JP6939021B2 - 分離材及びカラム - Google Patents
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[1]多孔質ポリマー粒子と、該多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備え、被覆層が、水酸基を有する架橋高分子を含み、該架橋高分子に親水性モノマーがグラフトされている分離材。
[2]親水性モノマーが水酸基を有する(メタ)アクリレート化合物である、[1]記載の分離材。
[3]多孔質ポリマー粒子がスチレン系モノマーに由来する構造単位を有するポリマーを含む、[1]又は[2]に記載の分離材。
[4]水酸基を有する架橋高分子が、多糖類又はその変性体由来の架橋高分子である、[1]〜[3]のいずれかに記載の分離材。
[5]水酸基を有する架橋高分子が、アガロース、デキストラン又はプルラン由来の架橋高分子である、[1]〜[4]のいずれかに記載の分離材。
[6]平均粒径が10〜300μmであり、モード細孔径が0.05〜0.6μmである、[1]〜[5]のいずれかに記載の分離材。
[7]空隙率が40〜70体積%である、[1]〜[6]のいずれかに記載の分離材。
[8]比表面積が20m2/g以上である、[1]〜[7]のいずれかに記載の分離材。
[9]変動係数が5〜15%である、[1]〜[8]のいずれかに記載の分離材。
[10]多孔質ポリマー粒子の1g当たり30〜500mgの水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層を備える、[1]〜[9]のいずれかに記載の分離材。
[11]分離材が充填されたカラムに、該カラムの圧力が0.3MPaとなるように水を通液させたときに、水の通液速度が800cm/h以上である、[1]〜[10]のいずれかに記載の分離材。
[12][1]〜[11]のいずれかに記載の分離材を備えるカラム。
[13][1]〜[11]のいずれかに記載の分離材の製造方法であって、多孔質ポリマー粒子の表面に水酸基を有する高分子を吸着させ、当該高分子を架橋する工程と、架橋された高分子に、原子移動ラジカル重合の開始基を導入する工程と、開始基に対して親水性モノマーをグラフトさせる工程と、を備える方法。
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマー粒子と、該多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備え、被覆層は、水酸基を有する架橋高分子を含み、該架橋高分子に親水性モノマーがグラフトされている。なお、本明細書中、「多孔質ポリマー粒子の表面」とは、多孔質ポリマー粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマー粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中(メタ)アクリル酸とは、アクリル酸又はメタクリル酸を意味し、(メタ)アクリレート等の類似の表現においても同様である。
本実施形態に係る多孔質ポリマー粒子は、多孔化剤含むモノマーを硬化させた粒子であり、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等により合成することができる。モノマーとしては、特に限定されないが、例えば、スチレン系モノマーを使用することができる。すなわち、多孔質ポリマー粒子は、スチレン系モノマーに由来する構造単位を有するポリマーを含むことができる。具体的なモノマーとしては、以下のような多官能性モノマー、単官能性モノマー等が挙げられる。
1)粒子を、超音波分散装置を使用して水(界面活性剤等の分散剤を含む)に分散させ、1質量%の多孔質ポリマー粒子を含む分散液を調製する。
2)粒度分布計(シスメックスフロー、シスメックス株式会社製)を用いて、上記分散液中の粒子約1万個の画像により平均粒径及び粒径のC.V.を測定する。
本実施形態に係る被覆層は、水酸基を有する架橋高分子を含む。水酸基を有する架橋高分子には、親水性モノマーがグラフトされている。すなわち、被覆層は、架橋高分子に結合した親水性モノマーに基づくグラフト鎖を有している。水酸基を有する架橋高分子で多孔質ポリマー粒子を被覆することによりカラム圧の上昇を抑制することができると共に、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量を、天然高分子を用いた場合と同等又はそれ以上とすることが可能となる。また、親水性モノマーに基づくグラフト鎖を有することで、粒子の親水性を保ったまま被覆材に高い運動性を付与することが可能となる。
