JP6834131B2 - 分離材及びカラム - Google Patents

Description

本発明は、分離材及びカラムに関する。

従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には合成高分子を母体とする多孔質型粒子、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とする粒子が用いられている。上記の多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体は、塩濃度による体積変化が小さく、カラムに充填しクロマトグラフィーで用いた場合、通液時の耐圧性が良いといった利点を持っている。しかし、このイオン交換体は、タンパク質等の分離に用いた場合、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起き、ピークの非対称化が発生する問題点、又は、該疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できないことがあるといった問題点がある。

一方、デキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とする上記のイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤し、溶液のイオン強度による体積変化、及び、遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も充分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。

親水性天然高分子の架橋ゲルが持つ欠点を克服するため、いわば“骨格”となる剛直な物質と組み合わせる試みがこれまでになされている。

例えば、特許文献１では、多孔性高分子の細孔内に天然高分子ゲル等のゲルを保持した複合体を、ペプチド合成の分野で用いるという記載があり、それにより反応性物質の負荷係数を高め、高収率で合成できることが発明の効果として挙げられている。

しかも、この特許文献１では、硬質な合成高分子物質でゲルを包囲するため、カラムベッドの形態で使用しても、容積変化がなく、カラムを通過するフロースルーの圧力が変化しないという効果が挙げられている。

特許文献２及び３では、セライト等の無機多孔質体にデキストラン、セルロース等の多糖などのキセロゲルを保持させ、このゲルに収着性能を付加するためにジエチルアミノメチル（ＤＥＡＥ）基等を付与したものをヘモグロビンの除去に使用している。その効果として、カラムでの通液性の良さが挙げられている。

特許文献４では、いわゆるマクロネットワーク構造のコポリマの細孔を、モノマから合成した架橋共重合体のゲルで埋めたハイブリッドコポリマのイオン交換体が挙げられている。特許文献４では、架橋共重合体のゲルの架橋度が低い場合、圧力損失、体積変化等の問題があるが、ハイブリッドコポリマにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なくなること、また、イオン交換容量が向上し、リーク挙動が改善されることが記載されている。

特許文献５及び６では、有機合成ポリマ基体の細孔内に、巨大網目構造を有する親水性天然高分子の架橋ゲルを充填した複合化充填材が提案されている。

特許文献７では、メタクリル酸グリシジルとアクリル架橋モノマにより構成される多孔質粒子が合成されている。

米国特許第４９６５２８９号明細書 米国特許第４３３５０１７号明細書 米国特許第４３３６１６１号明細書 米国特許第３９６６４８９号明細書 特開平１−２５４２４７号公報 米国特許第５１１４５７７号明細書 特開２００９−２４４０６７号公報

従来のカラム充填材では、天然高分子の課題である通液性や、ポリマ粒子の課題であるタンパク質吸着量及び非特異吸着を充分なレベルで解決することは難しい。

そこで、本発明は、通液性を確保し、且つ、タンパク質吸着量の向上及び非特異吸着の低減が可能な分離材、並びに、該分離材を用いたカラムを提供することを目的とする。

本発明は、下記［１］〜［１０］に記載の分離材及びカラムを提供する。
［１］多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える分離材であって、前記被覆層が、水酸基を有する高分子を含み、前記分離材が、ＨＬＢ値１〜９の有機溶媒及びＨＬＢ値１〜９の油溶性界面活性剤の少なくとも一方の成分Ａを含有し、アセトニトリルを含む洗浄液に前記分離材を２４時間浸漬する前後において、前記洗浄液における前記成分Ａの含有量の変化量が、前記分離材１ｇ当たり５０００ｐｐｍ以下である、分離材。
［２］前記多孔質ポリマ粒子が、ジビニルベンゼンを５０質量％以上含むモノマを重合することにより得られる重合体を含む、［１］に記載の分離材。
［３］比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上である、［１］又は［２］に記載の分離材。
［４］細孔径分布のモード径が０．０５〜０．６μｍである、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離材。
［５］前記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜３００μｍである、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］前記水酸基を有する高分子が多糖類又はその変性体である、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離材。
［７］前記水酸基を有する高分子がアガロース又はその変性体である、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］前記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜４００ｍｇの前記被覆層を備える、［１］〜［７］のいずれかに記載の分離材。
［９］カラムに充填した場合、カラム圧が０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材を備える、カラム。

