析DNA的试剂，例如酶、DNTPs等。
在最终步骤(“检测”)中，检测扩增DNA或RNA、以及优选地为被包括在扩增产物中的检测标记。为此系统1包括检测机构。该检测机构包括布置在盒体5上的检测室。检测机构其它部分可布置在如上所述可再用的仪器2中。检测室与一个或多个扩增室流体连通，以便同时或此后由一个或多个扩增室引入DNA或RNA。在流体通道中可设置将检测室与一个或多个扩增室连通的阀。
检测机构可受控制单元7控制。检测机构可基于标记、长度、迁移率、核苷酸序列、质量或其组合进行检测。在特定实施例中，检测机构可基于光学、电化学、磁性或迁移率(凝胶电泳)等原理进行检测。原则上可使用现有技术已知的任一适用检测机构。
所检测信息可通过数据采集装置采集、并由数据处理装置处理，以进行例如特定诊断。
在盒体中的所有流体流可通过盒体内设置的泵送装置获得。这种泵送装置可基于压缩或膨胀盒体内空间尤其是各个处理室即引入室、溶解室、预扩增室、清洗和净化室、扩增室和检测室的空间、以及各个试剂容器的空间工作。这些泵送装置也可为任一其它适用类型。
盒体中的泵送装置由仪器2中设置的泵送装置致动机构致动。这些泵送装置致动机构受控制单元7控制。
在不同处理室即引入室、溶解室、预扩增室、清洗和净化室、扩增室和检测室、以及各个试剂容器之间的流体通路或通道中可设置阀，以仅在需要时允许流动。由于多数流体将仅沿一个方向通过流体通道，阀优选为单向阀。
阀由优选布置在仪器2中的阀致动机构致动。
如上所述的所有步骤可受控制单元7控制。
图3和图4更详细显示了通常以参考序号10表示的盒体实施例，其中可进行如上所述的方法。盒体包括具有许多处理室和下文将描述的流体处理系统的通用部分11。
以下依照当用于检测包括一个或多个核酸序列的样本中目标核苷酸序列的存在、缺失和/或量的检测方法被执行时的使用顺序描述盒体10的不同部分。
包括在盒体10中的第一特定应用部分为预溶解机构12。该预溶解机构12配置为将样本处理至可被盒体10处理的特定状态。
例如样本可以例如干血块的固态形式提供，而盒体被设计为处理流体状态的样本。此时样本在可被盒体处理之前必须被转为流体状态。可通过在预溶解机构12的培养基中提供适用酶进行这种处理。本领域已知这种处理例如胰蛋白酶化。通过提供可与通用部分11连接的预溶解机构，可实现样本处理至所需状态，而无需在处理后转移样本，于是避免造成污染的风险。样本处理至所需状态可在预溶解机构与通用部分11连接之前或之后进行。
当样本已处于可被盒体处理的状态而无需处理样本时，预溶解机构也可显示为样本引入机构。由于样本引入机构被设计为与通用部分11连接以将样本引入盒体10，样本引入机构用于将样本引入盒体而不会造成任何污染危险。
当样本被引入盒体10时，其可被泵送至溶解室13。盒体10的通用部分11包括流体处理装置，流体处理装置包括用于泵送样本至不同处理室的泵和阀。通常通用部分11包括两个主体元件14、15，它们相对紧靠设置且中间有柔性膜16。两主体元件14、15包括凹部，所述凹部连同柔性膜16可形成泵送室、阀、流体通道、流体储存站等。
在附图所示盒体中，样本主要被保持在柔性膜之上，而泵17和阀18主要从柔性膜16底侧被致动。流体可通过移动柔性膜被泵送进入或流出室，以分别增大或减室内空间。通过将空气或流体引入柔性膜16与元件15之间的空间，柔性膜可例如被移动。空气或流体可通过通道19被引入。其他泵送室也可以相应方式被用作泵送室。也可使用用于移动柔性膜的其它装置例如机械致动器等。阀可被空气或流体压力、机械致动或任一其它适用致动机构致动。柔性膜16相对于元件14的移动也可用于打开或闭合阀座，由此例如在阀闭合位置，柔性膜16保持紧靠元件14的通道端。
