JP6778382B2 - 分離材 - Google Patents

Description

本発明は、分離材に関する。

従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には、多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体等が用いられている。多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体は、塩濃度による体積変化が小さいため、カラムに充填してクロマトグラフィーで用いると、通液時の耐圧性に優れる傾向にある。しかし、このイオン交換体をタンパク質等の分離に用いると、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起こるため、ピークの非対称化が発生する、又は該疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できないという問題点がある。

一方、デキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤し、また、溶液のイオン強度による体積変化、及び遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も充分ではないといった欠点を有する。特に架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。

親水性天然高分子の架橋ゲルの欠点を克服するため、いわば、“骨格”となる剛直な物質と組み合せる試みがこれまでになされている。例えば、多孔性高分子の細孔内に天然高分子ゲル等のゲルを保持した複合体が、ペプチド合成の分野で知られている（例えば、特許文献１参照）。このような複合体を用いることにより、反応性物質の負荷係数を高め、高収率の合成が可能となる。また、硬質な合成高分子物質でゲルが包囲されるため、カラムベッドの形態で使用しても、容積変化がなく、カラムを通過するフロースルーの圧力が変化しないという利点がある。

セライト等の無機多孔質体にデキストラン、セルロースといった多糖等のキセロゲルを保持させた分離材が知られている（例えば、特許文献２、特許文献３参照）。このゲルには吸着性能を付加するために、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基等が付与されており、ヘモグロビンの除去に用いられる。このような分離材は、カラムでの通液性が良好である。

マクロネットワーク構造のコポリマの細孔を、モノマから合成した架橋共重合体ゲルで埋めたハイブリッドコポリマのイオン交換体が知られている（例えば、特許文献４参照）。架橋共重合体ゲルは、架橋度が低い場合、圧力損失、体積変化等に問題があるが、ハイブリッドコポリマにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なくなり、また、イオン交換容量が向上し、リーク挙動が改善される。

有機合成ポリマ基体の細孔内に巨大網目構造を有する親水性天然高分子の架橋ゲルを充填した複合化充填材が提案されている（例えば、特許文献５、特許文献６参照）。

メタクリル酸グリシジルとアクリル架橋モノマとの共重合により形成される多孔質粒子の合成が知られている（例えば、特許文献７参照）。

米国特許第４９６５２８９号明細書 米国特許第４３３５０１７号明細書 米国特許第４３３６１６１号明細書 米国特許第３９６６４８９号明細書 特開平１−２５４２４７号公報 米国特許第５１１４５７７号明細書 特開２００９−２４４０６７号公報

しかしながら、従来の分離材は、タンパク質吸着量に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れるという特性を充分なレベルで兼ね備えるものではない。

本発明は、このような実情に鑑み、タンパク質吸着量に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れる分離材を提供することを目的とする。

本発明は、下記［１］〜［１８］に記載の分離材又は分離用カラムを提供する。
［１］ モノマ単位としてスチレン系モノマを含む多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層と、を備える分離材であって、上記分離材は、５％圧縮変形弾性率が１００〜１０００ＭＰａであり、かつ細孔径分布におけるモードが０．１〜０．５μｍである分離材。
［２］ 吸湿度が１〜３０質量％である、［１］に記載の分離材。
［３］ 多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える分離材であって、上記被覆層が、水酸基を有する高分子を含み、湿潤状態において上記分離材を５０ｍＮで圧縮した際の圧縮変形率が粒径の３０％未満であり、上記分離材を５０ｍＮで圧縮した際における乾燥状態の圧縮回復率に対する湿潤状態の圧縮回復率の比が０．８以上である、分離材。
［４］ 多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える分離材であって、上記被覆層が、水酸基を有する高分子を含み、湿潤状態における上記分離材の５％圧縮変形弾性率が１００ＭＰａ以上であり、上記分離材の湿潤状態の５％圧縮変形弾性率に対する乾燥状態の５％圧縮変形弾性率の比が１．８５以上である、分離材。
［５］ 細孔径分布におけるモード径が０．０５〜０．５μｍである、［３］又は［４］に記載の分離材。
［６］ 上記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜５００μｍである、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離材。
［７］ 上記多孔質ポリマ粒子における粒径の変動係数が３〜１５％である、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］ 分離材の平均粒径が１０〜５００μｍである、［１］〜［７］のいずれかに記載の分離材。
［９］ 分離材の細孔容積が３０体積％以上である、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］ 多孔質ポリマ粒子の比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上である、［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材。
［１１］ 分離材の比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の分離材。
［１２］ 上記多孔質ポリマ粒子が、モノマ単位として、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含む、［１］〜［１１］のいずれかに記載の分離材。
［１３］ 上記水酸基を有する高分子が多糖類又はその変性体である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の分離材。
［１４］ 上記水酸基を有する高分子がアガロース又はその変性体である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の分離材。
［１５］ 上記水酸基を有する高分子が架橋されている、［１］〜［１４］のいずれかに記載の分離材。
［１６］ 上記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜５００ｍｇの上記被覆層を備える、［１］〜［１５］のいずれかに記載の分離材。
［１７］ カラムに充填した場合、カラム圧が０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、［１］〜［１６］のいずれかに記載の分離材。
［１８］ カラムと、該カラムに充填された［１］〜［１８］のいずれかに記載の分離材とを備える、分離用カラム。

本発明によれば、タンパク質吸着量に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れる分離材を提供することが可能となる。

分離用カラムの一実施形態を示す断面図である。

以下、本発明の好適な実施形態について説明をするが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。

［第１実施形態］
＜分離材＞
以下に、第１実施形態に係る分離材について説明する。本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える。本実施形態によれば、タンパク質の非特異吸着を低減し、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れる分離材、及びこれを用いた分離用カラムを提供することができる。なお、本実施形態において、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。

（多孔質ポリマ粒子）
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、多孔質化剤を含むモノマを硬化させた粒子であり、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、スチレン系モノマを使用することができる。具体的なモノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。

多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物が挙げられる。これらの多官能性モノマは、１種単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも耐久性、耐酸性及び耐アルカリ性に優れることから、ジビニルベンゼンを使用することが好ましい。

上記多孔質ポリマ粒子は、モノマ単位として、ジビニルベンゼンを含む場合、ジビニルベンゼンを、モノマ全質量基準で５０質量％以上含むことが好ましく、６０質量％以上含むことがより好ましく、７０質量％以上含むことがさらに好ましい。ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含むことにより、耐アルカリ性及び耐圧性に優れる傾向にある。

単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体が挙げられる。これらの単官能性モノマは、１種単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。これらのうち、耐酸性及び耐アルカリ性に優れるという観点から、スチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシ基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。

多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。具体的には、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これら多孔質化剤は、１種単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。

上記多孔質化剤は、モノマ全質量に対して０〜２００質量％使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空隙率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。

溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、水を吸収することによって、多孔質化することが可能となる。

多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル、例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート、又は、ヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及びこれらの混合物が挙げられる。

これらのうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）；ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）８０、好ましくは純度約４０％、より好ましくは純度約５０％、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）；ジグリセロールモノオレエート（例えば、純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）；ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）；ジグリセロールモノミリステート（好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）；ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル；及びこれらの混合物が好ましい。

これらの油溶性界面活性剤は、モノマ全質量に対して、５〜８０質量％の範囲で用いることが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成しにくくなる。また、油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持しやすくなる。

重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。

アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩などが挙げられる。

カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩が挙げられる。

ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。

両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。

界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマ重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。

必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。

重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。

多孔質ポリマ粒子の合成において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を用いてもよい。

高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。

モノマが単独で重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。

多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは３００μｍ以下、さらに好ましくは１５０μｍ以下、よりさらに好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、通液性の向上の観点から、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上、さらに好ましくは５０μｍ以上である。

多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性の向上の観点から、３〜１５％であることが好ましく、５〜１５％であることがより好ましく、５〜１０％であることがさらに好ましい。Ｃ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（株式会社日立製作所製）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。

多孔質ポリマ粒子又は分離材の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）は、以下の測定法により求めることができる。
１）超音波分散装置を使用して粒子を水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）を測定する。

多孔質ポリマ粒子の細孔容積（空隙率）は、多孔質ポリマ粒子の全体積（細孔容積を含む）基準で３０体積％以上７０体積％以下であることが好ましく、４０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。多孔質ポリマ粒子は、細孔径が０．１μｍ以上０．５μｍ未満である細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。多孔質ポリマ粒子の細孔径分布におけるモード径（細孔径分布の最頻値、最大頻度細孔径、平均細孔径）として、好ましくは０．１μｍ以上０．５μｍ未満であり、より好ましくは０．２μｍ以上０．５μｍ未満である。細孔径分布におけるモード径が０．１μｍ以上であると、細孔内に物質が入りやすくなる傾向にあり、細孔径分布におけるモード径が０．５μｍ未満であると、比表面積が充分なものになる。これらは上述の多孔質化剤により調整可能である。

多孔質ポリマ粒子の比表面積は、３０ｍ^２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ^２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ^２／ｇ以上であることがさらに好ましい。比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。多孔質ポリマ粒子の比表面積の上限は特に限定されないが、例えば２００ｍ^２／ｇ以下１００ｍ^２／ｇ以下とすることができる。

（被覆層）
本実施形態の被覆層は、水酸基を有する高分子を含む。水酸基を有する高分子で多孔質ポリマ粒子を被覆することによりカラム圧の上昇を抑制することができるとともに、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量が良好となる傾向にある。さらに、水酸基を有する高分子が架橋されていると、カラム圧の上昇をより抑制することが可能となる。

（水酸基を有する高分子）
水酸基を有する高分子は、１分子中に２個以上の水酸基を有することが好ましく、親水性高分子であることがより好ましい。水酸基を有する高分子としては、例えば、多糖類、ポリビニルアルコール等が挙げられる。多糖類としては、好ましくはアガロース、デキストラン、セルロース、キトサン等が挙げられる。水酸基を有する高分子としては、例えば重量平均分子量１万〜２０万程度のものが使用できる。