本発明によれば、通液性を確保し、且つ、タンパク質吸着量の向上及び非特異吸着の低減が可能な分離材、並びに、該分離材を用いたカラムを提供することができる。

以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、前記被覆層が、水酸基を有する高分子を含む。なお、本明細書中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。例えば、多孔質ポリマ粒子の外側の表面、及び／又は、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面に、水酸基を有する高分子がコーティングされていてもよい。

本実施形態によれば、通液性を確保しつつ、タンパク質吸着量を向上できると共に非特異吸着を低減できる。また、本実施形態によれば、親水性天然高分子を母体とする充填材が有する、タンパク質等の生体高分子の分離に対する優れた分離能を保持しながら、疎水的相互作用による非特異吸着がなく、且つ、静電的相互作用やアフィニティ精製により生体高分子を分離精製するカラム充填材を提供することができる。

（多孔質ポリマ粒子）
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、例えば、モノマを重合することにより得られる重合体を含み、モノマ由来の構造単位を有することができる。多孔質ポリマ粒子は、粒子の全質量基準で５０質量％以上のポリマを含んでいてもよく、ポリマからなる粒子であってもよい。また、多孔質ポリマ粒子は、モノマと多孔質化剤とを含む組成物を重合させた後、多孔質化剤を除去することによって得ることができる。多孔質ポリマ粒子は、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、（メタ）アクリル系モノマ、スチレン系モノマ等のビニルモノマを使用することができる。具体的なモノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。

多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物；（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコール系ジ（メタ）アクリレート；トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルプロパントリアクリレート等の３官能以上の（メタ）アクリレート；エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、プロポキシ化エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、トリシクロデカンジメタノールジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタンジ（メタ）アクリレート、エトキシ化シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート；ジアリルフタレート及びその異性体；トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体が挙げられる。多官能性モノマとしては、新中村化学工業株式会社製のＮＫエステル（Ａ−ＴＭＰＴ−６Ｐ０、Ａ−ＴＭＰＴ−３Ｅ０、Ａ−ＴＭＭ−３ＬＭＮ、Ａ−ＧＬＹシリーズ、Ａ−９３００、ＡＤ−ＴＭＰ、ＡＤ−ＴＭＰ−４ＣＬ、ＡＴＭ−４Ｅ、Ａ−ＤＰＨ等）、新日鉄住金化学株式会社のジビニルベンゼン（ＤＶＢ９６０）などが商業的に入手可能である。多官能性モノマは、１種単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。

上記の中でも、耐久性及び膨潤性に優れる観点から、ジビニルベンゼンを使用することが好ましい。モノマがジビニルベンゼンを含む場合、ジビニルベンゼンの含有量は、耐アルカリ性及び耐圧性に優れる観点から、モノマ全質量基準で、５０質量％以上が好ましく、６０質量％以上がより好ましく、７０質量％以上がさらに好ましい。

単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体；アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２−クロロエチル、アクリル酸フェニル、α−クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ｎ−オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル等の（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、安息香酸ビニル、酪酸ビニル等のビニルエステル；Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニルカルバゾール、Ｎ−ビニルインドール、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビニル化合物；フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、アクリル酸トリフルオロエチル、アクリル酸テトラフルオロプロピル等の含フッ素化モノマ；ブタジエン、イソプレン等の共役ジエンが挙げられる。単官能性モノマは、１種単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。上記の中でも、耐酸性及び耐アルカリ性に優れる観点から、スチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシ基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。

多孔質化剤は、重合時に相分離を促して粒子の多孔質化を促進する添加剤である。多孔質化剤としては、溶媒（有機溶媒等）、油溶性界面活性剤（乳化剤）などが挙げられる。

溶媒としては、アルコール、脂肪酸等が挙げられる。アルコールとしては、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ヘキサノール（例えば１−ヘキサノール）、エチルヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール（例えば２−オクタノール）、デカノール、ドデカノール、イソアミルアルコール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、ジメチルフタレート、ジエチレングリコールモノブチルアルコール、へプチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール等が挙げられる。脂肪酸としては、ブタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、ラウリル酸等が挙げられる。溶媒としては、ＨＬＢ値１〜９の有機溶媒を用いることができる。