具有上述类型的用于处理流体的泵17和阀18的这种基于盒体的系统本身以前已经被公开，但是并非用于本发明用途。其中可参考US6156270、USD37164、USD351913、US6382923、US6663359、US6416293、US4865584和US4479760。
在溶解室13中，样本如以上与图2相关的步骤2所述将被溶解。设置溶解储存器20，用于在溶解缓冲剂被泵送入溶解室之前储存溶解缓冲剂。
在溶解步骤后，样本可被泵送至第二处理室21，其中样本可如上所述依照步骤3被浓缩、并依照步骤4被清洗和净化。设置流体储存器22，用于储存在清洗和净化步骤中可被使用的不同清洗和净化缓冲剂。这些流体储存器22通过阀与第二处理室21流体连通。
在也可在第二处理室21或室23中进行的可能预扩增(如与图2相关的步骤6所述)之后，样本可被引入PCR本体24。
该PCR本体24为盒体第二特定应用部分。PCR本体24为圆盘形，并利用快接连接25与通用部分11连接。
PCR本体24包括六个热循环室26，使得可同时对样本进行六个PCR处理。这种PCR扩增处理如与图2相关的上述步骤6所述。每一热循环室26具有至少一个特定引物。
PCR本体25可从均包括不同组引物、不同数目的室和/或不同室尺寸或几何形状的一组不同类型PCR本体中选择。例如包括引物的PCR本体可根据待检测的细菌/抗性组选择，所述选择可专用于特定测定或用于例如欧洲、亚洲或非洲等特定地域。
引物通过例如喷墨印制方法被点印在热循环室壁上，使得在PCR本体储存过程中无需采取特殊措施以避免引物流出PCR本体，这例如就是如果使用流体状态引物的情况。在这种情况下，可设置密封或单独的密封室，用于在使用前容纳引物以及任一其它特定应用流体。
扩增步骤之后，扩增的DNA或RNA、及优选地是包括在扩增产物中的标记被泵送至检测机构27。该检测机构或至少其一部分为盒体10的第三特定应用部分，其为单独部分且可与通用部分11连接。在所示实施例中检测机构通过快接连接与通用部分11连接。
根据检测方法和/或检测装置的类型(如本申请中所述；特别是与图2相关描述的步骤六)，检测机构可从对每一相应检测方法专门设计的一系列不同特定应用检测机构选出。
在一些情况下，将被用于盒体10中的检测机构的类型依赖于用于扩增处理的PCR本体类型。PCR本体的选择将自动得到检测机构的选择。
通用部分11和特定应用部分设置有识别机构，使得在通用和特定应用部分装配后，可检查是否形成正确组合。可使用更先进的识别系统，例如包括可被自动检查并甚至可被追踪历史的识别标签的RF标签。作为在盒体中处理样本过程中的一个步骤，这种检查和历史追踪可由可再用仪器的控制单元控制。
具有通用部分和一个或多个特定应用部分的本盒体的结构的附加优点是，通用部分与每一特定应用部分之间的连接可易于制成不透气的，使得样本与盒体中使用的其它流体所在的全部空间与外界环境封闭。这样可避免样本引入盒体、以及在其中处理过程中的样本污染，因为样本处于具有自身内部压力的封闭环境中，样本的处理可独立于直接环境中的空气压力，也独立于诸如湿度的其它环境条件。这使得样本处理可能更加可靠。
可以想象，依照本发明的盒体可包括与以上提出的特定应用部分不同的其它特定应用部分。盒体中这种其它的单独的特定应用部分的应用应视为属于本发明范围内。这种特定应用部分的实例可包括用于容纳例如酶、试剂和用于特定应用的其它化学物质等流体的流体容器、用于特定应用的具有不同几何特征或尺寸的混合机构和其它机械操纵机构。
本发明也可用于须经预处理或被保存在盒体其它部分不适合或不需要的特定温度下的盒体特定部分。例如，提供可用于预处理或储存在不同位置、且可因此在使用前与盒体通用部分连接的单独流体容器可能是非常有用的，因为流体不必在开放环境中从容器被转移至盒体，该部分尤其是其中流体的污染危险可被避免。
