JP7020922B2 - 自動反応カートリッジにおける、DNAメチル化の統合精製及び測定並びに突然変異及び/又はmRNA発現レベルの同時測定 - Google Patents
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Description
本出願は、すべての目的のためにその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、2015年6月15日に出願のUSSN62/175,916号の優先権を主張するものである。
[適用なし]
i)核酸を含む生体試料を、第1のカラム又はフィルターを構成する第1のマトリックス材料と接触させる工程であって、前記マトリックス材料が前記試料中の核酸と結合する及び/又はそれを濾過することによってDNAが精製される工程と、
ii)結合したDNAを第1のマトリックス材料から溶出させ、DNAを変性させて、溶出された変性DNAを生成する工程と、
iii)溶出されたDNAを亜硫酸水素塩試薬の存在下で加熱して、脱アミノ化核酸を生成する工程と、
iv)前記脱アミノ化核酸を、第2のカラムを構成する第2のマトリックス材料と接触させて、前記脱アミノ化核酸を前記第2のマトリックス材料と結合させる工程と、
v)結合した脱アミノ化核酸を脱スルホン化する、並びに/又は脱アミノ化核酸をアルカリ溶液と接触させることによって核酸を同時に溶出及び脱スルホン化して、変換された(たとえば亜硫酸水素塩変換された)核酸を生成する工程と、
vi)前記亜硫酸水素塩変換された核酸を前記第2のマトリックス材料から溶出させる工程と、
vii)前記変換された核酸に対して、メチル化特異的PCR及び/又は核酸シーケンシング及び/又は高分解能融解分析(HRM)を行って、前記核酸のメチル化を決定する工程と
を含み、少なくとも工程iv)からvi)を単一の反応カートリッジで行う、核酸のメチル化状態を決定するための方法。
試料を含有する第1のチャンバーと、
グアニジニウムチオシアネート-エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する第2のチャンバーと、
亜硫酸水素塩試薬を含有する第3のチャンバーと、
緩衝液を含有する第4のチャンバーと、
すすぎ溶液を含有する第5のチャンバーと、
溶出/脱スルホン化試薬を含有する第6のチャンバーと
を含む、実施形態11~22のいずれか一項に記載の方法。
試料を含有する第1のチャンバーと、
グアニジニウムチオスルフェート-エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する第2のチャンバーと、
亜硫酸水素塩試薬を含有する第3のチャンバーと、
緩衝液を含有する第4のチャンバーと、
すすぎ溶液を含有する第5のチャンバーと、
溶出/脱スルホン化試薬を含有する第6のチャンバーと
を含むように構成されている、実施形態92~111のいずれか一項に記載のカートリッジ。
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー(248b)、
ヌクレオチド配列:AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー(249b)、
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー(250)、
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー(251)、及び
ヌクレオチド配列フルオル-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-遮断剤(配列番号268)を含むプローブ(252a)。
ヌクレオチド配列:GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー(102)、
ヌクレオチド配列:CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー(103)、
ヌクレオチド配列:GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー(148)、
ヌクレオチド配列:CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー(149)、及び
ヌクレオチド配列:フルオル-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-遮断剤(配列番号179)を含むプローブ(178)。
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー(248b)、
ヌクレオチド配列AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー(249b)、
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー(250)、
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー(251)、及び
ヌクレオチド配列フルオル-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-遮断剤(配列番号268)を含むプローブ(252a)。
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー(102)、
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー(103)、
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー(148)、
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー(149)、及び
ヌクレオチド配列フルオル-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-遮断剤(配列番号179)を含むプローブ(178)。
前記試料溶液を、実施形態143~154のいずれか一項に記載のカートリッジ内の試料受けチャンバー内、又は実施形態155~168のいずれか一項に記載のカートリッジ内の試料受けチャンバー内にローディングする工程と、
前記カートリッジを操作して、前記試料中のDNAを前記アフィニティーマトリックスと結合させ、その後、前記DNAを前記マトリックスから洗浄及び解放する工程と
を含む、血清又は血漿からcfDNAの試料を調製する方法。
前記試料を含有する前記溶解溶液を加熱する工程と、アルコールを前記試料に加えて試料溶液を形成する工程と、前記試料溶液を、実施形態143~154のいずれか一項に記載のカートリッジ内の試料受けチャンバー内、又は実施形態155~168のいずれか一項に記載のカートリッジ内の試料受けチャンバー内にローディングする工程と、
