JP6570795B2 - メチル化dna分離及び/又は検出用クロマトグラフィー用充填剤 - Google Patents
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Description
〔1〕表面にカチオン性官能基を有する疎水性架橋共重合体粒子からなる基材粒子を含有し、該疎水性架橋共重合体がジビニル芳香族単量体を含む、メチル化DNA分離及び/又は検出用イオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
〔2〕前記ジビニル芳香族単量体がジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、ジビニルアントラセン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、及びジビニルビフェニルからなる群より選択される、〔1〕記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
〔3〕前記疎水性架橋共重合体が、全質量中に前記ジビニル芳香族単量体を3〜15質量%含有する、〔1〕又は〔2〕記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
〔4〕前記疎水性架橋共重合体が、前記ジビニル芳香族単量体と、ビニル基を2個以上有する非芳香族疎水性架橋性単量体と、反応性官能基を有する単量体とを含む、〔1〕〜〔3〕のいずれか1項記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
〔5〕前記反応性官能基がグリシジル基又はイソシアネート基である、〔4〕記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
〔6〕前記ビニル基を2個以上有する非芳香族疎水性架橋性単量体が、ジエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールメタントリメタクリレート、テトラメチロールメタントリメタクリレート、ジエチレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、テトラエチレングリコールジアクリレート、トリメチロールメタントリアクリレート、及びテトラメチロールメタントリアクリレートからなる群より選択される少なくとも1種である、〔4〕又は〔5〕記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
〔7〕前記疎水性架橋共重合体が、全質量中に、前記ジビニル芳香族単量体を3〜15質量%、前記非芳香族疎水性架橋性単量体を40〜70質量%、及び前記反応性官能基を有する単量体を10〜50質量%含有する、〔1〕〜〔6〕のいずれか1項記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
〔8〕前記疎水性架橋共重合体が、さらに疎水性非架橋性単量体を全質量中に0〜5質量%含む、〔1〕〜〔7〕のいずれか1項記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
〔9〕前記カチオン性官能基が強カチオン性基及び弱カチオン性基である、〔1〕〜〔8〕のいずれか1項記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
〔10〕前記強カチオン性基が4級アンモニウム基であり、前記弱カチオン性基が3級アミノ基である、〔9〕記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
〔11〕前記基材粒子が表面に前記強カチオン性基と前記弱カチオン性基とを有する重合体層を有する、〔9〕又は〔10〕記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
〔12〕〔1〕〜〔11〕のいずれか1項記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を含む、メチル化DNA分離及び/又は検出用イオン交換クロマトグラフィー用カラム。
〔13〕〔1〕〜〔11〕のいずれか1項記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いるメチル化DNAの分離及び/又は検出方法。
実施例1、及び比較例1〜2の基材粒子を調製した。基材粒子の組成を表1に示す。該基材粒子をイオン交換クロマトグラフィー用充填剤として用いてHPLC分析を行った。
(1−1)疎水性架橋重合体粒子の調製
実施例1について、疎水性架橋重合体粒子の調製手順の詳細を以下に記載する。攪拌機付き反応器中の5重量%ポリビニルアルコール(日本合成化学社製)水溶液1000mLに、ジビニルベンゼン(和光純薬工業社製)20g、トリエチレングリコールジメタアクリレート(新中村化学工業社製)80g、トリメチロールメタントリアクリレート(新中村化学工業社製)30g、グリシジルメタクリレート(和光純薬工業社製)50g及び過酸化ベンゾイル(キシダ化学社製)0.8gを添加した。得られた混合物を攪拌しながら、窒素雰囲気下にて80℃で1時間加熱し、重合体を生成した。なお、比較例1及び2については、単量体の組成を表1のとおり変更した以外は、同様の手順で疎水性架橋性重合体粒子を調製した。
強カチオン性基を有する親水性単量体として、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド(和光純薬工業社製)100gをイオン交換水に溶解した。これを(1)の疎水性架橋性重合体粒子が入った反応器に添加して、攪拌しながら窒素雰囲気下にて80℃で2時間加熱し、該疎水性架橋性重合体粒子と強カチオン性基を有する単量体を重合させた。得られた生成物を水及びアセトンで洗浄することにより、4級アンモニウム基を有する親水性重合体の層を表面に有する被覆重合体粒子を得た。重合反応に用いた強カチオン性基を有する親水性単量体の量、及び反応条件は、表1のとおりとした。
得られた被覆重合体粒子10gをイオン交換水100mLに分散させ、反応前スラリーを準備した。次いで、このスラリーを撹拌しながら、弱カチオン性基を有する試薬であるN,N−ジエチルアミノプロピルアミン(和光純薬工業社製)を10mL加え、70℃で4時間反応させた。反応終了後、遠心分離機(日立製作所社製、「Himac CR20G」)を用いて上澄みを除去し、イオン交換水で洗浄した。洗浄後、遠心分離機を用いて上澄みを除去した。このイオン交換水による洗浄を更に4回繰り返し、(2)の被覆重合体粒子の表面に弱カチオン性基を導入した。反応に用いた弱カチオン性基の量、及び反応条件は、表1のとおりとした。以上の手順で、表面に4級アンモニウム基と3級アミノ基とを有する疎水性架橋性重合体粒子からなる、基材粒子を得た。
得られた基材粒子の体積平均粒子径を、粒度分布測定装置(AccuSizer780/Particle Sizing Systems社製)を用いて測定した。
(2−1)サンプルDNAの調製
FAM150A遺伝子のDNA配列(384bp、39個のCpGサイトを有する)を基に構築された合成DNAをサンプルDNAとした。
サンプル1:メチル化DNA:39個のCpGサイトの塩基は全てCG
サンプル2:非メチル化DNA:39個のCpGサイトの塩基は全てTG
サンプル1、2は、それぞれ、FAM150A遺伝子のメチル化DNA(メチル化率100%)及び非メチル化DNA(メチル化率0%)の亜硫酸水素塩処理物に相当する。これらサンプル1、2のDNA(15ng/100μL)をPCR増幅した反応液を、HPLC分析用の試料として用いた。