水酸基を有する高分子は、界面吸着能を向上させる観点から、疎水基により変性された変性体であることが好ましい。疎水基としては、例えば、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。炭素数６〜１０のアリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。疎水基は、水酸基と反応する官能基（例えば、エポキシ基）及び疎水基を有する化合物（例えば、グリシジルフェニルエーテル）を、水酸基を有する高分子と従来公知の方法で反応させることにより、導入することができる。

（被覆層の形成方法）
水酸基を有する高分子を含む被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。
まず、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させる。水酸基を有する高分子の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０（ｍｇ／ｍＬ）が好ましい。

この溶液を多孔質ポリマ粒子に含浸させる。含浸方法は、水酸基を有する高分子の溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する。含浸時間は多孔質体の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質体の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の水酸基を有する高分子を除去する。

（架橋処理）
次いで、架橋剤を加えて多孔質ポリマ粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成する。このとき、架橋体は、水酸基を有する３次元架橋網目構造を有する。

架橋剤としては、例えばエピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような、水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、水酸基を有する高分子としてキトサンのようなアミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロロオクタンのようなジハライドも架橋剤として使用できる。

この架橋反応には通常、触媒が用いられる。該触媒は架橋剤の種類に合わせて適宜従来公知のものを用いることができるが、例えば、架橋剤がエピクロルヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、ジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。

架橋剤による架橋反応は、通常、分離材を適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行われる。架橋剤の添加量は、水酸基を有する高分子として多糖類を使用した場合、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して例えば０．１〜１００モル倍の範囲内で、分離材の性能に応じて選定することができる。一般に、架橋剤の添加量を少なくすると、被覆層が多孔質ポリマ粒子から剥離しやすくなる傾向にある。また、架橋剤の添加量が過剰で、かつ、水酸基を有する高分子との反応率が高い場合、原料の水酸基を有する高分子の特性が損なわれる傾向にある。

触媒の使用量としては、架橋剤の種類により異なるが、通常、水酸基を有する高分子として多糖類を使用する場合に、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して好ましくは０．０１〜１０モル倍の範囲、さらに好ましくは０．１〜５モル倍で使用される。

例えば、該架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度に達すれば架橋反応が生起する。

水酸基を有する高分子の溶液等を含浸させた多孔質ポリマ粒子を分散、懸濁させる媒体の具体例としては含浸させた高分子溶液から高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、かつ、架橋反応に不活性なものである必要がある。その具体例としては水、アルコール等が挙げられる。

架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜１０時間かけて行う。好ましくは、３０〜９０℃の範囲の温度である。

架橋反応終了後、生成した粒子をろ別し、次いで水、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部が、水酸基を有する高分子を含む被覆層により被覆された分離材が得られる。本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜５００ｍｇの被覆層を備えると好ましく、３０〜３００ｍｇの被覆層を備えるとより好ましい。被覆層の量は熱分解の重量減少等で測定することができる。

（イオン交換基の導入）
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を表面上の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。

ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩；ジエチルアミノエチルクロライド等のハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン；ハロゲン化アルキル基を有する４級アンモニウムの塩酸塩などが挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物は、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、イオン交換基を付与する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。

イオン交換基の導入には、反応を促進させるために、有機溶媒を用いることが有効である。有機溶媒としては、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類が挙げられる。

通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加して反応させる。この反応は温度４０〜９０℃で、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されるイオン交換基が決定される。

イオン交換基として、弱塩基性基であるアミノ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、水素原子の一部が塩素原子に置換されたアルキル基を少なくとも１つ有する、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件は、４０〜９０℃で、０．５〜１２時間であることが好ましい。

イオン交換基として、強塩基性基の４級アンモニウム基を導入する方法としては、まず、３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル化合物を反応させ、４級アンモニウム基に変換させる方法などが挙げられる。また、４級アンモニウムの塩酸塩等を分離材に反応させてもよい。

イオン交換基として、弱酸性基であるカルボキシ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらハロゲン化アルキル化合物の使用量は、イオン交換基を導入する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。

イオン交換基として、強酸性基であるスルホン酸基の導入方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応条件は、３０〜９０℃で１〜１０時間であることが好ましい。

一方、イオン交換基の導入方法として、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、分離材の全質量に対して０．４質量％以上使用することが好ましい。反応条件は、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。

本実施形態の分離材の吸湿度は、次の方法で測定する。乾燥分離材１ｇを恒温恒湿度試験槽（温度６０℃、湿度９０％）に１８時間放置した後、再度分離材の質量を測定することにより吸湿度を以下の式より算出する。
（吸湿後分離材質量−１）ｇ／１ｇ×１００＝吸湿度（％）

本実施形態の分離材の吸湿度は１〜３０質量％であることが好ましく、１〜２０質量％であることがより好ましく、１〜１０質量％であることがさらに好ましい。分離材の吸湿度が３０質量％以下であると、被覆層の厚みによる分離材の通液性の低下を抑制することができる。

本実施形態の分離材又は多孔質ポリマ粒子の平均細孔径、細孔径分布におけるモード径、比表面積及び空隙率は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）にて測定した値であり、以下のようにして測定する。試料０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０ ｄｅｇｒｅｅｓ、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．１〜３μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。

本実施形態の分離材は、タンパク質を静電的相互作用による分離、アフィニティ精製に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいて、使用することも可能である。図１に分離用カラムの一実施形態を示す。分離用カラム１０は、カラム１と、カラム１に充填された分離材２とを備える。

本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性をするペプチド等の生体高分子などであり、好ましくは重量平均分子量が２００万以下、より好ましくは５０万以下である。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、条件等を選ぶ必要がある。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。

本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子上の被覆層を架橋処理後、分離材の表面にイオン交換基、プロテインＡ等を導入することにより、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子からなる粒子又は合成ポリマからなる粒子のそれぞれの利点を有する。特に本実施形態の分離材における多孔質ポリマ粒子は、上述の方法で得られるものであるため、耐久性及び耐アルカリ性を有する。また、本実施形態の分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、タンパク質の吸脱着が起こりやすい傾向にある。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着量（動的吸着量）が大きい傾向にある。

本実施形態において通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに本実施形態の分離材を充填し、液を通した際の通液速度を表す。本実施形態の分離材をカラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離を行う場合、タンパク質溶液等の通液速度としては、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲であるが、本実施形態の分離材を使用した場合は、通常のタンパク質分離用の分離材よりも速い通液速度８００ｃｍ／ｈ以上で使用することができる。

本実施形態の分離材の平均粒径は、１０〜５００μｍであることが好ましく、１０〜３００μｍであることがより好ましい。分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用には、カラム内圧の極端な増加を避けるために、１０〜１００μｍであることが好ましい。

本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーでカラム充填材として使用した場合、使用する溶出液の性質に依らず、カラム内での体積変化が少ないため、操作性に優れる。

本実施形態の分離材の５％圧縮変形弾性率は、以下のようにして算出することができる。
微小圧縮試験機（Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、室温（２５℃）条件にて荷重負荷速度１ｍＮ／秒で、四角柱の平滑な端面（５０μｍ×５０μｍ）により粒子を５０ｍＮまで圧縮したときの荷重及び圧縮変位を測定する。得られた測定値から、粒子が５％圧縮変形したときの圧縮弾性率（５％Ｋ値）を下記式により求めることができる。また、上記測定中の変位量が最も大きく変化する点の荷重を破壊強度（ｍＮ）とする。
５％Ｋ値（ＭＰａ）＝（３／２^１／２）・Ｆ・Ｓ^−３／２・Ｒ^−１／２
Ｆ：架橋ポリマ粒子が４０％圧縮変形したときの荷重（ｍＮ）
Ｓ：架橋ポリマ粒子が４０％圧縮変形したときの圧縮変位（ｍｍ）
Ｒ：架橋ポリマ粒子の半径（ｍｍ）

分離材を５％圧縮変形したときの圧縮弾性率（５％Ｋ値）は、１００〜１０００ＭＰａであり、２００〜１０００ＭＰａであることが好ましく、２５０〜１０００ＭＰａであることがより好ましい。

圧縮弾性率が１００ＭＰａ未満であると、多孔質ポリマ粒子の柔軟性が高くなり、カラム内で液を流した際に変形しやすくなり、カラム圧が高くなりやすくなる。

分離材の細孔容積（空隙率）は、分離材の全体積（細孔容積を含む）基準で３０体積％以上であることが好ましく、３０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましく、４０体積％以上７０体積％以下であることがさらに好ましい。分離材は、細孔径が０．１〜０．５μｍである細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。分離材の細孔径分布におけるモード径（細孔径分布の最頻値、最大頻度細孔径、平均細孔径）は、０．１〜０．５μｍであり、好ましくは、０．２〜０．５μｍである。細孔径分布におけるモード径が０．１μｍ以上であると、細孔内に物質が入りやすくなる傾向にあり、細孔径分布におけるモード径が０．５μｍ以下であると、比表面積が充分なものになる。

分離材の比表面積は、３０ｍ^２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ^２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ^２／ｇ以上であることがさらに好ましい。比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。分離材の比表面積の上限は特に限定されないが、例えば２００ｍ^２／ｇ以下１００ｍ^２／ｇ以下とすることができる。

分離材の５％変形弾性率、平均細孔径、細孔径分布におけるモード径、比表面積等は、多孔質ポリマ粒子の原料、多孔質化剤、水酸基を有する高分子等を適宜選択することによって、調整することができる。

なお、本実施形態では、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。すなわち、本実施形態の分離用カラムは、カラムと該カラムに充填された本実施形態の分離材とを備えるものである。

第１実施形態に係る分離材によれば、タンパク質の非特異吸着を低減し、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れる分離材を提供することができる。

［第２実施形態及び第３実施形態］
以下に、第２実施形態及び第３実施形態に係る分離材について説明する。本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、前記被覆層が、水酸基を有する高分子を含む。なお、本実施形態において、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。例えば、多孔質ポリマ粒子の外側の表面、及び／又は、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面に、水酸基を有する高分子がコーティングされていてもよい。