油溶性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４（炭素数１６〜２４。以下の「Ｃ」も同様）脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸のソルビタンモノエステル（例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、又は、ヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸のソルビタンジエステル（例えば、ソルビタンジステアレート）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸のプロピレングリコールモノエステル（例えば、プロピレングリコールモノラウレート）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のグリセロールモノエステル（例えば、グリセロールモノオレエート、又は、グリセロールモノステアレート）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル（例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート、又は、ヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及び、これらの混合物が挙げられる。油溶性界面活性剤としては、ＨＬＢ値１〜９の油溶性界面活性剤を用いることができる。

好ましい油溶性界面活性剤としては、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）２０。好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）；ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）８０。好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）；ジグリセロールモノオレエート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）；ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）；ジグリセロールモノミリステート（好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）；ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル；及び、これらの混合物が挙げられる。

多孔質化剤である溶媒は、モノマ全質量基準で、０〜２００質量％の範囲で使用できる。多孔質化剤である油溶性界面活性剤は、モノマ全質量基準で、５〜８０質量％の範囲で使用できる。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成しやすくなる。油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持しやすくなる。

多孔質化剤は、１種単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空隙率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールできる。水を取り込みやすい物質を多孔質化剤として使用した場合、粒子内部に大きな孔が空きやすくなる。また、溶媒として使用する水を多孔質化剤として使用することもできる。水を多孔質化剤として使用する場合、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させることで、水を吸収し、粒子を容易に多孔質化させることができる。

上記のような多孔質化剤は、多孔質ポリマ粒子の合成後、多孔質化剤を溶解可能な溶媒で洗浄して除去する必要がある。特に、ＨＬＢ値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｎｌａｎｃｅ値）１〜９の有機溶媒又はＨＬＢ値１〜９の油溶性界面活性剤が粒子（例えば粒子表面）に過剰量残存していると、非特異吸着が発生しやすくなることから、これらの多孔質化剤をソックスレー等で洗浄して除去することが好ましい。

このような観点から、本実施形態の分離材は、ＨＬＢ値１〜９の有機溶媒及びＨＬＢ値１〜９の油溶性界面活性剤の少なくとも一方の成分Ａを含有し、アセトニトリルを含む洗浄液（例えば、アセトニトリルからなる洗浄液）に前記分離材を２４時間浸漬する前後において、前記洗浄液における前記成分Ａの含有量の変化量が前記分離材１ｇ当たり５０００ｐｐｍ以下である。この場合、非特異吸着の発生を抑制可能であり、通液性を確保しつつ、タンパク質吸着量を向上できると共に非特異吸着を低減できる。変化量が５０００ｐｐｍを超える場合、前記多孔質化剤が粒子（例えば粒子表面）に過剰量残存していることから、非特異吸着が発生しやすい。前記多孔質化剤の含有量の変化量は、例えば、アセトニトリルを含む洗浄液に分離材から溶出する多孔質化剤の溶出量である。本実施形態の分離材では、少なくとも一種の前記成分Ａが上記変化量を満たせばよい。多孔質化剤の残存量は、アセトニトリルを含む洗浄液中に分離材を２４時間浸漬し、液体クロマトグラフィー等で測定することにより求めることができる。

アセトニトリルを含む洗浄液の使用量は、例えば、分離材１ｇに対して１０ｇである。分離材を浸漬する温度は、例えば、アセトニトリルの沸点（８２℃）以下（例えば２５℃）である。分離材を含む液を浸漬中に撹拌してもよい。撹拌手段としては、スリーワンモータ、スターラー、ミックスローター等が挙げられる。撹拌速度は、例えば５００ｒｐｍ以下である。

前記成分Ａの含有量の変化量の上限は、非特異吸着の発生をさらに抑制する観点から、４５００ｐｐｍ以下が好ましく、４０００ｐｐｍ以下がより好ましく、３０００ｐｐｍ以下がさらに好ましく、３０００ｐｐｍ未満が特に好ましい。前記成分Ａの含有量の変化量の下限は、例えば１０ｐｐｍであってもよい。

ＨＬＢ値が１〜９の有機溶媒としては、Ｃ１６以下のアルキルアルコール、Ｃ１６以下の脂肪酸等が挙げられる。ＨＬＢ値が１〜９の油溶性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、プロピレングリコールモノラウレート、ソルビタンジステアレート、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノオレエート等が挙げられる。