前記カートリッジを操作して、前記試料中のDNAを前記アフィニティーマトリックスと結合させ、その後、前記DNAを前記マトリックスから洗浄及び解放する工程と
を含む、FFPE試料からDNAを調製する方法。
請求項190から225のいずれか一項に記載のカートリッジを利用して、そのメチル化状態が癌のマーカーである前記DNAにおいて1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出する工程であって、前記1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化の増加が、癌の存在又は癌に対する素因又は癌若しくは前癌の段階の指標である工程と
を含む、対象において癌を検出する及び/又は癌を段階決定する及び/又は癌に対する素因を検出する方法。
変換したDNAを脱スルホン化して、シトシン残基はウラシルへと変換されているが、5-メチルシトシン残基は実質的に影響を受けていないDNAを生成する工程と
を含む、5-メチルシトシン残基が実質的に影響を受けないように保ちつつ、DNA中のシトシン残基をウラシルへと変換する方法。
実施形態286~296のいずれか一項に記載の方法に従って前記試料中のDNAを変換する工程と、
変換された核酸に対してメチル化特異的PCR及び/又は核酸シーケンシング及び/又は高分解能融解分析(HRM)を行って、前記核酸のメチル化を決定する工程と
を含む、DNAのメチル化を分析する方法。
DABSOを含む変換試薬を含有する容器と、
脱スルホン化試薬を含有する容器と
を含む、DNAのメチル化状態を検出するためのキット。
ヌクレオチド配列AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー、
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー、
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー、及び
ヌクレオチド配列フルオル-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-遮断剤(配列番号268)を含むプローブ。
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー(102)、
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー(103)、
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー(148)、
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー(149)、及び
ヌクレオチド配列フルオル-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-遮断剤(配列番号179)を含むプローブ(178)。
以下のプライマー及びプローブ:
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー、
ヌクレオチド配列AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー、
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー、
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー、及び
ヌクレオチド配列フルオル-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-遮断剤(配列番号268)を含むプローブ
を含むネステッドPCR反応を使用して、MGMTメチル化のメチル化特異的PCRを行う工程と、
前記MGMT遺伝子のメチル化を決定するためにPCR増幅産物を検出及び/又は定量する工程と
を含む、メチル化特異的PCRを使用してMGMTのメチル化を決定する方法。
以下のプライマー及びプローブ:
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー、
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー、
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー、
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー、及び
ヌクレオチド配列フルオル-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-遮断剤(配列番号179)を含むプローブ
を含むネステッドPCR反応を使用して、ACTBメチル化のメチル化特異的PCRを行う工程と、
前記ACTB遺伝子のメチル化を決定するためにPCR増幅産物を検出及び/又は定量する工程と
を更に含む、実施形態310に記載の方法。
本発明の理解を促進するために、多数の用語及び語句を以下に定義する。
ある特定の実施形態において、DNAの抽出、亜硫酸水素塩変換、及びメチル化特異的PCRは全て、カートリッジで実施される。1つの例示的な実施形態において、ユーザーは、試料を溶解/結合試薬に加えた後、試薬を短時間混合/攪拌し、次に試料をカートリッジの試料ポート又はチャンバーに加える。例示的なしかし非制限的な溶解試薬(FFPE切片に特に十分に適した試薬を含む)は、本明細書において記述される試薬に関して参照により本明細書に組み込まれている、PCT特許公開番号WO2014/052551(PCT/US2013/061863)に記述される。
1)DNA精製
2)DNA変性
3)DNA変換(例えば、亜硫酸水素塩の脱アミノ化)、及び
4)アルカリ脱スルホン化
i)核酸を含む生物試料を、第一のカラム又はフィルターを含む第一のマトリックス材料と接触させる工程であって、前記マトリックス材料が前記試料中の核酸と結合する及び/又はそれを濾過することによってDNAを精製する工程と、
ii)結合したDNAを第一のマトリックス材料から(例えば、アルカリ溶液を使用して)溶出させ、DNAを変性させて、溶された変性DNAを生成する工程と、
iii)溶されたDNAを、変換試薬(例えば、亜硫酸水素塩イオンを提供する試薬)の存在下で加熱して、変換された(例えば、脱アミノ化された)核酸を生成する工程と、
iv)変換された核酸を、第二のカラムを含む第二のマトリックス材料と接触させて、前記脱アミノ化核酸を前記第二のマトリックス材料と結合させる工程(ある特定の実施形態において、第二のカラムは第一のカラムとは異なるカラムであってよく、又は他の実施形態において、同じカラムをもう一度使用することに注意されたい)と、
v)結合した脱アミノ化核酸を脱スルホン化する、及び/又は脱アミノ化核酸をアルカリ溶液と接触させることによって核酸を同時に溶出及び脱スルホン化して、変換された(例えば、亜硫酸水素塩変換)核酸を生成する工程と、