水酸基を有する架橋高分子は、1分子中に2個以上の水酸基を有することが好ましく、親水性高分子であることがより好ましい。水酸基を有する架橋高分子は、水酸基を有する高分子を架橋したものである。水酸基を有する高分子としては、例えば、多糖類又はその変性体、及び、ポリビニルアルコール又はその変性体高分子が挙げられる。多糖類としては、例えば、アガロース、デキストラン、プルラン、セルロース及びキトサンが挙げられる。水酸基を有する高分子として、例えば、平均分子量1万以上の高分子を使用できる。水酸基を有する架橋高分子は、多糖類又はその変性体由来の架橋高分子であることが好ましい。水酸基を有する架橋高分子は、アガロース、デキストラン又はプルラン由来の架橋高分子であってもよい。
本実施形態に係る被覆層は、例えば、多孔質ポリマー粒子の表面に水酸基を有する高分子を吸着させた後、当該高分子を架橋して、多孔質ポリマー粒子の表面に水酸基を有する架橋高分子の層を形成し、次いで、当該架橋高分子に、原子移動ラジカル重合の開始基を導入した後、開始基に対して親水性モノマーをグラフトする方法により形成できる。以下、被覆層を形成する方法の具体例について説明する。
次いで、架橋剤を加えて多孔質ポリマー粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成する。このとき、架橋体は、水酸基を有する3次元架橋網目構造を有する。
水酸基を有する架橋高分子により被覆された多孔質ポリマー粒子には、ATRP(原子移動ラジカル重合)の開始基を表面上の水酸基を変換して導入することができる。ATRP開始基の導入により、水酸基に親水性モノマーをグラフトすることが可能となる。ATRP開始基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
次いで、ATRP開始基を導入した粒子に親水性モノマーを反応させる。通常、モノマーの反応は、ATRP開始基に行われるので、粒子をろ過等により水切りした後、有機溶媒中に浸漬し、所定濃度となるようにハロゲン化銅、トリスジメチルアミノエチルアミン、アスコルビン酸及び親水性モノマーを添加して不活性ガス下で反応させる。この反応温度は20〜40℃で、12〜24時間行うことが好ましい。
上記被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド(プロテインA)等を表面上の水酸基等を介して導入することにより、イオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
微小圧縮試験機(Fisher製)を用いて、室温(25℃)条件にて荷重負荷速度1mN/秒で、四角柱の平滑な端面(50μm×50μm)により分離材を50mNまで圧縮したときの荷重及び圧縮変位を測定する。得られた測定値から、分離材が5%圧縮変形したときの圧縮弾性率(5%K値)を下記式により求めることができる。また、上記測定中の変位量が最も大きく変化する点の荷重を破壊強度(mN)とする。
5%K値(MPa)=(3/21/2)・F・S−3/2・R−1/2
5%K値(MPa)=(3/21/2)・F・S−3/2・R−1/2
F:分離材が5%圧縮変形したときの荷重(mN)
S:分離材が5%圧縮変形したときの圧縮変位(mm)
R:分離材の半径(mm)
500mLの三口フラスコに、純度96%のジビニルベンゼン(新日鉄住金化学株式会社製、商品名「DVB960」)16g、ヘキサノール16g、ジエチルベンゼン16g及び過酸化ベンゾイル0.64gを、0.5質量%のポリビニルアルコール水溶液に加え、マイクロプロセスサーバーを使用して乳化後、得られた乳化液をフラスコに移し、80℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約8時間撹拌をした。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄し、多孔質ポリマー粒子を得た。得られた多孔質ポリマー粒子の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径及び粒径のC.V.値(変動係数)を算出した。結果を表1に示す。
2質量%のアガロース水溶液480mLに、水酸化ナトリウム0.98g及びグリシジルフェニルエーテル4.90gを添加し、60℃で6時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで再沈殿させ、洗浄した。変性アガロースの疎水性基含有量を下記方法により算出したところ、14.2%であった。
・疎水性基含有量(%)=(CAG/(CHAG+CAG))×100
・CAG:変性アガロース構成単位の濃度(mmol/L)=A/εGPE×1000
・CHAG:変性されていないアガロース構成単位の濃度(mmol/L)=[変性されてないアガロース構成単位の濃度(g/L)/アガロース構成単位(306g/mol)]×1000
・A:変性アガロースの真の吸光度=変性アガロースの吸光度−変性されていないアガロースの吸収
・εGPE:グリシジルフェニルエーテルの吸光係数=1372(L/(mol・cm))
・変性されてないアガロース構成単位の濃度(g/L)=変性アガロースのサンプル濃度(質量%)×10−変性されているアガロース構成単位の濃度(g/L)