多孔質ポリマ粒子を得るための組成物は、多孔質化剤として溶解性粒子を含んでいてもよい。溶解性粒子とは、例えば、酸、アルカリ、溶剤等に溶解させることが可能な粒子である。溶解性粒子は、重合中には溶解せず、粒子形成後にポリマ粒子を酸溶液に浸すことによって粉体多孔質化剤を溶解する方法等により、除去することができる。溶解性粒子の構成材料としては、具体的には、炭酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、シリカ、ポリマ、金属コロイド等を使用することができる。溶解性粒子の構成材料としては、除去しやすさの観点から、炭酸カルシウム、第三リン酸カルシウム等を用いることが好ましい。溶解性粒子の粒径は、０．６〜５μｍが好ましい。溶解性粒子の粒径は、分離材内の通液性をさらに向上させる観点から、１〜５μｍがより好ましい。なお、溶解性粒子の平均粒径は、後述の多孔質ポリマ粒子の平均粒径の測定方法と同様の方法で測定することができる。

重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。

アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩；ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩；アルキルナフタレンスルホン酸塩；アルカンスルホン酸塩；ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩；アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）；アルキルリン酸エステル塩；ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物；ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩；ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩が挙げられる。

カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩；ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の４級アンモニウム塩が挙げられる。

ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤；シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤；パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。

両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤；リン酸エステル系界面活性剤；亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。

界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマの重合時の分散安定性に優れる観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。

必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。

重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。

多孔質ポリマ粒子の合成（重合工程）において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を用いてもよく、乳化液に高分子分散安定剤を添加してもよい。

高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。

モノマが単独で重合することを抑えるため（例えば、水中でモノマが単独に乳化重合した粒子の発生を抑えるため）に、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。

多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、さらに好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、通液性の更なる向上の観点、及び、カラム充填後のカラム圧が増加することを抑制する観点から、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上、さらに好ましくは５０μｍ以上である。

多孔質ポリマ粒子の細孔容積（空隙率）は、多孔質ポリマ粒子の全体積基準で３０〜７０体積％であることが好ましく、４０〜７０体積％であることがより好ましく、５０〜７０体積％であることがさらに好ましい。多孔質ポリマ粒子は、細孔径（モード径）が０．０１μｍ以上０．６μｍ未満である細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。細孔径は、０．０２μｍ以上０．６μｍ未満であることがより好ましい。細孔径が０．０１μｍ以上であると、細孔内に物質が入りやすくなる傾向があり、細孔径が０．６μｍ未満であると、比表面積が充分なものになる。これらは上述の多孔質化剤により調整可能である。

多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性の更なる向上の観点から、３〜１５％が好ましく、３〜１２％がより好ましく、３〜１０％がさらに好ましい。Ｃ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（例えば株式会社日立製作所製）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。

多孔質ポリマ粒子の比表面積は、３０ｍ^２／ｇ以上が好ましい。比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向がある。多孔質ポリマ粒子の比表面積は、より高い実用性の観点から、３５ｍ^２／ｇ以上がより好ましく、４０ｍ^２／ｇ以上がさらに好ましい。

（被覆層）
本実施形態の被覆層は、水酸基を有する高分子（例えば水溶性高分子）を含む。水酸基を有する高分子で多孔質ポリマ粒子を被覆することによりカラム圧の上昇を抑制することができると共に、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量を、天然高分子を用いた場合と同等又はそれ以上とすることができる。さらに、水酸基を有する高分子が架橋されていると、カラム圧の上昇をさらに抑制することが可能となる。

水酸基を有する高分子は、１分子中に２個以上の水酸基を有することが好ましい。また、水酸基を有する高分子は、親水性高分子であることが好ましい。水酸基を有する高分子としては、例えば多糖類（アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、キトサン等）が挙げられ、各々重量平均分子量１万〜２０万程度のものが使用できる。

また、水酸基を有する高分子としては、界面吸着能を向上させる観点から、疎水基により変性された変性体（疎水基を導入した変性体等）を用いることができる。疎水基としては、例えば、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。炭素数６〜１０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。疎水基は、水酸基と反応する官能基（エポキシ基等）及び疎水基を有する化合物（グリシジルフェニルエーテル等）を、水酸基を有する高分子と従来公知の方法で反応させることにより導入することができる。このような変性体としては、例えば、多糖類の変性体が挙げられ、具体的には、アガロースの変性体（変成アガロース）、デキストランの変性体、セルロースの変性体、ポリビニルアルコールの変性体、キトサンの変性体等が挙げられる。

［被覆層の形成方法］
水酸基を有する高分子を含む被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。被覆層は、水酸基を有する高分子を多孔質ポリマ粒子にコーティングさせることで形成することができる。被覆層の形成方法としては、例えば、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させ、未吸着分を除去後、架橋剤により架橋反応させて、細孔内に担持させる方法が挙げられる。水酸基を有する高分子の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０ｍｇ／ｍＬが好ましい。