vi)変換された核酸を、第二のマトリックス材料から溶出させる工程と
を含み、少なくとも工程iv)から工程vi)を単一の反応カートリッジで行うことを含む。
vii)変換された核酸についてメチル化特異的PCR及び/又は核酸シーケンシング、及び/又は高分解能融解点分析(HRM)を実施して、核酸のメチル化を決定する工程を更に含み、少なくとも工程iv)からvi)を単一の反応カートリッジで行う。
ある特定の実施形態において、カートリッジベースのアッセイ(例えば、GENEXPERT(登録商標)カートリッジを利用して)においてDNAメチル化(MSP)と共に遺伝子のRNA発現の変化の両方を同時精製及び検出するための方法が提供される。ある特定の実施形態において、これらのアッセイは、例えば、同じ試料調製物から腫瘍特異的メチル化に相関するDNMTの発現の変化を同定するであろう。ある特定の実施形態において、これらのアッセイは、発現及びメチル化状態を確認するために使用できる。
DNAメチル化を評価するために、多数の分析法をカートリッジで実施できる。或いは、ある特定の実施形態において、変換された(例えば、亜硫酸水素塩又はDABSO変換)DNAのさらなる分析のために、カートリッジをもう1つの装置及び/又はシステムに連結させうる。例示的な方法には、メチル化特異的PCR(MSP)、直接シーケンシング、高分解能融解分析(HRM)、パイロシーケンシング(付加によるシーケンシング)、塩基特異的切断分析(例えば、塩基特異的MALDI-TOF)等が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
様々な実施形態において、メチル化特異的PCRを使用して、標的DNAのメチル化状態を評価できる。MSPは、非変換5-メチルシトシンのみと相補的な配列を含めることによって「メチル化特異的」となるように、又は逆に非メチル化シトシンから変換されたチミンと相補的な配列を含めることによって「非メチル化特異的」となるように設計されたプライマー及び/又はプローブを利用する。次に、特異的プライマーが増幅を達成する能力によってメチル化を決定する。この方法は、増幅される標的内での非変換メチルシトシンの数が増加すれば、PCRの特異性が増加することから、メチル化密度が高い領域においてCpGアイランドを調べるために特に有効である。ある特定の実施形態において、プライマーの3'末端でCpG対を配置することもまた、特異性を改善する。
ある特定の実施形態において、メチル化DNAは、当業者に周知のPCR法を使用して検出できる。ある特定の実施形態において、ネステッドPCR反応は、メチル化標的を検出するために使用される。1つの例示的なしかし非制限的な実施形態において(例えば、実施例4を参照されたい)、最初の15~20サイクルPCR反応がメチル化に対して特異的ではないが、変換されたDNA配列のみに対して特異的である場合(すなわち、それらが、CpGと交叉しないか、又はR=プリン又はY=ピリミジンを使用してメチル化及び非メチル化鋳型配列の両方を捉える場合)、ネステッドPCRプロトコールを使用できる。第二のqPCR反応(例えば、45サイクルのqPCR反応)は、典型的には2~3個のメチル化CpGに対して特異的であるプライマーとプローブの両方を含みうる。
ある特定の実施形態において、DNAのメチル化状態は、直接シーケンシング法を使用して決定しうる。ある特定の実施形態において、方法は、PCR及び標準的なジデオキシヌクレオチドDNAシーケンシングを利用して、亜硫酸水素塩変換に対して抵抗性のヌクレオチドを直接決定できる(例えば、Frommerら、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (5): 1827~1831頁を参照されたい)。様々な実施形態において、プライマーは、鎖特異的並びに亜硫酸水素塩特異的(例えば、それらが非亜硫酸水素塩処置DNAと相補的でないように、非CpGシトシンを含むプライマー)で、目的のメチル化部位に隣接する(しかし含まない)ように設計される。したがって、メチル化特異的PCRとは対照的に、これはメチル化及び非メチル化配列の両方を増幅する。非メチル化シトシンの全ての部位は、得られたセンス鎖の増幅配列においてチミンとして表示され、増幅されたアンチセンス鎖においてアデニンとして表示される。ある特定の実施形態において、ネステッドPCR法を使用して、シーケンシングのための産物を増強しうる。
ある特定の実施形態において、高分解能融解分析(HRM)を使用して、非変換亜硫酸水素塩処置DNAから変換型を区別できる。HRMは、融解の際の温度上昇及び結果としてのインターカレート蛍光色素の放出によってPCRアンプリコンを直接分析する、定量的PCR技術である(例えば、Wojdacz and Dobrovic (2007) Nucleic Acids Res. 35(6): e41を参照されたい)。アンプリコンにおけるCのTに対する含有量によって表されるメチル化の程度は、融解及びその後の色素の放出の迅速性を決定する。この方法は、直接定量を可能にするが、特異的CpG部位よりむしろ増幅領域におけるメチル化を全体として評価する。
ある特定の実施形態において、パイロシーケンシング(合成によるシーケンシング)を使用して、メチル化特異的PCRを使用することなく、亜硫酸水素塩処置DNAを分析しうる(例えば、Colellaら、(2003). BioTechniques 35(1): 146~150頁; Tostら、(2003) BioTechniques 35(1): 152~156頁等を参照されたい)。合成によるシーケンシングは、ジデオキシヌクレオチドによるチェーンターミネーションとは異なり、ヌクレオチド取り込み時のリン酸塩放出の検出を利用するという点でサンガーシーケンシングとは異なる。DNA配列は、典型的には、一度に付加されて利用できるのは、可能性があるA/T/C/Gヌクレオチドの4つのうち1つのみであり、したがって一本鎖鋳型(決定される配列)上に一文字のみを取り込むことができるという事実により、次の相補的なヌクレオチドの取り込みの際に放射される光によって決定できる。
ある特定の実施形態において、塩基特異的切断/MALDI-TOFは、ヌクレオチド変化から得られる情報を増強するために塩基特異的切断工程を追加することによって亜硫酸水素塩変換を利用する(Ehrichら、(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 (44): 15785~15790頁)。目的の領域のRNAへのin vitro転写を最初に使用することによって(初回増幅時にPCRプライマーにRNAポリメラーゼプロモーター部位を付加することによって)、RNアーゼAを使用して、塩基特異的部位でRNA転写物を切断しうる。RNアーゼAは、シトシン及びウラシルリボヌクレオチドでRNAを特異的に切断し、塩基特異性は、シトシン特異的(C特異的)切断が望ましい場合には切断抵抗性dTTPの取り込みを追加することによって、及びウラシル特異的(U特異的)切断が望ましい場合にはdCTPの取り込みを追加することによって達成される。次に、切断された断片をMALDI-TOF又は他の方法によって分析できる。亜硫酸水素塩処置によって、増幅された逆鎖において、CからUへの変換による切断部位の導入/除去、又はGからAへの変換による断片質量のシフトのいずれかが起こる。C特異的切断では、メチル化されたCpG部位のすべてで特異的に切断が起きる。得られた断片のサイズを分析することによって(例えば、MALDI-TOF、キャピラリー電気泳動、マイクロチップ電気泳動等を使用して)、領域全体としてのメチル化の程度の決定よりむしろ、領域内のCpG部位のDNAメチル化の特異的パターンを決定することが可能である。