即使相同部分用于许多不同应用中，这种单独部分的使用被认为是本发明范围内的特定应用。这种单独部分的实例是用于容纳在盒体上使用前必须被储存在低温下的被称为PCR主混合液的单独流体容器。在盒体即将被引入可再用的仪器之前，单独流体容器通过例如快接连接与盒体通用部分连接。
图5和图6更详细地显示了基本为盘形的PCR本体，其整体以参考序号30表示。PCR本体30包括六个热循环室31，它们均能在PCR处理过程中容纳流体。PCR本体30包括环形主体部分32和六个指状柔性部分33。本文中指状是指柔性部分33在一端(在此情况下是径向外端)与环形主体部分32连接，而相反端是自由端，即未与PCR本体30任一部分固定连接。换句话说，柔性部分33仅在一侧与环形主体部分32连接，而另一侧是自由的。由于该指状结构，柔性部分33在垂直于盘形PCR本体30主平面的方向(图6中向上或向下方向)是柔性的。
在热循环室31底侧设置有流体开口34，以使在热循环室31和盒体另一部分的处理室之间可形成流体交换。该流体开口34位于柔性部分33其远离环形主体部分32的一端，以使该流体开口34和相应密封面35可在PCR本体30与其相连的盒体主体部分的方向被偏压。该柔性部分33的偏压可通过偏压装置获得。这些偏压装置可包括在PCR本体30和/或盒体主体部分中。在本实施例中，偏压装置包括在也可用于锁定盒体主体部分的PCR本体30的单独锁定机构中。该锁定机构还将参照图7进行描述。
通过偏压柔性部分33、或至少流体开口34及相应密封面35的位置，获得PCR本体30和盒体主体部分之间的更好密封。这种适当密封是重要的，因为采用这种方式可避免盒体中包含的流体的泄漏，更重要地可避免该流体的污染。此外，由于如上所述盒体优选为封闭系统，尤其当盒体流体系统内的压力大于外界环境(空气)压力时，PCR本体向盒体主体部分的偏压防止泄漏和污染。在图5和图6所示的实施例中，密封面35大体相互平行放置，其优点是向主体部分偏压整个PCR本体改善了所有流体开口34相对于主体部分的密封。通过如上所述的多个柔性部分33可进一步改善密封。
此时，更详细描述PCR本体30的结构。PCR本体30包括元件36，所述元件包括环形主体部分32和六个柔性部分33。六个柔性部分33中均设置有凹部，凹部限定了热循环室31的底部和各侧面。在元件36顶部布置箔片37以限定热循环室31上侧。箔片37可为柔性的，使得当流体被泵送进入热循环室中时，箔片37被伸展以使热循环室31中空间增加。箔片37的弹性随后被用于泵送流体流出热循环室31返回。此时柔性箔片37被设计为由于热循环室31中提供的压力向外伸展，元件36中设置的凹部可大体上比图7实施例所示较小，或甚至可被忽略。
箔片37可通过例如使用胶、(双面)胶带、焊接或熔化等已知方法与元件36连接。也可使用更具刚性的材料替代箔片以封闭凹部形成热循环室31。但是，考虑到其上述伸展性能且重量轻，箔片为优选。而且，箔片或其它材料可制成透明的，以使热循环室31内部可见，和/或采用特定颜色作为代码表示例如特定组引物的PCR本体类型。
元件36优选地在注塑模制工艺中由塑料制成，但是，元件36也可用任一其它适用材料及任一适用工艺制成。箔片37也优选地由塑料材料制成。
PCR本体30还包括密封元件38和一部分流体开口34，所述密封元件包括密封面35。密封元件38优选地由例如橡胶等适合作为密封材料的相对柔软的材料制成。通过设置单独密封元件38，当密封元件38的材料和形状可为密封特别设计时，PCR本体30和盒体主体部分之间的密封可被改善。
将PCR本体30连接在盒体主体部分上之后，PCR本体30可相对盒体主体部分在流体开口34与盒体主体部分上的流体开口流体连通的第一开通位置、与流体开口34和盒体主体部分上相应的流体开口之间的流体连通被闭合的第二闭合位置之间旋转。本领域技术人员将清楚的是，在开通和闭合位置处，PCR本体30和盒体主体部分之间均须充分密封以防止泄漏和污染。因此，对开通和闭合位置，密封元件38在开通位置(图6左侧)和闭合位置(图6右侧)均被设置适当密封面35。在图7中更详细显示密封元件38。