この溶液を多孔質ポリマ粒子に含浸させる。含浸方法としては、水酸基を有する高分子の溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する方法が挙げられる。含浸時間は、多孔質ポリマ粒子の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質ポリマ粒子の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、水酸基を有する高分子の未吸着分を除去する。

［架橋処理］
次いで、架橋剤を加えて、多孔質ポリマ粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成する。例えば、架橋剤を加えて、多孔質ポリマ粒子の表面に吸着した水酸基を有する高分子を架橋反応させて、高分子の架橋ゲルを形成させる。このとき、架橋体において、例えば、水酸基を有する高分子が３次元架橋網目構造を有するようになる。

架橋剤としては、例えば、エピクロロヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような、水酸基（ＯＨ基）に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、水酸基を有する高分子として、キトサンのような、アミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロロオクタンのようなジハライドも架橋剤として使用できる。

この架橋反応には通常触媒が用いられ、該触媒は架橋剤の種類により異なるが、例えば、架橋剤がエピクロロヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、架橋剤がジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。

架橋剤による架橋反応は、通常、架橋前の分離材を適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行うことができる。架橋剤の添加量は、水酸基を有する高分子として多糖類又はその変性体を使用した場合、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．１〜１００モル倍の範囲内で、目的とする分離材の性能に応じて選定することができる。一般的に、架橋剤の添加量が０．１モル倍未満であると、被覆層が多孔質ポリマ粒子から剥離しやすくなる傾向がある。また、架橋剤の添加量が１００モル倍を超え、且つ、水酸基を有する高分子との反応率が高い場合、原料の水酸基を有する高分子の特性が損なわれる傾向がある。

また、架橋反応時の触媒の使用量としては、架橋剤の種類にもよるが、通常、水酸基を有する高分子として多糖類を使用する場合、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して好ましくは０．０１〜１０モル倍の範囲、より好ましくは０．１〜５モル倍の範囲で使用される。

例えば、該架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度に達すれば架橋反応が生起する。

水酸基を有する高分子の溶液等を吸着させた多孔質ポリマ粒子を分散、懸濁させる媒体の具体例としては、吸着させた高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、且つ、架橋反応に不活性なものであれば制限はない。そのような媒体としては、具体的には、水、アルコール等が挙げられる。

架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜２４時間かけて行う。好ましくは、３０〜９０℃の範囲の温度である。

架橋反応終了後、生成した多孔質ポリマ粒子（多孔質体）と架橋ゲルとの複合体をろ別し、次いで、水、親水性有機溶媒（メタノール、エタノール等）などで洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部が、水酸基を有する高分子を含む被覆層により被覆された分離材が得られる。本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜４００ｍｇの被覆層を備えることが好ましい。被覆層の量は、熱分解の重量減少等で測定することができる。

［イオン交換基の導入］
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を粒子表面の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法としては、例えば、ハロゲン化アルキル化合物（ハロゲン化アルキル基含有化合物）を用いる方法が挙げられる。

ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩；ジエチルアミノエチルクロライド等の、ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン；ハロゲン化アルキル基を有する４級アンモニウムの塩酸塩などが挙げられる。ハロゲン化アルキル化合物としては、臭化物又は塩化物が好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量は、イオン交換基を導入する分離材（イオン交換基を導入する前の分離材）の全質量基準で０．２質量％以上が好ましい。

イオン交換基の導入には、反応を促進させるために、有機溶媒を用いることが有効である。有機溶媒としては、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコールが挙げられる。

通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水、又は、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加し反応させる。イオン交換基の導入方法としては、一般的には、水酸化ナトリウム水溶液に親水性天然高分子を溶解し、水、又は、水−有機溶媒混合系で、ハロゲン化アルキル化合物と反応させる方法が挙げられる。ハロゲン化アルキル化合物の使用量は、例えば、親水性天然高分子の全質量基準で０．２質量％以上である。この反応は、温度４０〜９０℃で、還流下、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されたイオン交換基が決定される。

弱塩基性基であるアミノ基をイオン交換基として導入する方法としては、前記ハロゲン化アルキル化合物のうち、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミノクロライド、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミノクロライド、モノ（又はジ−）アルキル−モノ（又はジ−）アルカノールアミノクロライド等の２級又は３級アミノハロゲナイドなどを反応させる方法が挙げられる。これらのアミンの使用量は、例えば、イオン交換基を導入する分離材の全質量基準で０．２質量％以上である。反応条件は、例えば、４０〜９０℃で０．５〜１２時間である。