メチル化感受性一本鎖コンフォメーション分析(MS-SSCA)は、単一ヌクレオチド多型(SNP)分析のために開発された一本鎖コンフォメーション多形分析(SSCA)に基づく(Biancoら、(1999) Hum. Mutat. 14(4): 289~293頁)。SSCAは、非変性電気泳動における異なる移動度に基づいて、同一サイズであるが異なる配列の一本鎖DNA断片を識別する。MS-SSCAにおいて、これは目的のCpG部位を含む亜硫酸水素塩処置されたPCR増幅領域を識別するために使用される。SSCAは、単一ヌクレオチドの差のみが存在する場合感度を欠如するが、亜硫酸水素塩処置はしばしば、目的のほとんどの領域において多数のCからTへの変換を生じ、結果として感度は高くなりうる。ある特定の実施形態において、MS-SSCAはまた、バンド強度の比率に基づいてDNAメチル化の程度の半定量的分析を提供できる。しかし、典型的には、MS-SSCAは、個々のメチル化部位よりむしろ目的の領域における全てのCpG部位を全体として評価する。
上記のように、DNAメチル化は、多数の状況において重要である。ある特定の実施形態において、DNAメチル化の量は、特に腫瘍学において臨床的に重要である。異常なDNAメチル化パターン(正常組織と比較して高メチル化及び低メチル化)は、多数のヒト悪性疾患に関連している。高メチル化は典型的には、プロモーター領域におけるCpGアイランドで起こり、遺伝子の不活化に関連している。より低いレベルの白血球DNAメチル化は、多くのタイプの癌に関連している(Zhangら、(2011) Epigenetics, 6(3): 293~299頁)。全体的な高メチル化はまた、異なる機序を通して癌の発生及び進行にも関係している。典型的には、腫瘍抑制遺伝子の高メチル化及び腫瘍遺伝子の低メチル化が存在する(例えば、Lundら、(2004) J. Biol. Chem. 279(28): 29147~29154頁を参照されたい)。
ある特定の実施形態において、メチル化状態が膵癌の存在及び/又は予後のマーカーである1つ又は複数のプロモーターのメチル化状態を決定する。ADAMTS1又はBNC1の1つ又は複数のメチル化の頻度を使用して、膵癌を検出及び/又は段階決定することができることが決定された。このため、膵癌の例示的なしかし非制限的なメチル化マーカーには、ADAMTS1及び/又はBNC1が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。これらの遺伝子のプロモーターでメチル化を検出するための例示的なプライマー及びプローブを、以下のTable 4(表4)(特定の配列に関してTable 5(表5)を参照)、及び実施例4のTable 10(表10)に示す。ある特定の実施形態において、プライマー及びプローブは、変換されたDNAのフォワード鎖のメチル化の検出及び/又は変換されたDNAのリバース鎖のメチル化の検出のために提供される。
ある特定の実施形態において、メチル化状態が乳癌の存在及び/又は予後のマーカーである1つ又は複数のプロモーターのメチル化状態を決定する。乳癌の例としてのメチル化マーカーには、RASSF1A、及び/又はAKR1B1、及び/又はHOXB4、及び/又はHIST1H3C、及び/又はRASGRF2、及び/又はTM6SF1が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。これらの遺伝子のプロモーターでのメチル化を検出するための例示的なプライマー及びプローブを、以下のTable 4(表4)(特定の配列に関してはTable 5(表5)を参照)、及び実施例4のTable 9(表9)に示す。
様々な実施形態において、本明細書に記載される方法はネステッドPCR反応を包含することができ、本明細書に記載されるカートリッジは、そのようなネステッドPCR反応のための試薬(例えば、プライマー及びプローブ)を含むことができる。例えば、ある特定の実施形態では、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つの遺伝子(遺伝子プロモーター)についてメチル化が検出される。DNAの亜硫酸水素塩変換はシトシン残基をウラシルに変化させるが、5-メチルシトシン残基は影響を受けないため、変換された(亜硫酸水素塩で変換された)DNAのフォワード鎖及びリバース鎖はもはや相補的ではない。したがって、メチル化検出にさらなる特異性及び感度を提供するために、フォワード鎖及びリバース鎖を独立して調べることが可能である(例えば、マルチプレックスPCR反応において)。そのような場合、単一の標的をアッセイすることには、2重のマルチプレックスアッセイが包含される一方で、2、3、4、5、又は6個の標的遺伝子をアッセイすることには、4重、6重、8重、10重、又は12重のマルチプレックスアッセイが含まれる。ある特定の実施形態では、アッセイは、例えば、フォワード及びリバース鎖を独立してアッセイするために、2つのマルチプレックス反応に分割することができる。しかしながら、複数のマルチプレックスアッセイに分離する場合、アッセイのグループ分けはフォワードか又はリバースかによるものである必要はなく、特定のPCR反応条件に最も適合するプライマー/プローブセットを単に含めることができることが認識されるであろう。
1)FAM、TMR、テキサス・レッド、及びCy5;
2)FAM、TET、TMR、及びテキサス・レッド;
3)FAM、HEX、テキサス・レッド、及びCy5;並びに
4)FAM、Cy3、テキサス・レッド、及びCy5が含まれるが、それらに限定されない。
1)FAM、TET、HEX、TMR、ROX、及びテキサス・レッド;並びに