（多孔質ポリマ粒子）
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、例えば、モノマを重合することにより得られる重合体を含み、モノマ由来の構造単位を有することができる。多孔質ポリマ粒子は、粒子の全質量基準で５０質量％以上のポリマを含んでいてもよく、ポリマからなる粒子であってもよい。また、多孔質ポリマ粒子は、モノマと多孔質化剤とを含む組成物を重合させた後、多孔質化剤を除去することによって得ることができる。多孔質ポリマ粒子は、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、（メタ）アクリル系モノマ、スチレン系モノマ等のビニルモノマを使用することができる。具体的なモノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。

多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物；（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコール系ジ（メタ）アクリレート；トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルプロパントリアクリレート等の３官能以上の（メタ）アクリレート；エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、プロポキシ化エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、トリシクロデカンジメタノールジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタンジ（メタ）アクリレート、エトキシ化シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート；ジアリルフタレート及びその異性体；トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体が挙げられる。多官能性モノマとしては、新中村化学工業株式会社製のＮＫエステル（Ａ−ＴＭＰＴ−６Ｐ０、Ａ−ＴＭＰＴ−３Ｅ０、Ａ−ＴＭＭ−３ＬＭＮ、Ａ−ＧＬＹシリーズ、Ａ−９３００、ＡＤ−ＴＭＰ、ＡＤ−ＴＭＰ−４ＣＬ、ＡＴＭ−４Ｅ、Ａ−ＤＰＨ等）、新日鉄住金化学株式会社のジビニルベンゼン（ＤＶＢ９６０）などが商業的に入手可能である。多官能性モノマは、１種単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。

上記の中でも、耐久性、耐酸性、耐アルカリ性及び膨潤性に優れる観点から、ジビニルベンゼンを使用することが好ましい。モノマがジビニルベンゼンを含む場合、ジビニルベンゼンの含有量は、耐久性、耐酸性、耐アルカリ性及び膨潤性にさらに優れる観点から、モノマ全質量基準で、５０質量％以上が好ましく、６０質量％以上がより好ましく、７０質量％以上がさらに好ましく、８０質量％以上がよりさらに好ましい。

単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体；アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２−クロロエチル、アクリル酸フェニル、α−クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ｎ−オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル等の（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、安息香酸ビニル、酪酸ビニル等のビニルエステル；Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニルカルバゾール、Ｎ−ビニルインドール、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビニル化合物；フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、アクリル酸トリフルオロエチル、アクリル酸テトラフルオロプロピル等の含フッ素化モノマ；ブタジエン、イソプレン等の共役ジエンが挙げられる。単官能性モノマは、１種単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。上記の中でも、耐酸性及び耐アルカリ性に優れる観点から、スチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシ基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。

多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。具体的には、トルエン、ジエチルベンゼン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、イソアミルアルコール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。多孔質化剤は、１種単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。

多孔質化剤として、水を取り込みやすい物質を使用した場合、粒子内部に大きな孔が開きやすくなるため使用することが好ましい。このような多孔質化剤としては、例えばアルコール類が挙げられる。

上記多孔質化剤は、モノマ全質量基準で０〜２５０質量％使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空孔率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールできる。

上記多孔質化剤は、モノマ全質量基準で０〜２５０質量％使用でき、０〜２００質量％使用することが好ましい。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空孔率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールできる。

また、溶媒として使用する水を多孔質化剤として使用することもできる。水を多孔質化剤として使用する場合、モノマに油溶性界面活性剤（乳化剤）を溶解させることで、水を吸収し、粒子を容易に多孔質化させることが可能である。

油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル（例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル（例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート、又は、ヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及び、これらの乳化剤の混合物が挙げられる。

好ましい油溶性界面活性剤としては、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０。好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）；ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）８０。好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）；ジグリセロールモノオレエート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）；ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）；ジグリセロールモノミリステート（好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）；ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル；及び、これらの混合物が挙げられる。

油溶性界面活性剤は、モノマ全質量基準で５〜８０質量％の範囲で使用することが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成しにくくなる。油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持しやすくなる。

多孔質ポリマ粒子を得るための組成物は、多孔質化剤として溶解性粒子を含んでいてもよい。溶解性粒子とは、例えば、酸、アルカリ、溶剤等に溶解させることが可能な粒子である。溶解性粒子は、重合中には溶解せず、粒子形成後にポリマ粒子を酸溶液に浸すことによって粉体多孔質化剤を溶解する方法等により、除去することができる。溶解性粒子の構成材料としては、具体的には、炭酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、シリカ、ポリマ、金属コロイド等を使用することができる。溶解性粒子の構成材料としては、除去しやすさの観点から、炭酸カルシウム、第三リン酸カルシウム等を用いることが好ましい。溶解性粒子の粒径は、０．６〜５μｍが好ましい。溶解性粒子の粒径は、分離材内の通液性をさらに向上させる観点から、１〜５μｍがより好ましい。なお、溶解性粒子の平均粒径は、後述の多孔質ポリマ粒子の平均粒径の測定方法と同様の方法で測定することができる。

重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。

アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩；ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩；アルキルナフタレンスルホン酸塩；アルカンスルホン酸塩；ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩；アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）；アルキルリン酸エステル塩；ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物；ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩；ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩が挙げられる。

カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩；ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の４級アンモニウム塩が挙げられる。

ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤；シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤；パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。

両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤；リン酸エステル系界面活性剤；亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。

界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマの重合時の分散安定性に優れる観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。

必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。

重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。

多孔質ポリマ粒子の合成（重合工程）において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を用いてもよく、乳化液に高分子分散安定剤を添加してもよい。

高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。

モノマが単独で重合することを抑えるため（例えば、水中でモノマが単独に乳化重合した粒子の発生を抑えるため）に、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。

多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは３００μｍ以下、さらに好ましくは１５０μｍ以下、よりさらに好ましくは１２０μｍ以下、特に好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、通液性の更なる向上の観点、及び、カラム充填後のカラム圧が増加することを抑制する観点から、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上、さらに好ましくは５０μｍ以上である。

多孔質ポリマ粒子の細孔容積（空隙率）は、多孔質ポリマ粒子の全体積基準で３０〜７０体積％であることが好ましく、４０〜７０体積％であることがより好ましく、５０〜７０体積％であることがさらに好ましい。多孔質ポリマ粒子は、細孔径（モード径）が０．０１μｍ以上０．６μｍ未満である細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。細孔径は、０．１μｍ以上０．５μｍ未満であることがより好ましく、０．２μｍ以上０．５μｍ未満であることがさらに好ましい。細孔径が０．０１μｍ以上であると、細孔内に物質が入りやすくなる傾向があり、細孔径が０．６μｍ未満であると、比表面積が充分なものになる。これらは上述の多孔質化剤により調整可能である。

多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性をさらに向上させる観点から、３〜１５％であることが好ましく、５〜１５％又は３〜１２％であることがより好ましく、３〜１０％がさらに好ましく、５〜１０％であることがよりさらに好ましい。Ｃ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（例えば株式会社日立製作所製）等の乳化装置により単分散化する方法が挙げられる。

多孔質ポリマ粒子の比表面積は、３０ｍ^２／ｇ以上が好ましい。比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向がある。多孔質ポリマ粒子の比表面積は、より高い実用性の観点から、３５ｍ^２／ｇ以上がより好ましく、４０ｍ^２／ｇ以上がさらに好ましい。

（被覆層）
本実施形態の被覆層は、水酸基を有する高分子（例えば水溶性高分子）を含む。水酸基を有する高分子で多孔質ポリマ粒子を被覆することによりカラム圧の上昇を抑制することができると共に、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量を、天然高分子を用いた場合と同等又はそれ以上とすることができる。さらに、水酸基を有する高分子が架橋されていると、カラム圧の上昇をさらに抑制することが可能となる。

水酸基を有する高分子は、１分子中に２個以上の水酸基を有することが好ましい。また、水酸基を有する高分子は、親水性高分子であることが好ましい。水酸基を有する高分子としては、例えば多糖類（アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、キトサン等）が挙げられ、各々重量平均分子量１万〜２０万程度のものが使用できる。

また、水酸基を有する高分子としては、界面吸着能を向上させる観点から、疎水基により変性された変性体（疎水基を導入した変性体等）を用いることができる。疎水基としては、例えば、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。炭素数６〜１０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。疎水基は、水酸基と反応する官能基（エポキシ基等）及び疎水基を有する化合物（グリシジルフェニルエーテル等）を、水酸基を有する高分子と従来公知の方法で反応させることにより導入することができる。このような変性体としては、例えば、多糖類の変性体が挙げられ、具体的には、アガロースの変性体（変成アガロース）、デキストランの変性体、セルロースの変性体、ポリビニルアルコールの変性体、キトサンの変性体等が挙げられる。

［被覆層の形成方法］
水酸基を有する高分子を含む被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。被覆層は、水酸基を有する高分子を多孔質ポリマ粒子にコーティングさせることで形成することができる。被覆層の形成方法としては、例えば、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させ、未吸着分を除去後、架橋剤により架橋反応させて、細孔内に担持させる方法が挙げられる。水酸基を有する高分子の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０ｍｇ／ｍＬが好ましい。

この溶液を多孔質ポリマ粒子に含浸させる。含浸方法としては、水酸基を有する高分子の溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する方法が挙げられる。含浸時間は、多孔質ポリマ粒子の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質ポリマ粒子の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、水酸基を有する高分子の未吸着分を除去する。

［架橋処理］
次いで、架橋剤を加えて、多孔質ポリマ粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成する。例えば、架橋剤を加えて、多孔質ポリマ粒子の表面に吸着した水酸基を有する高分子を架橋反応させて、高分子の架橋ゲルを形成させる。このとき、架橋体において、例えば、水酸基を有する高分子が３次元架橋網目構造を有するようになる。