(1)で得られた基材粒子をイオン交換クロマトグラフィー用充填剤として用いて、HPLC分析を行った。実施例1及び比較例1〜2の基材粒子をそれぞれ液体クロマトグラフィーシステムのステンレス製カラム(内径4.6mm×長さ20mm)に充填した。得られたアニオン交換カラムを用いて、以下の条件でイオン交換クロマトグラフィーを行った。
システム:LC−20Aシリーズ(島津製作所社製)
溶離液:溶離液A 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH7.5)
溶離液B 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH7.5)
+2mol/L硫酸アンモニウム
分析時間:15分
溶出法:以下のグラジエント条件により溶離液Bの混合比率を直線的に増加させた。
0分(溶離液B40%)→10分(溶離液B100%)
流速:1.0mL/min
検体:(1)に記載したサンプル1、2のPCR増幅産物
検体注入量:5μL
カラム温度:70℃
検出波長:260nm
実施例1及び比較例1〜2の基材粒子を用いたHPLCで得られたサンプルDNAのクロマトグラムを図1に示す。実施例1の充填剤を用いたHPLCのクロマトグラムでは、比較例1〜2と比べて、メチル化DNA(サンプル1)と非メチル化DNA(サンプル2)のピークが明瞭であり、かつ両者の保持時間の差が増大した。下記式に従ってメチル化DNAと非メチル化DNAのピークの分離度を計算した。表2に示すとおり、実施例1の基材粒子を用いた場合、分離度が顕著に向上した。このことから、実施例1の基材粒子は、メチル化DNAと非メチル化DNAの分離性能が高いことが示された。
分離度= 1.18×(非メチル化DNAの保持時間−メチル化DNAの保持時間)÷(非メチル化DNAの半値幅+メチル化DNAの半値幅)
実験1(1)と同様の手順で、表3に示すとおり単量体(A)の含有量の異なる基材粒子1〜3を製造した(体積平均粒子径10μm)。得られた基材粒子をイオン交換クロマトグラフィー用充填剤として用いて、実験1(2)と同様の手順でHPLC分析を行い、メチル化DNAと非メチル化DNAのピークの分離度を計算した。結果を表3に示す。
Claims (14)
- 表面にカチオン性官能基を有する疎水性架橋共重合体粒子からなる基材粒子を含有し、該疎水性架橋共重合体がジビニル芳香族単量体と、ビニル基を2個以上有する非芳香族疎水性架橋性単量体と、反応性官能基を有する単量体とを含む、メチル化DNA分離及び/又は検出用イオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
- 前記ジビニル芳香族単量体がジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、ジビニルアントラセン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、及びジビニルビフェニルからなる群より選択される、請求項1記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
- 前記反応性官能基がグリシジル基又はイソシアネート基である、請求項1又は2記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
- 前記ビニル基を2個以上有する非芳香族疎水性架橋性単量体が、ジエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールメタントリメタクリレート、テトラメチロールメタントリメタクリレート、ジエチレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、テトラエチレングリコールジアクリレート、トリメチロールメタントリアクリレート、及びテトラメチロールメタントリアクリレートからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1〜3のいずれか1項記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
- 前記疎水性架橋共重合体が、全質量中に、前記ジビニル芳香族単量体を3〜15質量%、前記非芳香族疎水性架橋性単量体を40〜70質量%、及び前記反応性官能基を有する単量体を10〜50質量%含有する、請求項1〜4のいずれか1項記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
- 前記疎水性架橋共重合体が、さらに疎水性非架橋性単量体を全質量中に0〜5質量%含む、請求項1〜5のいずれか1項記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
- 前記疎水性架橋共重合体における、(A)前記ジビニル芳香族単量体と、(B)前記非芳香族疎水性架橋性単量体と、(C)前記反応性官能基を有する単量体と、(D)前記疎水性非架橋性単量体との比率が、質量比で(A):(B):(C):(D)=5〜12:55〜65:20〜35:0〜5(ただし(A)+(B)+(C)+(D)=100)である、請求項6記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
- 前記ジビニル芳香族単量体がジビニルベンゼンである、請求項1〜7のいずれか1項記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
- 前記ジビニル芳香族単量体がジビニルベンゼンであり、前記非芳香族疎水性架橋性単量体がトリエチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールメタントリアクリレート及びペンタエリスリトールトリアクリレートから選択される少なくとも1種であり、前記反応性官能基を有する単量体がグリシジルメタクリレート又はイソシアネートエチルメタクリレートであり、前記疎水性非架橋性単量体が含有なしか又はスチレンである、請求項8記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
- 前記カチオン性官能基が強カチオン性基及び弱カチオン性基である、請求項1〜9のいずれか1項記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
- 前記強カチオン性基が4級アンモニウム基であり、前記弱カチオン性基が3級アミノ基である、請求項10記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
- 前記基材粒子が表面に前記強カチオン性基と前記弱カチオン性基とを有する重合体層を有する、請求項10又は11記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。
- 請求項1〜12のいずれか1項記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を含む、メチル化DNA分離及び/又は検出用イオン交換クロマトグラフィー用カラム。
- 請求項1〜12のいずれか1項記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いるメチル化DNAの分離及び/又は検出方法。
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