2)FAM、HEX、LCレッド610、LCレッド640、LCレッド670、及びLCレッド705が含まれるが、それらに限定されない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法(例えば、DNAメチル化及び任意選択でRNA発現の決定)を行うためのカートリッジが提供される。ある特定の実施形態では、カートリッジは、第1のマトリックス材料を含むカラム、試料受けチャンバー、温度制御チャネル又はチャンバー、試薬及び/又は緩衝液を含有する複数のチャンバーを含み、使用中は前記チャンバーの少なくとも1つがDNA変換試薬(例えばDABSO及び/又は亜硫酸水素塩試薬)を含有しており、前記チャンバーの少なくとも1つが脱スルホン化/溶出緩衝液を含有しており、前記カートリッジは任意選択で前記第2のマトリックス材料を含む第2のカラムを含む。ある特定の実施形態では、カートリッジは、使用時に、グアニジニウムチオシアネートエタノール(GTC-EtOH)を含む試薬を含有するチャンバーを含むように構成される。ある特定の実施形態では、第2のカラムは存在せず、他の実施形態では、第2のカラムが存在する。ある特定の実施形態では、温度制御チャネル又はチャンバーは、単に加熱チャネル又はチャンバーであってもよく、又は熱サイクリングチャネル又はチャンバーであってもよい。ある特定の実施形態では、カートリッジは、第2の加熱チャネル又はチャンバー(例えば、第2の熱サイクリングチャネル又はチャンバー)を更に含む。ある特定の実施形態では、カートリッジは、DNA変換ステップ(例えば、亜硫酸水素塩インキュベーション)及び/又は脱スルホン化ステップが、1つ又は複数のPCR反応が後で行われる同じ反応チューブ又はチャンバー内で行われるように構成される。
様々な実施形態では、大きな試料量の調製のためのカートリッジが提供される。ある特定の実施形態では、試料調製カートリッジは、大量の試料調製のために改変された(例えば、図20に示されるような)GENEXPERT(登録商標)カートリッジを含む。ある特定の実施形態では、例えば、カートリッジがGENEXPERT(登録商標)に基づく場合、カートリッジは、DNAに結合する親和性マトリックスを含む1つ又は複数のチャネル又はチャンバー、中央弁アセンブリの周囲に配置され、前記中央弁アセンブリと選択的に流体連結する複数のチャンバーを含み、中央弁アセンブリは、中央弁と流体連結しているチャンバーの内外に流体を引き込むことができるプランジャーを収容するように構成され、前記複数のチャンバーは、それぞれ約4mlまで(又は約5mlまで)の試料溶液を受け入れるように構成された少なくとも2つの異なるチャンバー(ある特定の実施形態では、チャンバー2は約4mlの最大体積を有する一方で、チャンバー3は約4.5mlの最大体積を有する)、PEG(例えば、PEG200)を含有するチャンバー、アルカリ溶液(例えば、KOH溶液)を含有するチャンバー、及び緩衝液(例えば、Tris)を含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態では、複数のチャンバーは、それぞれが約4mlまで(又は約5mlまで)の試料溶液を受け入れるように構成された少なくとも3つの異なるチャンバーを含む。ある特定の実施形態では、複数のチャンバーは、洗浄溶液(例えば、典型的には1.25Mグアニジニウムチオシアネート、25mM Tris pH7.0、50%エタノールであるGTC-エタノール洗浄溶液)を含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態では、カートリッジは、処理された試料を取り除くように構成されたチャンバーを含む。ある特定の実施形態では、試料チャンバーは、使用時に、試料溶液、GTC及びアルコール(例えば、イソプロパノール)を含む。ある特定の実施形態では、試料チャンバーは、使用時に、実質的に等しい体積の試料溶液、GTC及びアルコールを含む。ある特定の実施形態では、カートリッジは、使用時に、試料を受け入れるように構成された前記チャンバーの各々に配置された4mlの試料溶液GTC及びイソプロパノールを含む。ある特定の実施形態では、カートリッジは、0.5mlと約4mlの間の試料の試料体積に対して実質的に直線的なDNA又はRNA回収をもたらす。
ある特定の実施形態では、血漿又は血清からの核酸の調製(及び任意選択の分析)に特に適した試料調製カートリッジが提供される。1つの例示的であるが、非限定的な実施形態を図17に示す。そこに図示されるように、ある特定の実施形態では、カートリッジは、DNAに結合する親和性マトリックスを含むチャネル又はチャンバー、中央弁アセンブリの周りに配置され、中央弁アセンブリと選択的に流体連結する複数のチャンバーを含み、中央弁アセンブリは、中央弁と流体連結しているチャンバーの内外に流体を引き込むことができるプランジャーを収容するように構成され、前記複数のチャンバーは、約5mlまで又は約4mlまでの試料溶液を受け入れるように構成されたチャンバー、PEG(例えば、PEG200)を含有するチャンバー;GTC-EtOHを含有するチャンバー;アルカリ性溶液(例えば、KOH)を含有するチャンバー;緩衝液(例えば、Tris)を含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態では、複数のチャンバーは、変換試薬(例えば、亜硫酸水素試薬)を含有するチャンバーを更に含む。ある特定の実施形態では、複数のチャンバーは、洗浄溶液(例えば、GTC-エタノール洗浄液(典型的には1.25Mグアニジニウムチオシアネート、25mM Tris pH7.0、50%エタノール)を含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態では、複数のチャンバーは、1つ又は複数のPCRプライマー及び/又はプローブを含むビーズを含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態では、PEGを含有するチャンバーは、約1mlのPEGを含有する。ある特定の実施形態では、アルカリ性溶液を含有するチャンバーは、約500μLの溶液を含有する。ある特定の実施形態では、GTC-EtOHを含有するチャンバーは、約2mlのGTC-EtOHを含有する。ある特定の実施形態では、緩衝液を含有するチャンバーは、約2mLの緩衝液を含有する。
DNAの変換及びメチル化の検出のための亜硫酸水素塩の使用と同様の方法でDNAの変換を行う目的で、DABSOを使用することができるということは、驚くべき発見であった。したがって、ある特定の実施形態では、5-メチルシトシン残基が実質的に影響を受けないように保ちつつ、DNA中のシトシン残基をウラシルに変換するDABSOを利用する方法が提供される。ある特定の実施形態では、この方法は、シトシン残基がウラシルに変換されるが5-メチルシトシン残基は実質的に影響を受けていないDNAを生成するために、DNAを含む試料をDABSOと接触させてDNAを変換し、変換したDNAを脱スルホン化することを含む。ある特定の実施形態では、DABSOは、約2Mから約5Mまでの範囲の濃度で提供される。ある特定の実施形態では、DABSOは、約2.5Mの濃度で提供される。ある特定の実施形態では、DABSOは、アルカリ性水溶液(例えば、KOH溶液)中に溶解される。ある特定の実施形態では、DABSOを含む試薬は、KOHを含む溶液に溶解されたDABSOを含む。