通过在开通和闭合位置之间相对盒体主体部分移动PCR本体30，这两部分之间的转换作为阀。由于无需单独阀机构以开通和/或闭合热循环室31与盒体主体部分之间的流体连通，这是有利的。由于使用相对少量流体，这在本发明应用中特别有利。单独阀机构的存在将要求额外流体空间，该额外空间在流体通过阀机构被泵送后需要充满流体。该流体此后则不能再用于PCR处理中。
在图5和图6所示实施例中，所有流体开口34在开通位置与盒体主体部分的流体开口流体连通，而对所有流体开口34流体连通在闭合位置被闭合。在一替代实施例中，可使一些流体开口34的开通位置与其它流体开口34的闭合位置对应，即一些流体开口34与主体部分流体连通、而其它流体开口34闭合。也可设置多个开通和/或闭合位置，以选择性地使一个或多个流体开口34与主体部分流体连通，而其它流体开口被闭合。例如，对具有六个热循环室的PCR本体，可具有三个流体开口与主体部分流体连通而另外三个流体开口被闭合的第一开通位置、另外三个流体开口与主体部分流体连通而最初三个流体开口被闭合的第二开通位置、以及所有流体开口均被闭合的闭合位置。同一PCR本体也可包括七个位置，包括例如所有流体开口被闭合的闭合位置、以及流体开口中选定的一个与主体部分流体连通而其它流体开口被闭合的六个开通位置。在本实施例中，优选地同时开通所有流体开口34，以使在一次泵送动作过程中所有热循环室可被充入相同量流体。
在PCR本体30的环形主体部分32的外周设置凹部39，以使PCR本体30相对盒体主体部分的旋转位置已知。为此，在盒体中设置可被放在凹部39中的凹口。凹部39也可被用于在开通和闭合位置之间旋转PCR本体30。但是在本实施例中，旋转通过锁定机构(如图8所示)被传递至PCR本体30。
在本实施例中，PCR本体30包括在六个不同柔性部分33上的六个热循环室31。根据PCR本体30的实际应用，可设置具有相同或不同容量的不同数目的热循环室31。在一个柔性部分33上可设置一个或多个这种热循环室31。在该实施例中，也可使一个热循环室31包括两个或多个流体开口34或者一个流体开口34与两个或多个热循环室31连通。对于PCR本体30这种实施例，具有与PCR本体连接的特定数目的流体开口的盒体的一个通用主体部分可易于用于具有不同数目的热循环室的PCR本体。
图8显示了具有十个热循环室的PCR本体40的透视图，其中每一热循环室设置在连接到盒体主体部分41的柔性部分43上。为了将PCR本体40锁定在盒体主体部分41上，设置锁定机构42，锁定机构42通过盘形PCR本体40中心放置。锁定机构42与盒体主体部分41具有快接连接，但也可使用任意其它适用连接装置例如螺钉或搭扣装置。锁定机构42包括多个呈弹簧元件44形式的偏压装置，偏压装置分别向主体部分41偏压PCR本体柔性部分43之一。此外，由于PCR本体相对锁定机构42仅可被放在一个位置，图8所示锁定机构42被设计为固定PCR本体40旋转位置。
由于柔性部分43在它们被偏压方向是柔性的，弹簧元件44推动PCR本体的密封面紧靠主体部分41的相应密封面。这在主体部分41与PCR本体40之间提供适当密封，并由此防止系统的流体泄漏和/或污染。
锁定机构42的顶端45被设计成与可再用仪器中的致动器连接，用于致动PCR本体40在开通与闭合位置之间的旋转运动。
本领域技术人员将清楚的是，如上所述在PCR本体40与盒体的主体部分41之间的本发明连接也可被用于在盒体中使用、且在检测处理过程中在它们之间进行流体交换的两元件的任何其它组合。所有这些实施例均落在本发明范围内。

Claims (13)