・変性されていないアガロースの吸収=変性されてないアガロースの吸光度×[変性アガロースのサンプル濃度(mmol/L)/変性されてないアガロースのサンプル濃度(mmol/L)]
・変性アガロース成単位の濃度(g/L)=(CAG×変性アガロース構成単位(456g/mol))/1000
<被覆層の形成>
20mg/mLの変性アガロース水溶液に、多孔質ポリマー粒子を70mL/粒子gの濃度で投入し、55℃で24時間攪拌して、多孔質ポリマー粒子に変性アガロースを吸着させた後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。
多孔質ポリマー粒子に吸着した変性アガロースは次のようにして架橋した。変性アガロースが吸着した粒子10gを0.4M水酸化ナトリウム水溶液に分散させ、0.04Mエピクロロヒドリンを添加し、8時間室温にて攪拌した。その後、2質量%のドデシル硫酸ナトリウム水溶液の熱水で洗浄後、純水で洗浄した。得られた粒子を乾燥後、熱重量分析により水酸基を有する架橋高分子の被覆量を測定した。
水酸基を有する架橋高分子で被覆された粒子へのATRP開始基の導入は次のように行った。ドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した粒子2gを、N,N−ジメチルホルムアミド250mLに分散させ、トリエチルアミン1.1gを添加した分散液を氷浴に浸し、2−ブロモブチリルブロミド2.5gを50mLのDMFに溶解させた溶液を添加した。添加後は、24時間室温にて攪拌した後、純水で洗浄を行い、次いでアセトンで洗浄して、ATRP開始基を導入した粒子を得た。
ATRP開始基を導入した粒子2gをメタノール50mLに分散させ、3.1gのアスコルビン酸を添加して溶液aを調製した。また、グリセリンモノメタクリレート(GLM)60g、二臭化銅8mg及びトリスジメチルアミノエチルアミン16mgをメタノール150mLに添加して溶液bを調製した。溶液a及びbに窒素ガスのバブリングを15分間行った後、溶液a及びbを混合して24時間攪拌した。その後、純水で洗浄を行い、親水性モノマーがグラフトされた分離材の水懸濁液を得た。得られた粒子を乾燥後、熱重量分析により親水性モノマーのグラフト量を測定した。
親水性モノマーがグラフトされた粒子0.2gをBSA(Bovine Serum Albumin、Mw66000)濃度24mg/mLのTris−塩酸緩衝液(pH8.0)20mLに投入し、24時間室温で攪拌を行った後、遠心分離で上澄みをとり、分光光度計でろ液のBSA濃度より、粒子に吸着したBSA量を算出した。BSAの濃度は分光光度計により280nmの吸光度から確認した。また、BSAの替わりにインスリン(Mw5800)を使用して同様の評価を行った。非特異吸着量が10mg/mL以下を「○」、10mg/mL超を「×」とした。結果を表3に示す。
上記水懸濁液をろ過して回収した分離材(乾燥質量20g)を5Mの水酸化ナトリウム水溶液200mLに投入し、室温で1時間放置した。別途、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の所定量(60g)を200mL添加し、水溶液の温度を70℃まで上げ、撹拌しながら8時間反応させた。反応終了後、濾過、水/エタノール(体積比5/1)で3回洗浄し、ジエチルアミノエチル(DEAE)基をイオン交換基として有するDEAE変性分離材を得た。得られたDEAE変性分離材のモード細孔径及び比表面積は、水銀圧入法にて測定した。結果を表2に示す。
得られた粒子のイオン交換基容量を以下のように測定した。5mL容量の粒子を0.1N水酸化ナトリウム20mLに1時間浸漬し、室温で攪拌した。その後、溶液のpHが7以下となるように水で洗浄を行った。得られた粒子を0.1N塩酸10mLに浸漬し、1時間攪拌させた。粒子をろ過後、塩酸水溶液を中和滴定することにより粒子のイオン交換基容量を測定した。結果を表3に示す。
得られたDEAE変性分離材の5%圧縮変形弾性率を上述の方法で測定した。結果を表3に示す。
得られたDEAE変性分離材を濃度30質量%のスラリー(溶媒:メタノール)としてφ7.8×300mmのステンレスカラムに15分かけて充填した。その後、カラムに流速を変えながら水を流し、流速とカラム圧との関係を測定し、0.3MPa時の通液速度(線流速)を測定した。結果を表2に示す。
また、動的吸着量は以下のようにして測定した。20mmol/LのTris−塩酸緩衝液(pH8.0)をカラムに10カラム容量流した。その後、BSA濃度2mg/mLの20mmol/LのTris−塩酸緩衝液を流し、UV測定によりカラム出口でのBSA濃度を測定した。カラム入口と出口のBSA濃度が一致するまで液を流し、5カラム容量分の1M NaCl Tris−塩酸緩衝液で希釈した。10%breakthroughにおける動的吸着量を以下の式を用いて算出した。結果を表3に示す。
q10=cfF(t10−t0)/VB
q10:10%breakthroughにおける動的吸着量(mg/mL wet resin)