メチル化検出のためのキット。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を実践するためのキットが提供される。1つの例示的な実施形態では、キットは、本明細書に記載される反応カートリッジを含有する容器、本明細書に記載される試料処理試薬を含有する容器、及び本明細書に記載される変換試薬(例えば亜硫酸水素試薬)を含有する容器を含む。ある特定の実施形態では、亜硫酸水素塩試薬は、カートリッジのチャンバー内に提供される。ある特定の実施形態では、亜硫酸水素塩試薬は、カートリッジとは別の容器内に提供される。ある特定の実施形態では、試料処理試薬は、カートリッジのチャンバー内に提供される。ある特定の実施形態では、特に、試料処理試薬がグアニジニウムチオシアネートを含む場合、試料処理試薬は、カートリッジとは別の容器内に提供される。
ある特定の実施形態では、例えばDNAのメチル化状態の検出において、DABSOを変換試薬として使用するためのキットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、DABSOを含む変換試薬を含有する容器、及び脱スルホン化試薬を含有する容器を含む。ある特定の実施形態では、キットは、親和性マトリックス(例えば、シリカマトリックス材料)を含むカラムを含む。ある特定の実施形態では、キットは、結合緩衝液を含む容器及び/又は溶出緩衝液を含む容器を含む。ある特定の実施形態では、キットは、洗浄緩衝液を含む容器を含む。
この方法を検証するために、ヒトゲノムDNA(human genomic DNA; HGDNA)を、Cepheid GENEXPERT(登録商標)カートリッジの中の試料調製、亜硫酸水素塩変換、試料クリーンアップ、及びメチル化特異的qPCRをモニターするための開始試料として使用した。亜硫酸水素塩変換効率を測定するために、亜硫酸水素塩変換ステップの間に50μLのカートリッジチューブ内にDNA-亜硫酸水素塩混合物の半分をローディングし、加熱した。したがって、最適な変換条件下においては、HGDNAのおよそ半分が変換され、他の半分は変換されないままである。
図6A及び6Bは、変換されたACTBの線形性を示す。特に、図6Aは、hgDNAを用いたACTBについての15サイクルのネステッドqPCRの結果を示す。右のパネルに見られるように、シグナル(Ct値)は約25000コピーと約100コピーとの間で実質的に線形である。図6Bは、hgDNAを用いたACTBについての20サイクルのネステッドqPCRの結果を示す。これらのプロットはhgDNAについてのカートリッジの感度を実証している。ドロップアウトは、変換されたDNAの約25コピーの感度で、およそ20~50コピーで起こり始める。
図8は、変換効率の決定の結果を図示する。変換効率は、未変換のHMBSと変換されたACTBの差異の約66%(約1Ct)である。100%結合/溶出、100%変換、及び100%結合溶出を有する理想的なCtは、約24~25である。実験は、10倍減少及び約27のCtに対する50%結合/溶出、50~66%変換、及び50%結合/溶出を示すようである。
乳癌のモニタリングのためのマーカーの検出
材料及び方法:
2.5mLの結合緩衝液(2.25Mグアニジニウムチオシアネート、22.5mM Tris pH7.0、0.5%Tween20、50%エタノール、及び0.005% SE-15消泡剤)に1000個のMBA-453細胞又は25ngのヒト精子(HS)DNAを添加した。細胞又はDNAの2.5mL溶液をCepheidメチル化カートリッジのチャンバー2に添加した(図13Aのレイアウト)。メチル化カートリッジ内の残りのチャンバーを以下のように満たした: チャンバー3 - 3.2mLの洗浄緩衝液(1.25Mグアニジニウムチオシアネート、25mM Tris pH7.0、50%エタノール)、チャンバー4 - 90μLの7M亜硫酸水素アンモニウム、チャンバー5 - 4mLの50mM Tris pH8.5、チャンバー8 - 1mLのPEG200リンス、チャンバー9 - EZR(Taq)及びTSR(RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、TM6SF1の6つの標的乳癌マルチプレックス化、以下のTable 9(表9)を参照)を含む定量的PCRビーズ、チャンバー10 - 500μLの15mM KOH、及びチャンバー11 - EZR(Taq)及びTSR(RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、TM6SF1の6つの標的乳癌マルチプレックス化)を含むネステッドビーズ。その後、メチル化カートリッジをCepheid GeneXpertにローディングし、メチル化アッセイの全体を、GeneXpertにより完了させた - 最初のDNA試料調製、亜硫酸水素変換、2回目の変換後DNA試料調製、脱スルホン化、及び20サイクルのネステッド及び定量的PCR反応。
メチル化カートリッジは、亜硫酸水素塩を含むか含まない1000個のMBA-453細胞(図15A~15B)及びHIST1H3Cを除いて、各々の遺伝子プロモーターで主に非メチル化された亜硫酸水素塩を含む25ngのHS DNA(図15C)を用いて行った。亜硫酸水素塩無し又は非メチル化HS DNA対照反応(図15A、15C)のいずれにおいても、どのような標的の増幅がほとんど又は全くなかった。亜硫酸水素塩の添加により、メチル化カートリッジは、1000個のMBA-453細胞、特にAKR1B1、RASSF1A、HOXB4、及びRASGRF2からの複数の遺伝子プロモーターで高レベルのメチル化を検出した。
血漿及びFFPE試料の試料調製
図17は、PCR及び/又はメチル化検出のためのDNA試料を調製するために、使用し得るカートリッジの1つの構成を図示する。血清又は血漿から得られた試料又はFFPE試料は、単にカートリッジの試料チャンバー(例えば、チャンバー3)に導入することができ、本明細書に記載されるカートリッジの操作は、PCR及び/又はメチル化検出の準備が整った試料を提供する。
例示的であるが非限定的な一実施形態では、血清又は血漿をプロテイナーゼKで処理することによって血清又は血漿試料を調製する(例えば、cfDNAの分析用に)。その後、プロテイナーゼK処理血清/血漿を、グアニジニウムチオシアネート(GTC)、緩衝液(例えば、Tris pH7.0)、界面活性剤(例えば、Tween20)、及び任意の消泡剤(例えば、消泡剤SE15)を含む溶解溶液と混合する。アルコール(例えば、イソプロパノール)を溶液に添加し、その後、試料処理のためにカートリッジに導入する。一実施形態では、溶解溶液をTable 11(表11)に示すように処方する。プロテイナーゼK処理血清/血漿を、1.3mLのプロテイナーゼK処置血清/血漿、2.2mLの溶解溶液、及び1.5mLのアルコールに対応する比率で、溶解溶液及びアルコールと混合することができる。ある特定の実施形態では、血清/血漿試料をプロテイナーゼKで約15分間処理する。溶解溶液を添加し、約10分間、冷却保持/混合する。その後、イソプロパノールを混合物に加え、次いで処理のためにカートリッジにローディングする。