1.一种用于检测包括一个或多个核酸序列的样本中目标核苷酸序列的存在、缺失和/或量的盒体，所述盒体包括可相互连接的第一元件和第二元件，所述第一元件包括至少第一流体开口和第一密封面，所述第二元件包括至少第二流体开口和第二密封面，其中，在第一元件和第二元件连接时，第一流体开口和第二流体开口可成流体连通地放置、且第一密封面和第二密封面可相互紧靠地放置以密封第一流体开口与第二流体开口之间的流体连通，其特征在于，所述盒体包括用于向着第一密封面方向偏压第二密封面的偏压装置，偏压装置包括在将第二元件锁定在第一元件上的锁定机构中，锁定机构包括至少一个弹簧元件，以便向着第一密封面的方向偏压第二密封面。
2.如权利要求1所述的盒体，其特征在于，第二元件包括沿着垂直于第二密封面的方向至少是柔性的柔性部分。
3.如权利要求2所述的盒体，其特征在于，第二元件包括两个或多个柔性部分，柔性部分分别具有第二流体开口和相关的第二密封面、并且分别沿着垂直于相应第二密封面的方向至少是柔性的。
4.如权利要求1至3任一所述的盒体，其特征在于，所述第一元件和第二元件中的每个包括两个或多个流体开口、以及对应的第一密封面和第二密封面，第一密封面和第二密封面中的每个大体上是平坦的，第一密封面和第二密封面中的每个的平面分别大体上相互平行。
5.如权利要求1至4任一所述的盒体，其特征在于，第二元件是盘形、并包括环形主体部分和多个指状柔性部分，每一柔性部分的一端与主体部分连接、且柔性部分的相反端是自由的，所述相反端包括第二流体开口和第二密封面。
6.如权利要求1至5任一所述的盒体，其特征在于，第一元件是盒体的主体部分，第二元件是包括一个或多个热循环室的PCR本体。
7.如权利要求6所述的盒体，其特征在于，每一第二流体开口是所述一个或多个热循环室中的一个热循环室的入口和出口。
8.如权利要求6或7所述的盒体，其特征在于，所述一个或多个热循环室中的每个由主体与柔性箔片之间的空间形成，所述柔性箔片在所述空间边缘与所述主体结合，第二流体开口与所述空间流体连通。
9.如权利要求1至8任一所述的盒体，其特征在于，在连接之后，第二元件相对于第一元件至少在第一流体开口和第二流体开口流体连通的第一位置、与流体连通被阻隔的第二位置之间移动。
10.如权利要求9所述的盒体，其特征在于，在第一元件和第二元件连接之后，第二元件可相对第一元件绕旋转轴线旋转，其中，第一元件和第二元件分别包括大体上布置在绕旋转轴线的圆上的两个或多个流体开口。
11.如权利要求9或10所述的盒体，其特征在于，第一密封面或第二密封面中的至少一个由相对柔软材料制成。
12.如权利要求9至11任一所述的盒体，其特征在于，第一元件和第二元件中的至少一个设置有密封元件，所述密封元件分别包括第一流体开口和密封面或第二流体开口和密封面，阀元件被构造成在第一位置提供第一流体开口与第二流体开口之间的流体连通、并在第二位置阻隔流体连通，所述阀元件还被构造成在第一位置和第二位置相对环境密封第一流体开口和第二流体开口。
13.如权利要求8和9任一所述的盒体，其特征在于，锁定机构被构造成用于在第一位置与第二位置之间移动第二元件。
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Assignee: Guangzhou Wanfu catis Biotechnology Co., Ltd

Assignor: Wanfu Cadiz Co., Ltd

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Denomination of invention: Automatic medical diagnosis box

Granted publication date: 20100609

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