架橋剤としては、例えば、エピクロロヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような、水酸基（ＯＨ基）に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、水酸基を有する高分子として、キトサンのような、アミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロロオクタンのようなジハライドも架橋剤として使用できる。

この架橋反応には通常触媒が用いられ、該触媒は架橋剤の種類により異なるが、例えば、架橋剤がエピクロロヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、架橋剤がジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。

架橋剤による架橋反応は、通常、架橋前の分離材を適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行うことができる。架橋剤の添加量は、水酸基を有する高分子として多糖類又はその変性体を使用した場合、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．１〜１００モル倍の範囲内で、目的とする分離材の性能に応じて選定することができる。一般的に、架橋剤の添加量が０．１モル倍未満であると、被覆層が多孔質ポリマ粒子から剥離しやすくなる傾向がある。また、架橋剤の添加量が１００モル倍を超え、かつ、水酸基を有する高分子との反応率が高い場合、原料の水酸基を有する高分子の特性が損なわれる傾向がある。

また、架橋反応時の触媒の使用量としては、架橋剤の種類にもよるが、通常、水酸基を有する高分子として多糖類を使用する場合、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して好ましくは０．０１〜１０モル倍の範囲、より好ましくは０．１〜５モル倍の範囲で使用される。

例えば、該架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度に達すれば架橋反応が生起する。

水酸基を有する高分子の溶液等を吸着させた多孔質ポリマ粒子を分散、懸濁させる媒体の具体例としては、吸着させた高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、かつ、架橋反応に不活性なものであれば制限はない。そのような媒体としては、具体的には、水、アルコール等が挙げられる。

架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜２４時間、又は１〜１０時間かけて行う。好ましくは、３０〜９０℃の範囲の温度である。

架橋反応終了後、生成した多孔質ポリマ粒子（多孔質体）と架橋ゲルとの複合体をろ別し、次いで、水、親水性有機溶媒（メタノール、エタノール等）などで洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部が、水酸基を有する高分子を含む被覆層により被覆された分離材が得られる。本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜５００ｍｇの被覆層を備えることが好ましい。被覆層の量は、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜４５０ｍｇであることがより好ましく、３０〜４００ｍｇであることがさらに好ましい。被覆層の量は、熱分解の重量減少等で測定することができる。

［イオン交換基の導入］
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を粒子表面の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法としては、例えば、ハロゲン化アルキル化合物（ハロゲン化アルキル基含有化合物）を用いる方法が挙げられる。

ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩；ジエチルアミノエチルクロライド等の、ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン；ハロゲン化アルキル基を有する４級アンモニウムの塩酸塩などが挙げられる。ハロゲン化アルキル化合物としては、臭化物又は塩化物が好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量は、イオン交換基を導入する分離材（イオン交換基を導入する前の分離材）の全質量基準で０．２質量％以上が好ましい。

通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水、又は、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加し反応させる。イオン交換基の導入方法としては、一般的には、水酸化ナトリウム水溶液に親水性天然高分子を溶解し、水、又は、水−有機溶媒混合系で、ハロゲン化アルキル化合物と反応させる方法が挙げられる。ハロゲン化アルキル化合物の使用量は、例えば、親水性天然高分子の全質量基準で０．２質量％以上である。この反応は、温度４０〜９０℃で、還流下、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されたイオン交換基が決定される。

弱塩基性基であるアミノ基をイオン交換基として導入する方法としては、前記ハロゲン化アルキル化合物のうち、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミノクロライド、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミノクロライド、モノ（又はジ−）アルキル−モノ（又はジ−）アルカノールアミノクロライド等の２級又は３級アミノハロゲナイドなどを反応させる方法が挙げられる。これらのアミンの使用量は、例えば、イオン交換基を導入する分離材の全質量基準で０．２質量％以上である。反応条件は、例えば、４０〜９０℃で０．５〜１２時間である。

強塩基性基である４級アンモニウム基をイオン交換基として導入する方法としては、まず、３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロロヒドリン等のハロゲン化アルキル化合物を反応させて４級アンモニウム基に変換させる方法などが挙げられる。又は、４級アンモニウムクロライド等の４級アミノハロゲナイドなどを上述の１〜３級アミノクロライドと同様の方法で分離材（複合体）と反応させてもよい。

弱酸性基であるカルボキシ基をイオン交換基として導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量は、例えば、イオン交換基を導入する分離材の全質量基準で０．２質量％以上である。

強酸性基であるスルホン酸基をイオン交換基として導入する方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応条件は、例えば、３０〜９０℃で１〜１０時間である。

イオン交換基を導入する他の方法としては、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、例えば、イオン交換基を導入する分離材の全質量基準で０．４質量％以上使用する。反応条件は、例えば、０〜９０℃で０．５〜１２時間である。

これらの方法以外のイオン交換基の導入方法としては、スルホプロピルを反応させる方法や、エピハロヒドリンジグリシジル化合物等を付加させた後にグリシジル基にイオン交換基を導入する方法も挙げられる。

本実施形態の分離材の細孔容積（空隙率）は、分離材の全体積基準で、３０体積％以上であってよく、４０体積％以上であることが好ましく、５０体積％以上であることがより好ましく、４０〜７０体積％であることがさらに好ましく、５０〜７０体積％がよりさらに好ましく、５０〜６５体積％が特に好ましい。細孔容積がこれらの範囲にあると、粒子の強度が向上する（粒子が破砕しにくい）傾向にある。

本実施形態の分離材の細孔径（モード径、細孔径分布の最頻値、最大頻度細孔径）は、０．０５〜０．６μｍであることが好ましく、０．０５〜０．５μｍであることがより好ましく、０．１〜０．５μｍであることがさらに好ましい。細孔径がこれらの範囲にあると、粒子中に液が流れやすくなり、動的吸着量を多くしやすい。

本実施形態の分離材の比表面積は、３０ｍ^２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は、３５ｍ^２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ^２／ｇ以上であることがさらに好ましい。比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなりやすい傾向がある。分離材の比表面積の上限は、特に限定されないが、例えば３００ｍ^２／ｇ以下とすることができる。

本実施形態の分離材又は多孔質ポリマ粒子の細孔容積、細孔径（モード径）及び比表面積は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）を用いて、例えば、以下のようにして測定することができる。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０ｄｅｇｒｅｅｓ、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔容積及び比表面積は、得られた細孔径分布における最頻値に対応する細孔径（モード径）を細孔径０．０５〜５μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。

本実施形態の分離材の平均粒径は、１０〜５００μｍであることが好ましく、３０〜１５０μｍであることがより好ましい。分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用には、カラム内圧の極端な増加を避けるために、５０〜１５０μｍであることがより好ましく、５０〜１００μｍであることがさらに好ましい。

本実施形態の分離材又は多孔質ポリマ粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）は、以下の測定法により求めることができる。
１）超音波分散装置を使用して粒子を水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフローＦＰＩＡ−３０００、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径と粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）を測定する。

分離材の細孔径（モード径）、比表面積等は、多孔質ポリマ粒子の原料、多孔質化剤、水酸基を有する高分子等を適宜選択することによって調整することができる。

本実施形態の分離材は、タンパク質の静電的相互作用による分離、アフィニティ精製等に用いるのに好適である。例えば、イオン交換基を導入した分離材（イオン交換体）を用いて、以下の方法により、タンパク質を回収することができる。まず、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離及び回収できる。また、本実施形態の分離材は、例えば、液体クロマトグラフィー用分離材として、カラムクロマトグラフィーにおいて使用することもできる。本実施形態のカラムは、本実施形態の分離材を備え、例えば、本実施形態の分離材を充填してなる。図１に分離用カラムの一実施形態を示す。分離用カラム１０は、カラム１と、カラム１に充填された分離材２とを備える。

本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン（ＢＳＡ：Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｕｂｕｍｉｎ）、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質；生体中に存在する酵素；バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質；ＤＮＡ；生理活性をするペプチド等の生体高分子である。生体高分子の分子量は、２００万以下が好ましく、５０万以下がより好ましい。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、条件等を選ぶことができる。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。

水酸基を有する高分子の架橋体により多孔質ポリマ粒子をコーティングした後、粒子表面、及び／又は、細孔内にイオン交換基、プロテインＡ等を導入することにより、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子及びポリマからなる粒子の持つそれぞれの利点をあわせ持った特性を示しやすい。この性能は、従来の技術では発揮されなかったものである。特に、このような本実施形態の分離材の骨格となる多孔質ポリマ粒子は、上記のような方法で得られる粒子であるため、耐久性及び耐アルカリ性に優れる。また、水酸基を有する高分子の架橋体をコーティングすることにより、非特異吸着がさらに起こりにくく、タンパク質の脱吸着が起こりやすい傾向にある。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着容量（動的吸着容量）が大きい点でも従来のイオン交換樹脂に比べて好ましい性質を有する。

本実施形態における「通液速度」とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに本実施形態の分離材を充填し、液を流した際の通液速度を表す。本実施形態の分離材をカラムに充填した場合、カラム圧が０．３ＭＰａのときの通液速度（流速）は、８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましく、１０００ｃｍ／ｈ以上であることがより好ましく、１３００ｃｍ／ｈ以上であることがさらに好ましく、１５００ｃｍ／ｈ以上であることが特に好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離を行う場合、カラムに通液されるタンパク質溶液等の通液速度としては、一般的に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲であるが、本実施形態の分離材を使用した場合は、通常のタンパク質分離用の分離材よりも速い通液速度である８００ｃｍ／ｈ以上でも高吸着容量で使用できる。

本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーでカラム充填材として使用した場合、使用する溶出液の性質によらず、カラム内での体積変化が少ないため、操作性に優れる。

なお、本実施形態では、主に、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。すなわち、本実施形態の分離用カラムは、カラムと該カラムに充填された本実施形態の分離材とを備えるものである。