cfDNAが調製される場合、ある特定の実施形態では、DNA調製物の品質をモニタリングすることを可能にする、抽出対照を含むことが可能である。図18に図示するように、2つの異なるビーズセットが存在する。1つのビーズセットは、SAC(sample assay control;試料アッセイ対照)用の内因性HMBSプライマー及びプローブセット、及びSPC(sample prep control;試料調製対照)用の外因性BGプライマー及びプローブセットを含む。他方は、SAC(BG SPCと同様に)用に設定された内因性ベータ-グロビンPPを含む。
大体積試料調製カートリッジの試験
ある特定の実施形態では、大量の試料(例えば、約12mlから約15mlまで)の調製のために、大体積試料調製(high volume sample preparation; HSVP)カートリッジが提供される。これは、試料が低濃度のDNA(例えば、血清又は血漿中のcfDNA)を含む場合に、特に有用である。そのようなカートリッジの1つが図20Aに概略的に図示されている。そこに示されるように、カートリッジは、試料を受け入れるために使用され得る3つのチャンバー(チャンバー2、3、及び5)を提供する。図示されている実施形態では、これらのチャンバーの各々は約4mLの試料を受け取り、ある特定の実施形態では、試料は、4mLのGTC及び4mLのアルコール(例えば、イソプロパノール)と組み合わせた4mLの血漿/血清を含む。
亜硫酸水素塩変換の最適化
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるメチル化分析のためにカートリッジを使用する場合、1つの潜在的な問題は、可能な限り小さな体積を使用して溶出効率を最適化することである。少ない溶出量では、スピンカラムを使用することによる処理が簡単である。より大きな試料量を処理するためには、複数の加熱ステップを使用することによって、この問題を対処することができる。
75~80μLの亜硫酸水素塩DNAを取り込む;95℃-10秒、65℃-300秒×8加熱する;
残り+5~10μL取り込む;加圧する;95℃-480秒、65℃-1800秒×1加熱する。
DNAメチル化カートリッジとチューブベースの市販キットとの比較
図23Aは、市販のキット(QIAamp MinElute Virus Spin Kit(Qiagen社)、及びEZ DNAメチル化Lightning(商標)Kit(Zymo Research社))を使用して同じ分析を行った場合に必要となったステップと比較した、本明細書に記載されるカートリッジ(左)を使用してメチル化分析を行った場合に必要となったユーザーステップの比較を示す。容易に分かるように、キットを使用するのに必要な2~3時間の作業時間と比較して、カートリッジベースのメチル化分析は、約5分の作業時間で非常に少ないユーザーステップを必要とする。
DNA変換のためのDABSOの使用
5gのDABSOを5mLのH2Oに溶解することを最初に試みた。最終的に数mLの10M KOH及び1mLの水を添加し、加熱してDABSOを可溶化し、推定最終DABSO濃度約2.5MでpHを約pH5からpH5.5に上昇させた。
1)120μL DABSO/30μL DNA;
2)120μL Zymo/30μL DNA;及び
3)70μL Zymo/30μL DNA(カートリッジ内の現状の比率)。
メチル化DNAの検出感度
DNAメチル化の検出の感度を評価するために、本明細書に記載されるカートリッジを用いて、変換されたACTB遺伝子プロモーターをコピー数の関数として検出した。この目的は、25コピー未満の変換された非メチル化DNAを検出することであった。以前に示したように、約10~50コピーでフォールアウトが観察された(各々1回のフォールアウト)。同様の感度が、血清バックグラウンドにおけるメチル化DNA標的について観察された。
両方の鎖の逆相補性マルチプレックスアッセイ
図26は、両方のDNA鎖の逆相補性マルチプレックスアッセイの結果を図示する。亜硫酸水素塩の変換の後、両方の鎖は相補性を失う。したがって、プライマー及びプローブセットは、一方の鎖又は他方の鎖に対して設計されなければならず、独特なアンプリコンをもたらす。「より多くの機会」を提供することに加えて、この手法は感度の助けとなる可能性がある(LODで、チューブ内に入ったのがで一方の鎖又は他方のみであった場合にも、この手法でシグナルが確実に拾われる)。
単一カートリッジにおけるDNAメチル化及び突然変異の検出。
ある特定の実施形態では、マルチプレックスPCR反応は、同じカートリッジ内のメチル化に加えて、突然変異の検出を可能にするプライマー及びプローブを含むことができる。図27Aは、KRAS G12D突然変異と共にしたメチル化BNC1及びADAMTS1の検出を対照BG(上パネル)と共に図示し、並びに、KRAS野生型と共にしたメチル化BNC1及びADAMTS1の検出を対照BG(下パネル)と共に図示する。
膵臓癌のマルチプレックス化最適化。
ADAMTS1、BNC1(及び他の特定の遺伝子)のメチル化分析は、膵臓癌の検出及び/又は病期分類を可能にすることが判明した。したがって、BNC1及びADAMTS1の初期のマルチプレックスアッセイは、他の遺伝子に対するプローブの取り込みを容易にさせるように最適化された。このアッセイを最適化するために、フォワード/リバースの亜硫酸水素塩変換された鎖の外部及び内部PCRにおいて温度勾配を行った。単一プレックス(Single-plexes;各々の遺伝子のフォワード/リバース(fwd/rev))は、56℃、58℃及び60℃の外的温度並びに64℃、66℃及び68℃の内的温度で行った(例えば、図28参照)。ある特定の実施形態では、BNC1及びADAMTS1並びに2つの他の遺伝子の2つの4プレックス、フォワード鎖のメチル化分析のための1つの4プレックス並びにリバース鎖のメチル化分析のための1つの4プレックスとして、アッセイを開発した。
MGMTメチル化の検出
O(6)-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)遺伝子は、テモゾラミド(temozolamide)のようなアルキル化化学療法の効果を無効にすることができる、DNA修復酵素をコードする。MGMT遺伝子が活性である場合、損傷は急速に修復される。悪性神経膠腫は、そのプロモーター領域のメチル化により不活性化されたMGMT遺伝子を有しうると考えられている。メチル化MGMT遺伝子は、(腫瘍がアルキル化剤によって誘導されたDNA損傷を修復する手段を持たないため)化学療法に対するより良い応答の予測指標である。
BRCA1メチル化の検出
BRCA1は、DNAの修復に関与する番人遺伝子(caretaker gene)である。BRCA1は、相同、組換え、非相同末端接合、及びヌクレオチド切除修復に関ると考えられている。異常なBRCA1遺伝子を有する女性は、80%の乳癌を発症する可能性がある。
肺癌に関連する遺伝子メチル化の検出。
メチル化が肺癌に関連する遺伝子(SOX17、CD01、TAC1)についての3つの標的メチル化アッセイを、ACTB対照遺伝子と共に試験した。図34に示すデータは、予想通り、3つの標的が正常血漿のバックグラウンドに現れず、3つの異なる肺癌細胞株にある程度存在することを示している。
200 カートリッジ