強塩基性基である４級アンモニウム基をイオン交換基として導入する方法としては、まず、３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロロヒドリン等のハロゲン化アルキル化合物を反応させて４級アンモニウム基に変換させる方法などが挙げられる。又は、４級アンモニウムクロライド等の４級アミノハロゲナイドなどを上述の１〜３級アミノクロライドと同様の方法で分離材（複合体）と反応させてもよい。

弱酸性基であるカルボキシ基をイオン交換基として導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量は、例えば、イオン交換基を導入する分離材の全質量基準で０．２質量％以上である。

強酸性基であるスルホン酸基をイオン交換基として導入する方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応条件は、例えば、３０〜９０℃で１〜１０時間である。

イオン交換基を導入する他の方法としては、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、例えば、イオン交換基を導入する分離材の全質量基準で０．４質量％以上使用する。反応条件は、例えば、０〜９０℃で０．５〜１２時間である。

これらの方法以外のイオン交換基の導入方法としては、スルホプロピルを反応させる方法や、エピハロヒドリンジグリシジル化合物等を付加させた後にグリシジル基にイオン交換基を導入する方法も挙げられる。一般的には、水酸化ナトリウム水溶液に親水性天然高分子を溶解し、水、又は、水−有機溶媒混合系で、ハロゲン化アルキル基含有化合物と反応させる方法が挙げられる。ハロゲン化アルキル基含有化合物の使用量は、例えば、親水性天然高分子の全質量基準で０．２質量％以上であり、この反応は、温度４０〜９０℃、還流下で、０．５〜１２時間行うのが好ましい。

本実施形態の分離材の吸湿度は、１〜３０質量％が好ましく、１〜２０質量％がより好ましく、１〜１０質量％がさらに好ましい。吸湿度が３０質量％以下であると、被覆層の厚みにより分離材の通液性が低下することをさらに抑制できる。

本実施形態の分離材の細孔径分布のモード径（細孔径分布の最頻値、最大頻度径）は、０．０５〜０．６μｍであることが好ましく、０．１〜０．５μｍであることがより好ましい。細孔径分布のモード径がこの範囲にあると、粒子中に液が流れやすくなり、動的吸着量を多くしやすい。

本実施形態の分離材の比表面積は、３０ｍ^２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は、３５ｍ^２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ^２／ｇ以上であることがさらに好ましい。比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなりやすい傾向がある。分離材の比表面積の上限は、特に限定されないが、例えば３００ｍ^２／ｇ以下とすることができる。

本実施形態の分離材又は多孔質ポリマ粒子の細孔容積、細孔径（モード径）及び比表面積は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）を用いて、例えば、以下のようにして測定することができる。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０ｄｅｇｒｅｅｓ、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．０５〜５μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。

本実施形態の分離材又は多孔質ポリマ粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）は、以下の測定法により求めることができる。
１）超音波分散装置を使用して粒子を水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフローＦＰＩＡ−３０００、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径と粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）を測定する。

本実施形態の分離材の平均粒径は、カラム内圧の極端な増加を避ける観点（例えば、分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用においてカラム内圧の極端な増加を避ける観点）から、１０〜３００μｍが好ましい。

分離材の細孔径、比表面積等は、多孔質ポリマ粒子の原料、多孔質化剤、水酸基を有する高分子等を適宜選択することによって調整することができる。

本実施形態の分離材は、タンパク質の静電的相互作用による分離、アフィニティ精製等に用いるのに好適である。例えば、イオン交換基を導入した分離材（イオン交換体）を用いて、以下の方法により、タンパク質を回収することができる。まず、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離及び回収できる。また、本実施形態の分離材は、例えば、液体クロマトグラフィー用分離材として、カラムクロマトグラフィーにおいて使用することもできる。本実施形態のカラムは、本実施形態の分離材を備え、例えば、本実施形態の分離材を充填してなる。

本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン（ＢＳＡ：Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｕｂｕｍｉｎ）、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質；生体中に存在する酵素；バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質；ＤＮＡ；生理活性をするペプチド等の生体高分子である。生体高分子の分子量は、２００万以下が好ましく、５０万以下がより好ましい。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、条件等を選ぶことができる。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。