［第２実施形態］
第２実施形態において、湿潤状態において本実施形態の分離材を５０ｍＮで圧縮した際の圧縮変形率は、粒径の３０％未満である。また、本実施形態の分離材を５０ｍＮで圧縮した際における乾燥状態の圧縮回復率に対する湿潤状態の圧縮回復率の比（圧縮回復率比。湿潤状態／乾燥状態）は０．８以上である。第２実施形態によれば、通液性に優れると共に、タンパク質の非特異吸着を低減し、かつ、タンパク質吸着量に優れる分離材、及びこれを用いた分離用カラムを提供することができる。ここで、「湿潤状態」とは、水分により飽和した状態を指す。「乾燥状態」とは、水分を含まない状態（例えば、真空、加熱乾燥等により水分が除かれた状態）を指す。湿潤状態を維持するには、測定する直前に水中から分離材を取り出して使用することが好ましい。

本実施形態の分離材の圧縮変形率及び圧縮回復率は、例えば以下の方法で測定できる。

微小圧縮試験機（Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、室温（２５℃）にて荷重負荷速度１ｍＮ／秒で、四角柱の平滑な端面（５０μｍ×５０μｍ）により分離材を５０ｍＮまで圧縮したときの荷重及び圧縮変位を測定し、その際の最大変位量から、以下の式（１）により圧縮変形率を算出できる。
圧縮変形率（％）＝（５０ｍＮ圧縮時の粒径の変形量）／平均粒径×１００・・（１）

湿潤状態における分離材の圧縮変形率は、通液性に優れると共に、タンパク質の非特異吸着を低減し、かつ、タンパク質吸着量に優れる観点から、３０％未満である。圧縮変形率が３０％以上の場合、分離材が変形しすぎるために、カラムに用いた際にカラム内において圧密化し、カラム圧が高くなる。また、圧縮変形率が３０％以上の場合、カラムを通液した際に分離材が破壊されてカラムが詰まってしまう場合もある。湿潤状態における分離材の圧縮変形率は、通液性にさらに優れると共に、タンパク質の非特異吸着をさらに低減し、かつ、タンパク質吸着量にさらに優れる観点から、２５％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましい。

５０ｍＮ圧縮した状態から１ｍＮ／秒の速度で０ｍＮまで除荷した際の変位量から、以下の式（２）より圧縮回復率を算出できる。
圧縮回復率（％）＝（５０ｍＮから０ｍＮまで除荷した際の変位量）／（５０ｍＮ圧縮時の粒径の変形量）・・（２）

湿潤状態の圧縮回復率は、７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましい。圧縮回復率が７０％以上である場合、圧縮による塑性変形が発生し難くなるため、カラム圧が高くなり難い。

湿潤状態及び乾燥状態での分離材の圧縮回復率を測定し、以下の式（３）より圧縮回復率比を算出できる。
圧縮回復率比＝（湿潤状態の圧縮回復率）／（乾燥状態の圧縮回復率）・・（３）

圧縮回復率比は、通液性に優れると共に、タンパク質の非特異吸着を低減し、かつ、タンパク質吸着量に優れる観点から、０．８以上である。圧縮回復率比が０．８未満である場合、分離材が膨潤することにより柔軟になるため、分離材をカラムに用いた際にカラム圧が高くなる。圧縮回復率比は、通液性にさらに優れると共に、タンパク質の非特異吸着をさらに低減し、かつ、タンパク質吸着量にさらに優れる観点から、０．９以上であることが好ましく、０．９５以上であることがより好ましい。

第２実施形態に係る分離材は、カラム充填材として用いたときの通液性に優れると共に、タンパク質の非特異吸着を低減し、かつ、タンパク質吸着量に優れる。また、第２実施形態によれば、天然高分子及びポリマ粒子の従来の課題を解決した充填材として、親水性天然高分子を母体とする充填材が有する、タンパク質等の生体高分子の分離に対する優れた分離能を保持しながら、疎水的相互作用による非特異吸着がなく、かつ、静電的相互作用やアフィニティ精製により生体高分子を分離精製するカラム充填材を提供することができる。

［第３実施形態］
第３実施形態において、湿潤状態における分離材の５％圧縮変形弾性率は、１００ＭＰａ以上である。また、本実施形態の分離材の湿潤状態の５％圧縮変形弾性率に対する乾燥状態の５％圧縮変形弾性率の比（５％圧縮変形弾性率比、乾燥状態／湿潤状態）は１．８５以上である。第３実施形態によれば、タンパク質の非特異吸着を低減し、かつ、タンパク質吸着量に優れる分離材、及び、これを用いた分離用カラムを提供することができる。ここで、「湿潤状態」とは、水分により飽和した状態を指す。「乾燥状態」とは、水分を含まない状態（例えば、真空、加熱乾燥等により水分が除かれた状態）を指す。湿潤状態を維持するには、測定する直前に水中から分離材を取り出して使用することが好ましい。

本実施形態の分離材の５％圧縮変形弾性率（例えば、分離材を５０ｍＮで圧縮したときの５％圧縮変形弾性率）は、以下のようにして算出することができる。
微小圧縮試験機（Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、室温（２５℃）にて荷重負荷速度１ｍＮ／秒で四角柱の平滑な端面（５０μｍ×５０μｍ）により分離材を０ｍＮから５０ｍＮまで圧縮したときの荷重及び圧縮変位を測定する。得られた測定値から、分離材が５％圧縮変形したときの圧縮変形弾性率（５％Ｋ値）を下記式により求めることができる。
５％Ｋ値（ＭＰａ）＝（３／２^１／２）×Ｆ×Ｓ^−３／２×Ｒ^−１／２
Ｆ：分離材が５％圧縮変形したときの荷重（ｍＮ）
Ｓ：分離材が５％圧縮変形したときの圧縮変位（μｍ）
Ｒ：分離材の半径（μｍ）

湿潤状態における分離材の５％圧縮変形弾性率は、１００ＭＰａ以上である。湿潤状態における分離材の５％圧縮変形弾性率が１００ＭＰａ未満である場合、分離材の柔軟性が高まることにより分離材が変形しやすいために、カラム内において圧密化してカラム圧が高くなる。この結果、カラムの通液性が悪化してタンパク質吸着量が減少する傾向にある。また、分離材の変形に起因して被覆層と多孔質ポリマ粒子との間に隙間が生じやすくなり、当該隙間にタンパク質が吸着することにより、タンパク質の非特異吸着量が増加する傾向にある。湿潤状態における分離材の５％圧縮変形弾性率が１００ＭＰａ以上である場合には、このようなカラム圧の上昇が抑制され、分離材の変形が抑制されることにより、タンパク質の非特異吸着が低減されると共に、タンパク質吸着量に優れる。湿潤状態における分離材の５％圧縮変形弾性率は、タンパク質の非特異吸着をさらに低減し、かつ、タンパク質吸着量にさらに優れる観点から、１１０ＭＰａ以上が好ましく、１２０ＭＰａ以上がより好ましく、１３０ＭＰａ以上がさらに好ましい。湿潤状態における分離材の５％圧縮変形弾性率は、例えば１０００ＭＰａ以下である。

乾燥状態における分離材の５％圧縮変形弾性率は、粒子の崩壊を防ぐ観点から、１８０ＭＰａ以上が好ましく、２５０ＭＰａ以上がより好ましく、３００ＭＰａ以上がさらに好ましい。

本実施形態において、分離材の湿潤状態の５％圧縮変形弾性率に対する乾燥状態の５％圧縮変形弾性率比は、１．８５以上である。５％圧縮変形弾性率比が１．８５未満である場合、分離材表面が親水性に乏しいことから、非特異吸着が増加する。また、被覆層における水酸基の数が少ないことから、イオン交換基を導入した場合であっても、イオン交換基の量が少なくなる傾向にあるため、動的吸着量を改善し難くなる。

５％圧縮変形弾性率比は、湿潤状態及び乾燥状態における分離材のそれぞれの５％圧縮変形弾性率を測定し、以下の式より算出することができる。
５％圧縮変形弾性率比＝（乾燥状態の５％圧縮変形弾性率）／（湿潤状態の５％圧縮変形弾性率）

５％圧縮変形弾性率比は、タンパク質の非特異吸着をさらに低減し、かつ、タンパク質吸着量にさらに優れる観点から、１．９以上が好ましく、２．０以上がより好ましく、２．２以上がさらに好ましく、２．５以上が特に好ましい。５％圧縮変形弾性率比は、タンパク質の非特異吸着をさらに低減し、かつ、タンパク質吸着量にさらに優れる観点から、３．５以下が好ましく、３．３以下がより好ましく、３．１以下がさらに好ましい。

分離材の５％圧縮変形弾性率は、架橋剤の種類及び使用量、被覆層の量等により調整することができる。例えば、架橋剤の使用量又は被覆層の量が多いほど、５％圧縮変形弾性率が大きくなる傾向がある。

第３実施形態に係る分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、かつ、タンパク質吸着量に優れる。第３実施形態に係る分離材は、耐久性にも優れる。また、本実施形態によれば、天然高分子及びポリマ粒子の従来の課題を解決した充填材として、親水性天然高分子を母体とする充填材が有する、タンパク質等の生体高分子の分離に対する優れた分離能を保持しながら、疎水的相互作用による非特異吸着がなく、かつ、静電的相互作用やアフィニティ精製により生体高分子を分離精製するカラム充填材を提供することができる。

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

［試験例１］
（実施例１）
＜多孔質ポリマ粒子１の合成＞
５００ｍＬの三口フラスコに、純度９６％のジビニルベンゼン（新日鉄住金化学株式会社製、商品名：ＤＶＢ９６０）を１６ｇ、スパン８０を６ｇ、過酸化ベンゾイルを０．６４ｇ加え、ポリビニルアルコール（０．５質量％）水溶液を調製した。マイクロプロセスサーバーを使用してこの水溶液を乳化後、得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約８時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、アセトン洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子１を得た。得られた多孔質ポリマ粒子１の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、上述の方法で平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）を算出した。結果を表１に示す。

