JP6790834B2 - 分離材 - Google Patents
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Description
しかも特許文献1では、硬質な合成高分子物質でゲルが包囲されるため、カラムベッドの形態で使用しても、容積変化がなく、カラムを通過するフロースルーの圧力が変化しないという効果が記載されている。
[1] モノマ単位としてスチレン系モノマを含む多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層と、を備え、破壊強度が10mN以上である分離材。
[2] 空隙率が40〜70%である[1]記載の分離材。
[3] 吸湿度が1〜30質量%である[1]又は[2]記載の分離材。
[4] 比表面積が30m2/g以上である、[1]〜[3]のいずれかに記載の分離材。
[5] 多孔質ポリマ粒子が、モノマ単位として、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で50質量%以上含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の分離材。
[6] 多孔質ポリマ粒子における粒径の変動係数が3〜15%である、[1]〜[5]のいずれかに記載の分離材。
[7] 水酸基を有する高分子が多糖類又はその変性体である、[1]〜[6]のいずれかに記載の分離材。
[8] 水酸基を有する高分子がアガロース又はその変性体である、[1]〜[6]のいずれかに記載の分離材。
[9] 水酸基を有する高分子が架橋されている、[1]〜[8]のいずれかに記載の分離材。
[10] 多孔質ポリマ粒子1g当たり30〜400mgの被覆層を備える、[1]〜[9]のいずれかに記載の分離材。
[11] カラムに充填した場合、カラム圧0.3MPaのときに通液速度が800cm/h以上である、[1]〜[10]のいずれかに記載の分離材。
[12] カラムと、該カラムに充填された[1]〜[11]のいずれかに記載の分離材とを備える、分離用カラム。
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える。なお、本明細書中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、多孔質化剤を含むモノマを硬化させた粒子であり、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、スチレン系モノマを使用することができる。具体的なモノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。
1)粒子を、超音波分散装置を使用して水(界面活性剤等の分散剤を含む)に分散させ、1質量%の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
2)粒度分布計(シスメックスフロー、シスメックス株式会社製)を用いて、上記分散液中の粒子約1万個の画像により平均粒径及び粒径のC.V.(変動係数)を測定する。
本実施形態の被覆層は、水酸基を有する高分子を含む。水酸基を有する高分子で多孔質ポリマ粒子を被覆することによりカラム圧の上昇を抑制することができるとともに、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量が良好となる傾向にある。さらに、水酸基を有する高分子が架橋されていると、カラム圧の上昇をより抑制することが可能となる。
水酸基を有する高分子は、1分子中に2個以上の水酸基を有することが好ましく、親水性高分子であることがより好ましい。水酸基を有する高分子としては、例えば、多糖類、ポリビニルアルコール等が挙げられる。多糖類としては、好ましくはアガロース、デキストラン、セルロース、キトサン等が挙げられる。水酸基を有する高分子としては、例えば重量平均分子量1万〜20万程度のものが使用できる。
水酸基を有する高分子を含む被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。
まず、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させる。水酸基を有する高分子の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、5〜20(mg/mL)が好ましい。
この溶液を、多孔質ポリマ粒子に含浸させる。含浸方法は、水酸基を有する高分子の溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する。含浸時間は多孔質体の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質体の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の水酸基を有する高分子を除去する。
次いで、架橋剤を加えて多孔質ポリマ粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成する。このとき、架橋体は、水酸基を有する3次元架橋網目構造を有する。
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド(プロテインA)等を表面上の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
(吸湿後分離材質量−1)g/1g×100=吸湿度(%)
微小圧縮試験機(Fisher社製)を用いて、室温条件にて荷重負荷速度1mN/秒で、四角柱の平滑な端面(50μm×50μm)により粒子を50mNまで圧縮したときの荷重及び圧縮変位を測定する。上記測定中の変位量が最も大きく変化する点の荷重を破壊強度(mN)とする。