cf:注入しているBSA濃度
F:流速(mL/min)
VB:ベッド体積(mL)
t10:10%breakthroughにおける時間(min)
t0:BSA注入開始時間(min)
得られたDEAE変性分離材を0.5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で24h攪拌し、Tris−塩酸緩衝液(pH8.0)で洗浄後、カラムに上記条件にて充填した。BSAの10%breakthrough動的吸着量を測定し、アルカリ処理前の動的吸着量と比較した。動的吸着合量の減少が3%未満である場合を「○」、3〜20%を「△」、20%超を「×」とした。結果を表3に示す。
800cm/hの流速で水をカラムに流し、カラム圧を測定後、3000cm/hに流速を上昇させ、1h通液させた。再度800cm/hにカラム圧を下げた際に、カラム圧が初期値(3000cm/hに流速を上げる前)より10%以上上昇した場合を「×」、10%未満である場合を「○」とした。結果を表3に示す。
ATRP開始基を導入する工程で、トリエチルアミン820mg及び2−ブロモブチリルブロミド1.9gを使用した以外は、実施例1と同様の処理を行い、DEAE変性分離材を作製して、実施例1と同様に評価を行った。
ATRP開始基を導入する工程で、トリエチルアミン270mg及び2−ブロモブチリルブロミド0.63gを使用した以外は、実施例1と同様の処理を行い、DEAE変性分離材を作製して、実施例1と同様に評価を行った。
ATRP開始基の導入工程で、トリエチルアミン270mg及び2−ブロモブチリルブロミド0.63gを使用し、親水性モノマーをグラフトする工程で、GLMに替えてヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)を使用した以外は、実施例1と同様の処理を行い、DEAE変性分離材を作製して、実施例1と同様に評価を行った。
ATRP開始基を導入する工程及び親水性モノマーのグラフト工程を行わずにイオン交換基を導入する工程を行った以外は、実施例1と同様の処理を行い、DEAE変性分離材を作製して、実施例1と同様に評価を行った。
親水性モノマーのグラフト工程で、GLMに替えてフェニルメタクリレート(PMA)を使用した以外は、実施例1と同様の処理を行い、DEAE変性分離材を作製して、実施例1と同様に評価を行った。
市販のアガロース粒子(GEヘルスケア社製、商品名「Capto DEAE」)を分離材として使用して、実施例1と同様に評価を行った。
Claims (12)
- 多孔質ポリマー粒子と、前記多孔質ポリマー粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、
前記被覆層が、水酸基を有する架橋高分子を含み、前記架橋高分子に親水性モノマーがグラフトされており、前記親水性モノマーが、水酸基を有する(メタ)アクリレート化合物である、分離材。 - 前記多孔質ポリマー粒子が、スチレン系モノマーに由来する構造単位を有するポリマーを含む、請求項1記載の分離材。
- 前記水酸基を有する架橋高分子が、多糖類又はその変性体由来の架橋高分子である、請求項1又は2に記載の分離材。
- 前記水酸基を有する架橋高分子が、アガロース、デキストラン又はプルラン由来の架橋高分子である、請求項1〜3いずれか一項に記載の分離材。
- 平均粒径が10〜300μmであり、モード細孔径が0.05〜0.6μmである、請求項1〜4いずれか一項に記載の分離材。
- 空隙率が40〜70体積%である、請求項1〜5いずれか一項に記載の分離材。
- 比表面積が20m2/g以上である、請求項1〜6いずれか一項に記載の分離材。
- 粒径の変動係数が5〜15%である、請求項1〜7いずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマー粒子の1g当たり30〜500mgの前記水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層を備える、請求項1〜8いずれか一項に記載の分離材。
- 当該分離材が充填されたカラムに、該カラムの圧力が0.3MPaとなるように水を通液させたときに、水の通液速度が800cm/h以上である、請求項1〜9いずれか一項に記載の分離材。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の分離材を備えるカラム。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の分離材の製造方法であって、
多孔質ポリマー粒子の表面に水酸基を有する高分子を吸着させ、当該高分子を架橋する工程と、
架橋された前記高分子に、原子移動ラジカル重合の開始基を導入する工程と、
前記開始基に対して、親水性モノマーをグラフトさせる工程と、を備える、方法。
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