JP6977437B2 - 分離材の製造方法 - Google Patents
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Description
[1](メタ)アクリルアミド化合物に由来するモノマ単位を含有するポリマ鎖を有する温度応答性の変性多糖類を準備する工程と、上記準備する工程後に、スチレン系モノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を、上記変性多糖類で被覆する工程とを含む、分離材の製造方法。
[2]上記ポリマ鎖が、水酸基を有するモノマ単位を0.1〜50モル%含む、[1]に記載の製造方法。
[3]上記ポリマ鎖が、フェニル基を有するモノマ単位を0.1〜5モル%含む、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4]得られる分離材の比表面積が30m2/g以上である、[1]〜[3]のいずれかに記載の製造方法。
[5]上記分離材の粒径の変動係数が5〜15%である、[1]〜[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6]上記変性多糖類が、デキストラン、アガロース及びプルランからなる群から選ばれる少なくとも1種の多糖類に由来する、[1]〜[5]のいずれかに記載の製造方法。
[7]得られる分離材において、上記変性多糖類の被覆量が、多孔質ポリマ粒子1g当たり30〜400mgである、[1]〜[6]のいずれかに記載の製造方法。
[8]上記変性多糖類を架橋する工程を更に含む、[1]〜[7]のいずれかに記載の製造方法。
[9]得られる分離材の細孔径分布におけるモード径が0.05〜0.5μmである、[1]〜[8]のいずれかに記載の製造方法。
[10]得られる分離材をカラムに充填して該カラム内の圧力が0.3MPaとなるように水を通液させたときに、水の通液速度が800cm/h以上である、[1]〜[9]のいずれかに記載の製造方法。
[11]上記変性多糖類に陽イオン交換基又は陰イオン交換基を導入する工程を更に含む、[1]〜[10]のいずれかに記載の製造方法。
本実施形態に係る分離材の製造方法は、(メタ)アクリルアミド化合物に由来するモノマ単位を含有するポリマ鎖を有する温度応答性の変性多糖類を準備する工程と、上記準備する工程後に、スチレン系モノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を、上記変性多糖類で被覆する工程とを含む。
本実施形態に係る分離材の製造方法に用いられる多孔質ポリマ粒子は、1種以上のモノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む多孔質粒子である。本実施形態における多孔質ポリマ粒子は、スチレン系モノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む。モノマは、スチレン系モノマ以外のモノマを含んでいてもよい。多孔質ポリマ粒子は、例えば、多孔質化剤を含むモノマを重合させて得られる。多孔質ポリマ粒子は、例えば、従来の懸濁重合等により合成することができる。
1)粒子を、超音波分散装置を使用して水(界面活性剤等の分散剤を含む)に分散させ、1質量%の粒子を含む分散液を調製する。
2)粒度分布計(シスメックスフロー、シスメックス株式会社製)を用いて、上記分散液中の粒子約1万個の画像により平均粒径及び粒径のC.V.(変動係数)を測定する。
本実施形態に係る分離材の製造方法では、まず、(メタ)アクリルアミド化合物に由来するモノマ単位を含有するポリマ鎖を有する温度応答性の変性多糖類を準備する。その後、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部に、上記変性多糖類を被覆する。(メタ)アクリルアミド化合物に由来するモノマ単位を含有する温度応答性を有するポリマ鎖を多糖類に導入することにより、多糖類に温度応答性を付与することができる。上記変性多糖類は、温度応答性を有するため、当該変性多糖類に疎水性基導入等の更なる処理をしなくても、疎水性である多孔質ポリマ粒子の表面に吸着させやすい。変性多糖類は、0〜80℃で応答性を有することが好ましく、20〜60℃で応答性を有することがより好ましい。
温度応答性を有する変性多糖類による、多孔質ポリマ粒子の表面の被覆は、例えば、多孔質ポリマ粒子の表面に上記変性多糖類の溶液を吸着させることにより行うことができる。吸着後、未吸着分の変性多糖類を除去した後、吸着した変性多糖類を架橋剤により架橋反応させて固定化してもよい。具体的には、例えば以下の方法により被覆を行うことができる。
得られた分離材は、イオン交換基、リガンド(プロテインA)等を、粒子表面の水酸基等を介して導入することにより、イオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。本実施形態に係る分離材の製造方法は、変性多糖類に、陽イオン交換基又は陰イオン交換基を導入する工程を含んでいてもよい。イオン交換基(イオン交換用官能基)は、陰イオン交換基又は陽イオン交換基であってよい。イオン交換基を導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