＜被覆層の形成及び架橋＞
アガロース水溶液（２質量％）１００ｍＬに水酸化ナトリウム４ｇ及びグリシジルフェニルエーテル０．１４ｇを投入して７０℃で１２時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで再沈殿させ、洗浄した。
２０ｍｇ／ｍＬの変性アガロース水溶液に多孔質ポリマ粒子１を、水溶液７０ｍＬに対して多孔質ポリマ粒子１を１ｇの割合で投入し、５５℃で２４時間撹拌して、多孔質ポリマ粒子１に変性アガロースを吸着させた。吸着後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。粒子への変性アガロースの吸着量は乾燥させた粒子の熱重量減少を測定し、算出した。
変性アガロースは次のようにして架橋した。エチレングリコールジグリシジルエーテル及び水酸化ナトリウムの濃度がそれぞれ０．６４Ｍ、０．４Ｍである水溶液に、水溶液３５ｍＬに対して変性アガロースが吸着した多孔質ポリマ粒子１を１ｇの割合で投入し、２４時間３０℃にて撹拌した。その後、２質量％の熱したドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で洗浄し、分離材を得た。得られた分離材を乾燥後、熱重量分析により多孔質粒子１ｇ当たりの被覆層の質量を測定した。

（タンパク質の非特異吸着能評価）
得られた分離材０．５ｇをＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）濃度２０ｍｇ／ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍＬに投入し、２４時間室温で撹拌を行った。その後、遠心分離で上澄みをとり、分光光度計でろ液のＢＳＡ濃度を測定することにより、分離材に吸着したＢＳＡ量を非特異吸着量として算出した。ＢＳＡの濃度は分光光度計により２８０ｎｍの吸光度から確認した。結果を表２に示す。

＜イオン交換基の導入＞
得られた分離材を、遠心分離することにより水を除去した後、５Ｍの水酸化ナトリウム水に投入し、室温で１時間放置した。ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩を所定量溶解させた１６ｍＬの水に分散させ、さらにイソプロピルアルコール１２８ｍＬと混合して、水酸化ナトリウム含浸状態の複合体に加えた。温度を７０℃まで上げ、撹拌しながら５時間反応させた。反応終了後、ろ過、水洗し、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有するＤＥＡＥ変性分離材を得た。得られたＤＥＡＥ変性分離材の平均細孔径及び比表面積を水銀圧入法にて測定した。結果を表２に示す。

得られたＤＥＡＥ変性分離材のイオン交換容量を以下のように測定した。５ｍＬ容量の粒子を０．１Ｎ水酸化ナトリウム２０ｍＬに１時間浸漬し、室温で撹拌した。その後、溶液のｐＨが７以下となるように水で洗浄を行った。得られた粒子を０．１Ｎ塩酸２０ｍＬに浸漬し、１時間撹拌させた。粒子をろ過後、ろ液の塩酸水溶液を中和滴定することにより、ＤＥＡＥ変性分離材のイオン交換容量を測定した。

（カラム特性評価）
得られたＤＥＡＥ変性分離材を濃度３０質量％のスラリー（溶媒：メタノール）としてφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに１５分かけて充填した。その後、カラムに流速を変えながら水を流し、流速とカラム圧との関係を測定し、０．３ＭＰａ時の通液速度（線流速）を測定した。結果を表２に示す。

動的吸着量は以下のようにして測定した。２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに１０カラム容量通した。その後、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を通し、ＵＶ測定によってカラム出口でのＢＳＡ濃度を測定した。カラム入口と出口のＢＳＡ濃度が一致するまで緩衝液を通し、５カラム容量分の１Ｍ ＮａＣｌ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈した。１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量を以下の式を用いて算出した。結果を表２に示す。
ｑ_１０＝ｃ_ｆＦ（ｔ_１０−ｔ_０）／Ｖ_Ｂ
ｑ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ ｗｅｔ ｒｅｓｉｎ）
ｃｆ：注入しているＢＳＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｖ_Ｂ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間（ｍｉｎ）
ｔ_０：ＢＳＡ注入開始時間（ｍｉｎ）

（耐アルカリ性評価）
得られたＤＥＡＥ変性分離材を０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で２４時間撹拌し、リン酸緩衝液で洗浄後、カラム特性評価と同様の条件にて充填した。ＢＳＡの１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ動的吸着量を測定し、アルカリ処理前の動的吸着量と比較した。動的吸着量の減少率が３％以下であるものを「Ａ」、３％超２０％以下であるものを「Ｂ」、２０％超であるものを「Ｃ」とした。結果を表２に示す。

（吸湿度、５％圧縮変形弾性率）
吸湿度、５％圧縮変形弾性率は、上述の方法で測定した。結果を表２に示す。

（実施例２）
スパン８０の使用量を８ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子２を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子２を、多孔質ポリマ粒子１と同様の方法で処理することによって、分離材及びＤＥＡＥ変性分離材を得た。分離材及びＤＥＡＥ変性分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

（実施例３）
ジビニルベンゼン（１６ｇ）を、ジビニルベンゼン１２ｇ及びオクタノール４ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子３を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子３を多孔質ポリマ粒子１と同様の方法で処理することによって、分離材及びＤＥＡＥ変性分離材を得た。分離材及びＤＥＡＥ変性分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

（実施例４）
スパン８０の使用量を４ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子４を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子４を多孔質ポリマ粒子１と同様の方法で処理することによって、分離材及びＤＥＡＥ変性分離材を得た。分離材及びＤＥＡＥ変性分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

（実施例５）
スパン８０の使用量を３ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子５を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子５を多孔質ポリマ粒子１と同様の方法で処理することによって、分離材及びＤＥＡＥ変性分離材を得た。分離材及びＤＥＡＥ変性分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

（比較例１）
ジビニルベンゼン（１６ｇ）及びスパン８０（６ｇ）を、ジビニルベンゼン（４ｇ）、ジヒドロキシプロピルメタクリレート（８ｇ）及びスパン８０（４ｇ）に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子６を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子６を、水酸基を有する高分子（アガロース）による被覆層の形成及び架橋を行わずにＤＥＡＥ変性することによって、分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

（比較例２）
市販のアガロース粒子（Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ：ＧＥヘルスケア）を、多孔質ポリマ粒子７として使用した。また、多孔質ポリマ粒子７をそのまま分離材として用いた。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

（比較例３）
ジビニルベンゼン（１６ｇ）及びスパン８０（６ｇ）を、２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレート（１１．２ｇ）、エチレングリコールジメタクリレート（４．８ｇ）及びスパン８０（５ｇ）に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子８を合成した。洗浄後の多孔質ポリマ粒子８（４ｇ）を、デキストラン（分子量１５万）１ｇ、水酸化ナトリウム０．６ｇ及び水素化ホウ素ナトリウム０．１５ｇを蒸留水に溶解させた溶液６ｇに加えて、多孔質ポリマ粒子８の細孔内に含浸させた。得られたデキストラン溶液含浸重合体を、１質量％エチルセルローストルエン溶液１Ｌに加えて撹拌し、分散、懸濁せしめた。得られた懸濁液中に、エピクロルヒドリン５ｍＬを加えて５０℃に昇温し、この温度で６時間撹拌して、多孔質ポリマ粒子８の細孔内に含浸されているデキストランを架橋反応させた。反応終了後、懸濁液をろ過して生成ゲル状物を分離し、トルエン、エタノール、蒸留水で順次洗浄することによって、分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

（比較例４）
ジビニルベンゼン（１６ｇ）を、ジビニルベンゼン（新日鉄住金株式会社製、商品名：ＤＶＢ９６０）４ｇ及びスチレン１２ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして多孔質ポリマ粒子９を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子９を、多孔質ポリマ粒子１と同様の方法で処理することによって、分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

［試験例２］
＜実施例６＞
（多孔質ポリマ粒子１０の合成）
５００ｍＬの三口フラスコに、モノマとして純度９６質量％のジビニルベンゼン（ＤＶＢ９６０、新日鉄住金化学株式会社）１６ｇ、多孔質化剤としてヘキサノール１６ｇ及びトルエン１６ｇ、並びに、開始剤として過酸化ベンゾイル０．６４ｇを、分散安定剤であるポリビニルアルコール水溶液（０．５質量％）に加えた。次いで、マイクロプロセスサーバーを使用してこのポリビニルアルコール水溶液を乳化した。得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約８時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子１０を得た。得られた多孔質ポリマ粒子１０の平均粒径をフロー型粒径測定装置（ＦＰＩＡ−３０００、シスメックス株式会社製）で測定し、平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を算出した（表３）。

（被覆層の形成：水酸基を有する水溶性高分子によるコーティング）
アガロース水溶液（２質量％）１００ｍＬに、水酸化ナトリウム４ｇと、グリシジルフェニルエーテル０．１４ｇとを加え、７０℃で１２時間反応させることにより、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで沈殿させ、洗浄した。

得られた変性アガロースを再度水に溶解して２０ｍｇ／ｍＬの変性アガロース水溶液を調製した。この変性アガロース水溶液７０ｍＬに多孔質ポリマ粒子１０を１ｇの割合で投入し、５５℃で２４時間撹拌することにより、多孔質ポリマ粒子１０に変性アガロースを吸着させ、多孔質ポリマ粒子１０の表面に被覆層を形成した。その後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。

粒子表面及び細孔内部に吸着したアガロースを次のようにして架橋させた。エチレングリコールジグリシジルエーテル０．６４Ｍ及び水酸化ナトリウム０．４Ｍを含む水溶液に、水溶液３５ｍＬに対して粒子１ｇの割合で粒子を投入し、室温で２４時間撹拌した。その後、加熱した２質量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で洗浄して分離材を得た。

分離材を含む水懸濁液をろ過して得られた分離材（乾燥質量２０ｇ）を５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬに投入し、室温で１時間放置した。別途、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の所定量（６０ｇ）に水を添加し、２００ｇとした。その水溶液を添加後、温度を７０℃まで上げ、撹拌しながら２時間反応させた。反応終了後、生成物をろ別して水洗し、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有するＤＥＡＥ変性分離材を得た。