<多孔質ポリマ粒子1の合成>
500mLの三口フラスコに、純度96%のジビニルベンゼン(DVB960、新日鉄住金化学株式会社)を16g、スパン80を6g、及び過酸化ベンゾイルを0.64g加え、ポリビニルアルコール(0.5質量%)水溶液を調製した。この水溶液をマイクロプロセスサーバーを使用して乳化後、得られた乳化液をフラスコに移し、80℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約8時間撹拌をした。得られた粒子をろ過後、アセトン洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子1を得た。得られた粒子の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径及び粒径のC.V.値を算出した。その結果を表1に示す。
アガロース水溶液(2質量%)100mLに水酸化ナトリウム4g、及びグリシジルフェニルエーテル0.4gを加え、70℃で12時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで3回再沈殿させ、洗浄した。
20mg/mLの変性アガロース水溶液700mLに多孔質ポリマ粒子1を10gの割合で投入し、55℃で24時間攪拌させ、多孔質ポリマ粒子1に変性アガロースを吸着させた。吸着後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。変性アガロースの吸着量(被覆量)は、乾燥させた粒子の熱重量減少を測定することにより算出した。その結果を表2に示す。
粒子に吸着したアガロースは次のようにして架橋した。10gの粒子を分散させた0.4M水酸化ナトリウム水溶液にエチレングリコールジグリシジルエーテルを39g添加し、24時間30℃にて攪拌した。その後、2質量%の熱したドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で洗浄し、分離材を得た。分離材は水中で保管した。
得られた分離材をBSA(Bovine Serum Albumin)濃度20mg/mLのリン酸緩衝液(pH7.4)50mLに0.5g投入し、24時間室温で攪拌を行った。その後、遠心分離で上澄みをとった後、分光光度計でろ液のBSA濃度を測定した。分離材に吸着したBSA量を非特異吸着量として算出した。BSAの濃度は分光光度計により280nmの吸光度から確認した。その結果を表3に示す。
得られた分離材分散液から、遠心分離により水を除去した後、分離材20gを、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩を所定量溶解させた水溶液100mLに分散させ、70℃で10分攪拌した。その後、70℃に加温した5MNaOH水溶液100mLを添加し、1時間反応させた。反応終了後、ろ過、水/エタノール(体積比8/2)で2回洗浄し、ジエチルアミノエチル(DEAE)基をイオン交換基として有するDEAE変性分離材を得た。得られたDEAE変性分離材の細孔径分布におけるモード径、比表面積、ポロシティ(空隙率)を水銀圧入法にて測定した。また、微小圧縮試験により破壊強度を測定した。その結果を表2に示す。
得られたDEAE変性分離材をφ7.8×300mmのステンレスカラムに濃度30質量%のスラリー(溶媒:メタノール)として15分かけて充填した。その後、カラムに流速を変えながら水を流し、流速とカラム圧の関係を測定し、0.3MPa時の通液速度(線流速)を測定した。その結果を表2に示す。
動的吸着量は以下のようにして測定した。20mmol/L Tris−塩酸緩衝液(pH8.0)をカラムに10カラム容量流した。その後BSA濃度2mg/mLの20mmol/LのTris−塩酸緩衝液を流し、UVによりカラム出口でのBSA濃度を測定した。カラム入口と出口のBSA濃度が一致するまで緩衝液を流し、5カラム容量分の1M NaCl Tris−塩酸緩衝液で希釈した。10%breakthroughにおける動的結合容量(動的吸着量)は以下の式を用いて算出した。
q10=cfF(t10−t0)/VB
q10:10%breakthroughにおける動的結合容量(mg/mL wet resin)
cf:注入しているBSA濃度(mg/mL)
F:流速(mL/min)
VB:ベッド体積(mL)
t10:10%breakthroughにおける時間(min)
t0:BSA注入開始時間(min)
得られたDEAE変性分離材を0.5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で24時間撹拌し、リン酸緩衝液で洗浄後、カラム特性評価と同様の条件にて充填した。BSAの10%breakthrough動的吸着量を測定し、アルカリ処理前の動的吸着量と比較した。動的吸着量の減少率が3%以下であるものを「A」、3%超20%以下であるものを「B」、20%超であるものを「C」とした。結果を表3に示す。
800cm/hの流速で水をカラムに流し、カラム圧を測定後、3000cm/hに流速を上昇させ、1時間通液させた。再度800cm/hにカラム圧を下げた際に、カラム圧が初期値(3000cm/hに流速を上げる前)より10%以上上昇した場合を「B」、10%未満である場合を「A」とした。
スパン80の使用量を8gに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子2を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子2を、多孔質ポリマ粒子1と同様の方法で処理することによって、分離材及びDEAE変性分離材を得た。分離材及びDEAE変性分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