500mLの三口フラスコに、モノマとして純度96%のジビニルベンゼン(DVB960、新日鉄住金化学株式会社)12g、多孔質化剤としてジエチルベンゼン12g及びヘキサノール12g、重合開始剤として過酸化ベンゾイル0.64gを加えたものを、分散相として用意した。ポリビニルアルコール(0.5質量%)水溶液を連続相として用意した。上記分散相及び連続相をマイクロプロセスサーバーにより乳化した後、得られた乳化液をフラスコに移し、80℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約8時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄し、多孔質ポリマ粒子1を得た。
多孔質化剤としてのジエチルベンゼンの量を8gに、ヘキサノールの量を16gに変更した以外は多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子2を合成した。
多孔質化剤としてのジエチルベンゼンの量を4gに、ヘキサノールの量を20gに変更した以外は多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子3を合成した。
市販のアガロース粒子(Capto DEAE、GEヘルスケア)を多孔質ポリマ粒子4として使用した。
デキストラン(分子量(Mw)12万)10gを240mLの水に溶解させ、過硫酸カリウム100mg及び硫酸水素ナトリウム60mgを溶液に添加し、30分間窒素によりバブリングした。イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)4680mg、ヒドロキシエチルアクリルアミド(HEAA)250mg、及びフェニルアクリルアミド(PEAA)65mgを含む、160mLのモノマ水溶液を用意した。上記バブリング後の溶液に、上記モノマ水溶液を添加し、30℃で9時間重合させた。重合後、透析及び凍結乾燥を行い、グラフト多糖類1を得た。
モノマ水溶液の配合を、イソプロピルアクリルアミド4429mg、ヒドロキシエチルアクリルアミド506mg、及びフェニルアクリルアミド65mgに変更した以外はグラフト多糖類1の合成と同様にして、グラフト多糖類2を合成した。
モノマ水溶液の配合を、イソプロピルアクリルアミド3925mg、ヒドロキシエチルアクリルアミド1011mg、及びフェニルアクリルアミド65mgに変更した以外はグラフト多糖類1の合成と同様にして、グラフト多糖類3を合成した。
モノマ水溶液の配合を、ヒドロキシエチルアクリルアミド4926mg、及びフェニルアクリルアミド65mgに変更した以外はグラフト多糖類1の合成と同様にして、グラフト多糖類4を合成した。
(グラフト多糖類によるコーティング)
グラフト多糖類1を20mg/mLの濃度で含む水溶液を用意した。当該水溶液700mLに対して多孔質ポリマ粒子1を10gの割合で投入し、グラフト多糖類1が水中で凝集しないよう、グラフト多糖類1がLCSTを示す温度付近で24時間攪拌し、多孔質ポリマ粒子1にグラフト多糖類1を吸着させた。吸着後、粒子をろ過し、熱水で洗浄した。多孔質ポリマ粒子1へのグラフト多糖類1の吸着量は、ろ液の吸光度から算出した。
多孔質ポリマ粒子1g当たりの被覆量(mg)は、示差熱熱重量測定装置(TG−DTA)を用いて測定される、粒子の5%重量減少温度におけるTGから算出した。測定は、40℃で30分保持した後、40〜500℃の温度範囲で行い、昇温速度は10℃/minとした。被覆量は下記式より算出した。結果を表2に示す。
被覆量(mg/粒子g)=R/(100−R)×1000
R(%)=95%−T
R(%):分離材に対する被覆量の割合
T(%):多孔質ポリマ粒子の5%重量減少温度における分離材のTG
得られた分離材0.5gを、BSA(Bovine Serum Albumin)濃度12mg/mLのTris−HCl緩衝液(pH8.0)50mLに投入し、24時間20℃で攪拌を行った。その後、遠心分離で上澄みをとり、分光光度計で上澄み液の280nmでの吸光度を測定し、上澄み液中のBSA濃度を求めた。上澄み液のインスリン濃度から、分離材1mL当たりのBSA吸着量(非特異吸着量)を算出した。
分離材を含む分散液をろ過して水を除去し、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩を所定量溶解させた水溶液100mLに、当該分離材20gを分散させ、70℃で10分間攪拌した。そこへ、70℃に加温したNaOH水溶液5M100mLを添加し、1時間反応させた。反応終了後、ろ過し、水/エタノール(体積比8/2)で2回洗浄し、ジエチルアミノエチル(DEAE)基をイオン交換基として有する、実施例1の分離材(DEAE変性分離材)を得た。得られたDEAE分離材の細孔径分布におけるモード径及び比表面積を水銀圧入法にて測定した。また、DEAE分離材の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径及び粒径のC.V.値を算出した。結果を表2に示す。
DEAE変性分離材を1MのNaOH水溶液と混合し、濃度30質量%のスラリーを調製した。φ5.0×200mmのガラス製カラムに、当該スラリーを15分かけて充填した。