水酸基を有する高分子の架橋体により多孔質ポリマ粒子をコーティングした後、粒子表面、及び／又は、細孔内にイオン交換基、プロテインＡ等を導入することにより、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子及びポリマからなる粒子の持つそれぞれの利点をあわせ持った特性を示しやすい。この性能は、従来の技術では発揮されなかったものである。特に、このような本実施形態の分離材の骨格となる多孔質ポリマ粒子は、上記のような方法で得られる粒子であるため、耐久性及び耐アルカリ性に優れる。また、水酸基を有する高分子の架橋体をコーティングすることにより、非特異吸着がさらに起こりにくく、タンパク質の脱吸着が起こりやすい傾向にある。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着容量（動的吸着容量）が大きい点でも従来のイオン交換樹脂に比べて好ましい性質を有する。

本明細書における「通液速度」とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに本実施形態の分離材を充填し、液を流した際の通液速度を表す。本実施形態の分離材をカラムに充填した場合、カラム圧が０．３ＭＰａのときの通液速度（流速）は、８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離を行う場合、カラムに通液されるタンパク質溶液等の通液速度としては、一般的に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲であるが、本実施形態の分離材を使用した場合は、通常のタンパク質分離用の分離材よりも速い通液速度である８００ｃｍ／ｈ以上でも高吸着容量で使用できる。

本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーでカラム充填材として使用した場合、使用する溶出液の性質によらず、カラム内での体積変化が少ないため、操作性に優れる。

なお、本実施形態では、主に、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
（多孔質ポリマ粒子１の合成）
５００ｍＬの三口フラスコ中で、モノマとして純度９６質量％のジビニルベンゼン（ＤＶＢ９６０、新日鉄住金化学株式会社）１０．７ｇ及びスチレン５．３ｇと、多孔質化剤としてトルエン１４．４ｇ及びドデカノール２１．６ｇと、開始剤として過酸化ベンゾイル０．６４ｇとを、分散安定剤としてのポリビニルアルコール水溶液（０．５質量％）に加え、マイクロプロセスサーバーを使用して乳化させた。得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約８時間撹拌して粒子を得た。得られた粒子をろ過後、水で洗浄を行った。さらに、ソックスレー抽出装置でアセトン洗浄を８時間行い、多孔質ポリマ粒子１を得た。得られた粒子の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を算出した。結果を表１に示す。

（被覆層の形成：水酸基を有する水溶性高分子によるコーティング）
アガロース水溶液（２質量％）１００ｍＬに、水酸化ナトリウム４ｇと、グリシジルフェニルエーテル０．１４ｇとを加え、７０℃で１２時間反応させることにより、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで沈殿させ、洗浄した。

２０ｍｇ／ｍＬの変性アガロース水溶液４００ｍＬに多孔質ポリマ粒子１を１０ｇの含有量で投入し、５５℃で２４時間撹拌することにより、多孔質ポリマ粒子１に変性アガロースを吸着させ、多孔質ポリマ粒子１の表面に被覆層を形成した。その後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。

粒子に吸着した変性アガロースを次のようにして架橋させた。エチレングリコールジグリシジルエーテル０．６４Ｍ及び水酸化ナトリウム０．４Ｍを含む水溶液に、水溶液３５ｍＬに対して粒子１ｇの割合で粒子を添加し、室温にて２４時間撹拌した。その後、加熱した２質量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で洗浄した。

上記で得られた粒子を含む水懸濁液をろ過して得られた粒子（乾燥質量２０ｇ）を５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬに投入し、室温で１時間放置した。ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の所定量（６０ｇ）に水を添加して水溶液２００ｇを得た。水溶液の温度を７０℃まで上げ、撹拌しながら２時間反応させた。反応終了後、生成物をろ別して水洗し、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有する分離材（ＤＥＡＥ変性分離材）を得た。得られたＤＥＡＥ変性分離材の細孔径（モード径）及び比表面積を水銀圧入法により測定した。また、ＤＥＡＥ変性分離材を乾燥後、熱重量分析により被覆層の被覆量（水溶性高分子の被覆量）を定量した。結果を表２に示す。

（多孔質化剤の溶出量測定）
ＤＥＡＥ変性分離材５ｇを２５℃のアセトニトリル５０ｇ中に投入した後、ミックスローターを用いて１００ｒｐｍにて２４時間撹拌した。次に、液体クロマトグラフィーを使用して、アセトニトリルに溶出した溶出物（多孔質化剤）を検出すると共に、アセトニトリル中における溶出物の含有量（溶出量。分離材（粒子）１ｇ当たりの量）を計測した。なお、分離材を浸漬する前において、アセトニトリルが上記多孔質化剤を含有していないことを確認した。