202 カートリッジ本体
204 ガスケット
206 中央シリンジバレル
208 試薬及び/又は緩衝液チャンバー
210 弁本体
212 キャップ
214 キャビティ
216 温度制御されたチャネル又はチャンバー
226 カートリッジベース
300 反応モジュール
302 電子回路
304 ファン
306 光学ブロック
308 加熱プレート
310 ピペット
312 電気コネクタ
Claims (19)
- 第1のマトリックス材料を含むカラム、試料受けチャンバー、温度制御チャネル又はチャンバー、試薬及び/又は緩衝液を含有する複数のチャンバーを含み、使用中は前記チャンバーのうちの少なくとも1つが亜硫酸水素塩試薬を含有しており、前記チャンバーのうちの少なくとも1つが脱スルホン化/溶出緩衝液を含有しており、第2のマトリックス材料を含む第2のカラムを含む又は含まない、核酸のメチル化状態を決定するためのカートリッジであって、前記試料受けチャンバー、前記カラム、前記複数のチャンバー、及び前記温度制御チャネル又はチャンバーが、選択的に流体連結しており、
前記試料受けチャンバー、前記カラム、前記複数のチャンバー、及び前記温度制御チャネル若しくはチャンバー又は前記温度制御チャネル若しくはチャンバー内へのポートが、中央弁の周りに配置されており、前記中央弁内のチャネルと選択的に流体連結しており、前記中央弁が、前記中央弁と流体連結しているチャンバーから流体を出し入れすることができるプランジャーを収容するように構成されている、カートリッジ。 - 使用中は、グアニジニウムチオシアネートエタノール(GTC-EtOH)を含む試薬を含有するチャンバーを含む、請求項1に記載のカートリッジ。
- 前記第2のカラムが存在しない、請求項1又は2に記載のカートリッジ。
- 前記温度制御チャネル又はチャンバーが熱サイクルチャネル又はチャンバーである、請求項1から3のいずれか一項に記載のカートリッジ。
- 前記亜硫酸水素塩試薬が、亜硫酸水素アンモニウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のカートリッジ。
- 前記カートリッジが、メチル化特異的PCRプライマー、メチル化特異的PCRプローブ、PCR酵素、及びPCR反応緩衝液からなる群から選択される1つ又は複数の試薬を含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のカートリッジ。
- メチル化特異的PCRプライマー、メチル化特異的PCRプローブ、PCR酵素、及びPCR反応緩衝液からなる群から選択される1つ又は複数の試薬を含有する少なくとも2つのチャンバーを含有する、請求項6に記載のカートリッジ。
- 変換されたDNAのフォワード鎖のメチル化を検出するためのプライマー及びプローブを含有する少なくとも1つのチャンバーを含有する、並びに/又は
変換されたDNAのリバース鎖のメチル化を検出するためのプライマー及びプローブを含有する少なくとも1つのチャンバーを含有する、
請求項1から7のいずれか一項に記載のカートリッジ。 - 前記PCRプライマー、及び/又はプローブ、及び/又は酵素をビーズとして提供する、請求項6から8のいずれか一項に記載のカートリッジ。
- 使用中は、前記カートリッジが、
試料を含有する第1のチャンバーと、
グアニジニウムチオスルフェート-エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する第2のチャンバーと、
亜硫酸水素塩試薬を含有する第3のチャンバーと、
緩衝液を含有する第4のチャンバーと、
すすぎ溶液を含有する第5のチャンバーと、
溶出/脱スルホン化試薬を含有する第6のチャンバーと
を含むように構成されている、請求項1から9のいずれか一項に記載のカートリッジ。 - 前記第1のチャンバーがGTC-EtOH-Tween(登録商標)抽出/沈殿試薬中の前記試料を含有する、請求項10に記載のカートリッジ。
- 試料をカートリッジ内に入れる時点若しくはその間近に亜硫酸水素塩試薬をカートリッジに加えるように構成されている、及び/又は
試料をカートリッジ内に入れる時点若しくはその間近にGTC-ETOH-Tween(登録商標)緩衝液を加えるように構成されている、
請求項1から11のいずれか一項に記載のカートリッジ。 - 亜硫酸水素塩試薬をカートリッジの成分として提供する、及び/又は
GTC-ETOH-Tween(登録商標)緩衝液をカートリッジの成分として提供する、
請求項1から11のいずれか一項に記載のカートリッジ。 - 前記カートリッジが、PCRプライマー及び/又はプローブ及び/又はPCR酵素を含有する第7のチャンバーを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載のカートリッジ。
- 亜硫酸水素塩変換された、メチル化された、及び/又はメチル化されていない配列に特異的なプライマーを含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、並びに/或いは
TaqMan PCR反応の試薬を含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、並びに/或いは
増幅されたメチル化された配列のマーカーである1つ若しくは複数の蛍光プローブ及び/又は増幅されたメチル化されていない配列のマーカーである1つ若しくは複数の蛍光プローブを含有する、1つ又は複数のチャンバーを含む、
請求項1から14のいずれか一項に記載のカートリッジ。 - 前記プローブが蛍光レポーター色素及び消光色素を含み、プローブが、Taq DNAポリメラーゼの5'から3'のヌクレアーゼ活性による切断の際にシグナルをもたらす、請求項15に記載のカートリッジ。
- 増幅された目的領域中の異なるメチル化された領域にそれぞれ特異的な複数のプローブを含む、又は
増幅された目的領域中の同じメチル化された領域にそれぞれ特異的な複数のプローブを含む、又は
増幅された目的領域中のメチル化された領域に特異的な単一のプローブを含む、
請求項15又は16に記載のカートリッジ。 - MGMT、RASSF1A、ADAMTS1、BNC1、HIST1H3C、HOXB4、RASGRF2、TM6SF1、及びAKR1B1からなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域のメチル化を決定するためのプライマー及び/又はプローブを含有する、並びに/或いは
表5(Table 5)、9(Table 9)、若しくは10(Table 10)に示す1つ若しくは複数のプライマー、及び/又は表5(Table 5)、9(Table 9)、若しくは10(Table 10)に示す1つ若しくは複数のプローブを含有する、
請求項1から17のいずれか一項に記載のカートリッジ。 - メチルトランスフェラーゼについてのRNAの発現レベルを決定するために構成されている、請求項1から18のいずれか一項に記載のカートリッジ。
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