動的吸着容量は以下のようにして測定した。DEAE変性分離材を充填したカラムに、40mmol/L Tris−塩酸緩衝液(pH8.0)を10カラム容量流した。その後BSA濃度0.5mg/mLの40mmol/LのTris−塩酸緩衝液をカラムに流し、UV吸光度測定によりカラム出口でのBSA濃度を測定した。カラム入口及び出口のBSA濃度が一致するまで液を流し、その後、5カラム容量分の1M NaCl Tris−塩酸緩衝液で希釈した。10% breakthroughにおける動的吸着容量は以下の式を用いて算出した。通液速度は800cm/hとした。結果を表2に示す。
q10=cfF(t10−t0)/VB
q10:10%breakthroughにおける動的吸着容量(mg/mL wet resin)
cf:注入しているBSA濃度
F:流速(mL/min)
VB:ベッド体積(mL)
t10:10%breakthroughにおける時間
t0:BSA注入開始時間
グラフト多糖類1の代わりにグラフト多糖類2を使用した以外は実施例1と同様にして分離材を作製し、実施例2として評価した。
グラフト多糖類1の代わりにグラフト多糖類3を使用した以外は実施例1と同様にして分離材を作製し、実施例3として評価した。
多孔質ポリマ粒子1の代わりに多孔質ポリマ粒子2を使用し、グラフト多糖類1の代わりにグラフト多糖類2を使用した以外は、実施例1と同様にして分離材を作製し、実施例4として評価した。
多孔質ポリマ粒子1の代わりに多孔質ポリマ粒子3を使用し、グラフト多糖類1の代わりにグラフト多糖類2を使用した以外は、実施例1と同様にして分離材を作製し、実施例2として評価した。
多孔質ポリマ粒子1の代わりに多孔質ポリマ粒子3を使用し、グラフト多糖類1の代わりにデキストラン(Mw12万)をそのまま使用した以外は、実施例1と同様にして分離材を作製し、比較例1として評価した。
多孔質ポリマ粒子1の代わりに多孔質ポリマ粒子1を使用し、グラフト多糖類1の代わりにグラフト多糖類4を使用した以外は、実施例1と同様にして分離材を作製し、比較例2として評価した。
多孔質ポリマ粒子4をそのまま使用し、比較例3として評価した。
デキストラン(分子量Mw12万)水溶液(2質量%)100mLに、水酸化ナトリウム4g、及びグリシジルフェニルエーテル0.4gを添加して、70℃で12時間反応させることにより、デキストランにフェニル基を導入した。得られた変性デキストランをイソプロピルアルコールで3回再沈殿させ、洗浄し、疎水化デキストランを得た。
20mg/mLの疎水化デキストラン水溶液700mLに多孔質ポリマ粒子1を10gの濃度で投入し、55℃で24時間攪拌させ、多孔質ポリマ粒子1に吸着させた。吸着後、粒子をろ過し、熱水で洗浄した。粒子への疎水化デキストランの吸着量はろ液中の疎水化デキストランの濃度から算出した。その後、実施例1と同様に架橋、イオン交換基導入の処理を行い、比較例4として評価した。
Claims (11)
- (メタ)アクリルアミド化合物に由来するモノマ単位を含有するポリマ鎖を有する温度応答性の変性多糖類を準備する工程と、
前記準備する工程後に、スチレン系モノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を、前記変性多糖類で被覆する工程とを含み、
前記被覆する工程で、前記変性多糖類を含む溶液中に前記多孔質ポリマ粒子を分散させ、前記多孔質ポリマ粒子の表面に前記変性多糖類を吸着させる、分離材の製造方法。 - 前記ポリマ鎖が、水酸基を有するモノマ単位を0.1〜50モル%含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記ポリマ鎖が、フェニル基を有するモノマ単位を0.1〜5モル%含む、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 得られる分離材の比表面積が30m2/g以上である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 得られる分離材の粒径の変動係数が5〜15%である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記変性多糖類が、デキストラン、アガロース及びプルランからなる群から選ばれる少なくとも1種の多糖類に由来する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 得られる分離材において、前記変性多糖類の被覆量が、多孔質ポリマ粒子1g当たり30〜400mgである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記変性多糖類を架橋する工程を更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の製造方法。
- 得られる分離材のモード径が0.05〜0.5μmである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の製造方法。
- 得られる分離材をカラムに充填して該カラム内の圧力が0.3MPaとなるように水を通液させたときに、水の通液速度が800cm/h以上である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記変性多糖類に陽イオン交換基又は陰イオン交換基を導入する工程を更に含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の製造方法。
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