スパン80の使用量を9gに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子3を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子3を、多孔質ポリマ粒子1と同様の方法で処理することによって、分離材及びDEAE変性分離材を得た。分離材及びDEAE変性分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
ジビニルベンゼン(16g)を、ジビニルベンゼン(14g)及びオクタノール(2g)に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子4を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子4を、多孔質ポリマ粒子1と同様の方法で処理することによって、分離材及びDEAE変性分離材を得た。分離材及びDEAE変性分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
ジビニルベンゼン(16g)及びスパン80(6g)を、ジビニルベンゼン(14g)、オクタノール(5g)及びスパン80(3g)に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子5を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子5を、多孔質ポリマ粒子1と同様の方法で処理することによって、分離材及びDEAE変性分離材を得た。分離材及びDEAE変性分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
ジビニルベンゼン(16g)を、ジビニルベンゼン(4g)及びジヒドロキシプロピルメタクリレート(8g)に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子6を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子6を、被覆層を形成せずにDEAE変性することによって、分離材を得た。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
市販のアガロース粒子(Capto DEAE:GEヘルスケア)をそのまま分離材(多孔質ポリマ粒子7)として用いた。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
ジビニルベンゼン(16g)及びスパン80(6g)を、2,3−ジヒドロキシプロピルメタクリレート(11.2g)、エチレングリコールジメタクリレート(4.8g)及びスパン80(5g)に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子8を合成した。洗浄後の多孔質ポリマ粒子8(4g)を、デキストラン(分子量15万)1g、水酸化ナトリウム0.6g及び水素化ホウ素ナトリウム0.15gを蒸留水に溶解させた溶液6gに加えて、多孔質ポリマ粒子8の細孔内に含浸させた。得られたデキストラン溶液含浸重合体を、1質量%エチルセルローストルエン溶液1Lに加えて撹拌し、分散、懸濁せしめた。得られた懸濁液中に、エピクロルヒドリン5mLを加えて50℃に昇温し、この温度で6時間撹拌して、多孔質ポリマ粒子8の細孔内に含浸されているデキストランを架橋反応させた。反応終了後、懸濁液をろ過して生成ゲル状物を分離し、トルエン、エタノール、蒸留水で順次洗浄することによって、分離材を得た。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
Claims (10)
- モノマ単位としてスチレン系モノマを含む多孔質ポリマ粒子と、
該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層と、を備え、
前記多孔質ポリマ粒子が、モノマ単位としてジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で50質量%以上含み、
前記多孔質ポリマ粒子1g当たり164〜400mgの前記被覆層を備え、破壊強度が10mN以上である分離材。 - 空隙率が40〜70%である、請求項1記載の分離材。
- 吸湿度が1〜30質量%である、請求項1又は2記載の分離材。
- 比表面積が30m2/g以上である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子における粒径の変動係数が3〜15%である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記水酸基を有する高分子が多糖類又はその変性体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記水酸基を有する高分子がアガロース又はその変性体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記水酸基を有する高分子が架橋されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離材。
- カラムに充填した場合、カラム圧0.3MPaのときに通液速度が800cm/h以上である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の分離材。
- カラムと、該カラムに充填された請求項1〜9のいずれか一項に記載の分離材とを備える、分離用カラム。
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