得られたＤＥＡＥ変性分離材の細孔容積（空隙率）、細孔径（モード径）及び比表面積を水銀圧入法にて測定した。また、微小圧縮試験機（Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、室温（２５℃）にて荷重負荷速度１ｍＮ／秒で四角柱の平滑な端面（５０μｍ×５０μｍ）により分離材を５０ｍＮまで圧縮し、ＤＥＡＥ変性分離材の圧縮変形率、湿潤状態及び乾燥状態の圧縮回復率、並びに、圧縮回復率比を測定した。結果を表４に示す。

また、ＤＥＡＥ変性分離材を乾燥後、熱重量分析により被覆された水酸基を有する水溶性高分子の量を定量した。具体的には、熱重量分析により、変性アガロース及び多孔質ポリマ粒子の重量減少を測定し、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たりの変性アガロース量を算出した。

（カラム特性評価）
ＤＥＡＥ変性分離材をφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムにスラリー（溶媒：メタノール）濃度３０質量％にて１５分かけて充填した。その後、流速を変えて水をカラムに流し、流速とカラム圧との関係を測定し、カラム圧０．３ＭＰａ時の線流速（カラム流速）を測定した。結果を表５に示す。

また、動的吸着量を以下のようにして測定した。２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに１０カラム容量流した。その後、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を８００ｃｍ／ｈで流し、ＵＶによりカラム出口でのＢＳＡ濃度を測定した。カラム入口と出口でのＢＳＡ濃度が一致するまで上記緩衝液を流し、５カラム容量分の１ＭのＮａＣｌのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈した。１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（動的結合容量）は、以下の式を用いて算出した。
ｑ_１０＝ｃ_ｆＦ（ｔ_１０−ｔ_０）／Ｖ_Ｂ
ｑ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ ｗｅｔ ｒｅｓｉｎ）
ｃ_ｆ：注入しているＢＳＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｖ_Ｂ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間（ｍｉｎ）
ｔ_０：ＢＳＡ注入開始時間（ｍｉｎ）

動的吸着量は、５０ｍｇ／粒子ｍＬ以上であれば「Ａ」と評価し、２０ｍｇ／粒子ｍＬより大きく５０ｍｇ／粒子ｍＬ未満であれば「Ｂ」と評価し、２０ｍｇ／粒子ｍＬ以下であれば「Ｃ」と評価した。結果を表５に示す。なお、単位「ｍｇ／粒子ｍＬ」は、粒子体積１ｍＬあたりの吸着量をｍｇ単位で表したものである。

タンパク質分離能について、以下のとおり測定した。トランスフェリン（ＴＲＡ）を１５．２ｍｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を２６．４ｍｇ秤量した。これに０．０５ＭのＴｒｉｓ溶離液（ｐＨ８）を全質量が１ｇとなるまで加え、ＴＲＡ及びＢＳＡをそれぞれ１．５２質量％及び２．６３質量％含むＴｒｉｓ溶液Ａを調製した。上記で得られたＤＥＡＥ変性分離材を充填したカラムをＧＰＣ測定装置に接続し、開始溶離液として０．０５ＭのＴｒｉｓ溶離液（ｐＨ８）を１ｍＬ／ｍｉｎの流速で１５分間送液した後、調製したＴｒｉｓ溶液Ａをマイクロシリンジで２０μＬ投入した。その後、１０分間０．０５ＭのＴｒｉｓ溶離液（ｐＨ８）を送液し、次いで、１ＭのＮａＣｌ溶液を用いて塩濃度グラジエント溶出を行った。溶出液の吸光度を測定し、以下の式を用いて分離度を算出した。
Ｒ＝１．１８×（Ｔ_Ｒ２−Ｔ_Ｒ１）／（Ｗ_{（１／２）１}＋Ｗ_{（１／２）２}）
Ｒ：分離度
Ｔ_Ｒ１、Ｔ_Ｒ２：２成分の保持時間（Ｔ_Ｒ１＜Ｔ_Ｒ２）
Ｗ_{（１／２）１}、Ｗ_{（１／２）２}：それぞれのピークの半値幅

分離度Ｒが１．１５以上であれば「Ｓ」と評価し、１より大きく１．１５未満であれば「Ａ」と評価し、１以下であれば「Ｂ」と評価した。結果を表５に示す。

＜実施例７＞
多孔質化剤としてヘキサノール１８ｇ及びトルエン１４ｇを使用した以外は多孔質ポリマ粒子１０の合成と同様の方法で、多孔質ポリマ粒子１１を合成し、平均粒径及び粒径Ｃ．Ｖ．を測定した。また、多孔質ポリマ粒子１１を使用した以外は実施例６と同様にＤＥＡＥ変性分離材の作製及び評価を行い、実施例７とした。結果を表３〜５に示す。

＜実施例８＞
多孔質化剤としてヘキサノール２０ｇ及びトルエン１５ｇを使用した以外は多孔質ポリマ粒子１０の合成と同様の方法で、多孔質ポリマ粒子１２を合成し、平均粒径及び粒径Ｃ．Ｖ．を測定した。また、多孔質ポリマ粒子１２を使用した以外は実施例６と同様にＤＥＡＥ変性分離材の作製及び評価を行い、実施例８とした。結果を表３〜５に示す。

＜実施例９＞
多孔質化剤としてヘキサノール２５ｇ及びトルエン１０ｇを使用した以外は多孔質ポリマ粒子１０の合成と同様の方法で、多孔質ポリマ粒子１３を合成し、平均粒径及び粒径Ｃ．Ｖ．を測定した。また、多孔質ポリマ粒子１３を使用した以外は実施例６と同様にＤＥＡＥ変性分離材の作製及び評価を行い、実施例９とした。結果を表３〜５に示す。

＜実施例１０＞
マイクロプロセスサーバー乳化条件を変更し、粒径を調整した以外は多孔質ポリマ粒子１０の合成と同様の方法で、多孔質ポリマ粒子１４を合成し、平均粒径及び粒径Ｃ．Ｖ．を測定した。また、多孔質ポリマ粒子１４を使用した以外は実施例６と同様にＤＥＡＥ変性分離材の作製及び評価を行い、実施例１０とした。結果を表３〜５に示す。

＜比較例５＞
モノマとしてジビニルベンゼン４ｇ及びグリシジルメタクリレート１２ｇを使用した以外は多孔質ポリマ粒子１０の合成と同様の方法で、多孔質ポリマ粒子１５を合成し、平均粒径及び粒径Ｃ．Ｖ．を測定した。得られた多孔質ポリマ粒子１５を水及びアセトンにより洗浄を行った。乾燥後、５ｇの多孔質ポリマ粒子１５を５０ｖｏｌ％のジエチルアミン水溶液に３０℃で２４時間浸漬し、グリシジル基をＤＥＡＥ変性させた。その後、ＤＥＡＥ変性させた多孔質ポリマ粒子１５を５０ｖｏｌ％のエタノールアミン／メタノール溶液に３０℃で２４時間浸漬し、残存グリシジル基をブロッキングした。得られた粒子を洗浄した後、実施例６と同様に評価を行い、比較例５とした。結果を表３〜５に示す。

＜比較例６＞
市販されているアガロース粒子（ＣａｐｔｏＤＥＡＥ、ＧＥヘルスケア製）を多孔質ポリマ粒子１６として用いて実施例６と同様に評価を行い、比較例６とした。

＜比較例７＞
濃度１６０ｍｇ／ｍＬのデキストラン水溶液２ｍＬに多孔質ポリマ粒子１５を１ｇの割合で投入し、２５℃で１５時間撹拌することによって、デキストランを多孔質ポリマ粒子１５に含浸させた。ろ過を行った後、デキストランを含浸した多孔質ポリマ粒子１５を、１質量％エチルセルローストルエン溶液１Ｌに加えて撹拌し、分散及び懸濁させた。得られた懸濁液中に、エピクロロヒドリン５ｍＬを加えて５０℃に昇温し、この温度で６時間撹拌して、多孔質ポリマ粒子１５の細孔内に含浸されているデキストランを架橋反応させた。反応終了後、懸濁液をろ過して生成ゲル状物を分離し、トルエン、エタノール、蒸留水で順次洗浄することによって、分離材を得た。分離材について、実施例６と同様の評価を行った。結果を表４及び５に示す。

［試験例３］
＜実施例１１＞
（多孔質ポリマ粒子１７の合成）
５００ｍＬの三口フラスコに、モノマとして純度９６質量％のジビニルベンゼン（ＤＶＢ９６０、新日鉄住金化学株式会社）１６ｇ、多孔質化剤としてヘキサノール１６ｇ及びジエチルベンゼン１６ｇ、並びに、開始剤として過酸化ベンゾイル０．６４ｇを、分散安定剤であるポリビニルアルコール水溶液（０．５質量％）に加えた。次いで、マイクロプロセスサーバーを使用してこのポリビニルアルコール水溶液を乳化した。得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約８時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子を得た。得られた多孔質ポリマ粒子の平均粒径をフロー型粒径測定装置（ＦＰＩＡ−３０００、シスメックス株式会社製）で測定し、平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を算出した。平均粒径は８９μｍであり、粒径のＣ．Ｖ．値は１０％であった。また、得られた多孔質ポリマ粒子の空隙率、細孔径（モード径）及び比表面積を水銀圧入法にて測定した。結果を表６に示す。

（被覆層の形成：水酸基を有する水溶性高分子によるコーティング）
アガロース水溶液（２質量％）１００ｍＬに、水酸化ナトリウム４ｇと、グリシジルフェニルエーテル０．１４ｇとを加え、７０℃で１２時間反応させることにより、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで沈殿させ、洗浄した。

得られた変性アガロースを再度水に溶解して２０ｍｇ／ｍＬの変性アガロース水溶液を調製した。この変性アガロース水溶液７０ｍＬに多孔質ポリマ粒子を１ｇの割合で投入し、５５℃で２４時間撹拌することにより、多孔質ポリマ粒子に変性アガロースを吸着させ、多孔質ポリマ粒子の表面に被覆層を形成した。その後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。多孔質ポリマ粒子へのアガロースの吸着量は、ろ液中の変性アガロースの濃度から算出した。結果を表７に示す。

（吸着した水酸基を有する高分子の架橋）
粒子表面及び細孔内部に吸着したアガロースを次のようにして架橋させた。エチレングリコールジグリシジルエーテル０．６４Ｍ及び水酸化ナトリウム０．４Ｍを含む水溶液に、水溶液３５ｍＬに対して粒子１ｇの割合で粒子を投入し、室温で１０時間撹拌した。その後、加熱した２質量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で洗浄して分離材を得た。

（アミノ基の導入）
分離材を含む分散液（水懸濁液）について、遠心分離を行って水を除去した。得られた分離材（乾燥質量２０ｇ）を、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩を所定量（３０ｇ）溶解させた水溶液１００ｍＬに分散させ、７０℃で１０分間撹拌した。その後、分離材が分散した当該水溶液に、７０℃に加温した５ＭのＮａＯＨ水溶液１００ｍＬを添加し、撹拌しながら１時間反応させた。反応終了後、生成物をろ別し、水／エタノール（体積比８／２）で２回洗浄し、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有するＤＥＡＥ変性分離材を得た。

（細孔容積、細孔径（モード径）及び比表面積の測定）
ＤＥＡＥ変性分離材の細孔容積（空隙率）、細孔径及び比表面積を水銀圧入法にて測定した。結果を表７に示す。

（イオン交換容量測定）
ＤＥＡＥ変性分離材のイオン交換容量を以下のように測定した。５ｍＬ容量のＤＥＡＥ変性分離材を０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２０ｍＬに１時間浸漬し、室温で撹拌した。その後、溶液のｐＨが７以下となるように水で洗浄を行った。得られた粒子を０．１Ｎ塩酸２０ｍＬに浸漬し、１時間撹拌させた。粒子をろ過後、ろ液の塩酸水溶液を中和滴定することにより粒子の交換容量を測定した。結果を表７に示す。

（圧縮変形弾性率測定）
微小圧縮試験機（Ｆｉｓｈｅｒ製）を用いて、室温（２５℃）にて荷重負荷速度１ｍＮ／秒で四角柱の平滑な端面（５０μｍ×５０μｍ）により湿潤状態及び乾燥状態のＤＥＡＥ変性分離材を０ｍＮから５０ｍＮまで圧縮し、ＤＥＡＥ変性分離材の５％圧縮変形弾性率と５％圧縮変形弾性率比とを測定した。結果を表８に示す。

（カラム特性評価）
ＤＥＡＥ変性分離材をφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムにスラリー（溶媒：メタノール）濃度３０質量％にて１５分かけて充填した。その後、流速を変えて水をカラムに流し、流速とカラム圧との関係を測定し、カラム圧０．３ＭＰａ時の線流速（カラム流速）を測定した。結果を表７に示す。

また、タンパク質の動的吸着量を以下のようにして測定した。２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに１０カラム容量流した。その後、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を８００ｃｍ／ｈで流し、ＵＶによりカラム出口でのＢＳＡ濃度を測定した。カラム入口と出口でのＢＳＡ濃度が一致するまで上記緩衝液を流し、５カラム容量分の１ＭのＮａＣｌのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈した。１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（動的結合容量）は、以下の式を用いて算出した。
ｑ_１０＝ｃ_ｆＦ（ｔ_１０−ｔ_０）／Ｖ_Ｂ
ｑ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ ｗｅｔ ｒｅｓｉｎ）
ｃｆ：注入しているＢＳＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｖ_Ｂ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間（ｍｉｎ）
ｔ_０：ＢＳＡ注入開始時間（ｍｉｎ）

動的吸着量は、５０ｍｇ／粒子ｍＬ以上であれば「Ａ」と評価し、５０ｍｇ／粒子ｍＬ未満であり２０ｍｇ／粒子ｍＬより大きければ「Ｂ」と評価し、２０ｍｇ／粒子ｍＬ以下であれば「Ｃ」と評価した。結果を表９に示す。なお、単位「ｍｇ／粒子ｍＬ」は、充填された分離材１ｍＬ当たりのタンパク質の動的吸着量（ｍｇ）を意味する。

（タンパク質の非特異吸着量評価）
ＤＥＡＥ変性分離材０．２ｇをＢＳＡ濃度２４ｍｇ／ｍＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍＬに投入し、２４時間室温で撹拌を行った。その後、遠心分離で上澄みをとった後、分光光度計でろ液のＢＳＡ濃度を測定した。この測定値から分離材に吸着したＢＳＡ量を算出した。ＢＳＡの濃度は、分光光度計により２８０ｎｍの吸光度から確認した。非特異吸着量は、１ｍｇ／粒子ｍＬ以下であれば「Ａ」と評価し、１ｍｇ／粒子ｍＬより大きく１０ｍｇ／粒子ｍＬ未満であれば「Ｂ」と評価し、１０ｍｇ／粒子ｍＬ以上であれば「Ｃ」と評価した。結果を表９に示す。

（耐アルカリ性評価）
ＤＥＡＥ変性分離材を０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で２４時間撹拌し、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液で洗浄後、カラム特性評価と同様の条件にてカラムに充填した。ＢＳＡの１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ動的吸着量を測定し、アルカリ処理前の動的吸着量と比較した。動的吸着量の減少が３％以下であれば「Ａ」と評価し、３％より大きく２０％未満であれば「Ｂ」と評価し、２０％以上であれば「Ｃ」と評価した。結果を表９に示す。

（耐久性評価）
カラム特性評価と同様の条件にてカラムに充填した。８００ｃｍ／ｈの流速で水をカラムに流し、カラム圧を測定後、３０００ｃｍ／ｈに流速を上昇させ、１時間通液させた。再度８００ｃｍ／ｈにカラム圧を下げた際に、カラム圧が初期値（３０００ｃｍ／ｈに流速を上げる前）より１０％以上上昇した場合を「Ｂ」、カラム圧の上昇量が１０％未満である場合を「Ａ」とした。結果を表９に示す。

（実施例１２）
アガロースの架橋においてエチレングリコールジグリシジルエーテルの濃度を０．３２Ｍに変更した以外は実施例１１と同様にしてＤＥＡＥ変性分離材の作製及び評価を行った。

（実施例１３）
アガロースの架橋においてエチレングリコールジグリシジルエーテルの濃度を１．２８Ｍに変更した以外は実施例１１と同様にしてＤＥＡＥ変性分離材の作製及び評価を行った。

（比較例８）
被覆層の形成においてアガロース水溶液の濃度を０．５質量％に変更した以外は、実施例１１と同様にしてＤＥＡＥ変性分離材の作製及び評価を行った。

（比較例９）
アガロースの架橋においてエチレングリコールジグリシジルエーテルの濃度を６．４Ｍに変更した以外は実施例１１と同様にしてＤＥＡＥ変性分離材の作製及び評価を行った。

表８及び９の結果から分かるとおり、湿潤状態における分離材の５％圧縮変形弾性率が１００ＭＰａ以上であり、かつ、５％圧縮変形弾性率比が１．８５以上であることで、非特異吸着を低減することができると共に動的吸着量のカラム特性に優れることが判明した。

１…カラム、２…分離材、１０…分離用カラム。

Claims (18)

1. モノマ単位としてスチレン系モノマを含む多孔質ポリマ粒子と、
   該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層と、を備える分離材であって、
   前記多孔質ポリマ粒子が、モノマ単位として、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含み、
   前記分離材は、５％圧縮変形弾性率が１００〜１０００ＭＰａであり、かつ細孔径分布におけるモード径が０．１〜０．５μｍであり、前記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり１６０〜５００ｍｇの前記被覆層を備える分離材。
2. 吸湿度が１〜３０質量％である、請求項１に記載の分離材。
3. 多孔質ポリマ粒子と、
   該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える分離材であって、
   前記多孔質ポリマ粒子が、モノマ単位として、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含み、
   前記被覆層が、水酸基を有する高分子を含み、
   湿潤状態において前記分離材を５０ｍＮで圧縮した際の圧縮変形率が粒径の３０％未満であり、
   前記分離材を５０ｍＮで圧縮した際における乾燥状態の圧縮回復率に対する湿潤状態の圧縮回復率の比が０．８以上である、分離材。
4. 多孔質ポリマ粒子と、
   該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える分離材であって、
   前記多孔質ポリマ粒子が、モノマ単位として、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含み、
   前記被覆層が、水酸基を有する高分子を含み、
   湿潤状態における前記分離材の５％圧縮変形弾性率が１００ＭＰａ以上であり、
   前記分離材の湿潤状態の５％圧縮変形弾性率に対する乾燥状態の５％圧縮変形弾性率の比が１．８５以上である、分離材。
5. 前記分離材のイオン交換容量が０．０９ｍｍｏｌ／ｍｌ以上である、請求項４に記載の分離材。
6. 細孔径分布におけるモード径が０．０５〜０．５μｍである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の分離材。
7. 前記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜５００ｍｇの前記被覆層を備える、請求項３〜６のいずれか一項に記載の分離材。
8. 前記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜５００μｍである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分離材。
9. 前記多孔質ポリマ粒子における粒径の変動係数が３〜１５％である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離材。
10. 前記分離材の平均粒径が１０〜５００μｍである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離材。
11. 前記分離材の細孔容積が３０体積％以上である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分離材。
12. 前記多孔質ポリマ粒子の比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分離材。
13. 前記分離材の比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の分離材。
14. 前記水酸基を有する高分子が多糖類又はその変性体である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の分離材。
15. 前記水酸基を有する高分子がアガロース又はその変性体である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の分離材。
16. 前記水酸基を有する高分子が架橋されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の分離材。
17. カラムに充填した場合、カラム圧が０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の分離材。
18. カラムと、該カラムに充填された請求項１〜１７のいずれか一項に記載の分離材とを備える、分離用カラム。

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