（タンパク質の非特異吸着能評価）
得られた粒子（分離材）０．５ｇをＢＳＡ濃度２０ｍｇ／ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍＬに投入し、室温で２４時間撹拌を行った。その後、遠心分離で上澄みをとった後、分光光度計でろ液のＢＳＡ濃度を算出することにより、粒子に吸着したＢＳＡ量を算出した。ＢＳＡ濃度は、分光光度計により２８０ｎｍの吸光度から算出した。非特異吸着量が５ｍｇ以下である場合を「○」と評価し、５ｍｇを超える場合を「×」と評価した。結果を表３に示す。

（カラム特性評価）
ＤＥＡＥ変性分離材をφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムにスラリー（溶媒：メタノール）濃度３０質量％にて１５分かけて充填した。その後、流速を変えて水をカラムに流し、流速とカラム圧との関係を測定し、カラム圧０．３ＭＰａ時の線流速（カラム流速）を算出した。結果を表３に示す。

また、タンパク質回収率を以下のようにして測定した。まず、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに１０カラム容量流した。その後、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を用いて調製されたＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液を８００ｃｍ／ｈで流し、ＵＶによりカラム出口でのＢＳＡ濃度を測定した。そして、１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（動的結合容量、（ＢＳＡ吸着量））を下記式により算出した。次に、カラム入口と出口のＢＳＡ濃度が一致するまでＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液を流し、５カラム容量分の１ＭのＮａＣｌのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を流し、溶出したＢＳＡ量（ＢＳＡ回収量）を得た。そして、「ＢＳＡ回収量／ＢＳＡ吸着量×１００（％）」に基づきタンパク質回収率を算出した。結果を表３に示す。
ｑ_１０＝ｃ_ｆＦ（ｔ_１０−ｔ_０）／Ｖ_Ｂ
ｑ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ ｗｅｔ ｒｅｓｉｎ）
ｃ_ｆ：注入しているＢＳＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｖ_Ｂ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間（ｍｉｎ）
ｔ_０：ＢＳＡ注入開始時間（ｍｉｎ）

＜実施例２＞
多孔質ポリマ粒子１と同様にして多孔質ポリマ粒子２を合成した。多孔質ポリマ粒子の合成後におけるソックスレー抽出での洗浄時間を５時間に変更した以外は、実施例１と同様に処理することによって分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

＜実施例３＞
多孔質ポリマ粒子１と同様にして多孔質ポリマ粒子３を合成した。多孔質ポリマ粒子の合成後におけるソックスレー抽出での洗浄時間を３時間に変更した以外は、実施例１と同様に処理することによって分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

＜実施例４＞
多孔質ポリマ粒子１と同様にして多孔質ポリマ粒子４を合成した。多孔質ポリマ粒子の合成後におけるソックスレー抽出での洗浄時間を２時間に変更した以外は、実施例１と同様に処理することによって分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

＜実施例５＞
モノマとして、ジビニルベンゼン１０．７ｇ及びスチレン５．３ｇに代えて、ジビニルベンゼン１４．４ｇ及びスチレン３．６ｇを使用して多孔質ポリマ粒子５を合成した以外は、実施例１と同様に処理することによって分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

＜実施例６＞
モノマとして、ジビニルベンゼン１０．７ｇ及びスチレン５．３ｇに代えて、ジビニルベンゼン１８ｇを使用して多孔質ポリマ粒子６を合成した以外は、実施例１と同様に処理することによって分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

＜実施例７＞
多孔質化剤として、トルエン１４．４ｇ及びドデカノール２１．６ｇに代えて、ソルビタンモノオレエート８ｇを使用して多孔質ポリマ粒子７を合成した以外は、実施例１と同様に処理することによって分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

＜実施例８＞
多孔質化剤として、トルエン１４．４ｇ及びドデカノール２１．６ｇに代えて、ソルビタンモノラウレート８ｇを使用して多孔質ポリマ粒子８を合成した以外は、実施例１と同様に処理することによって分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

＜実施例９＞
多孔質化剤として、トルエン１４．４ｇ及びドデカノール２１．６ｇに代えて、グリセロールモノオレエート８ｇを使用して多孔質ポリマ粒子９を合成した以外は、実施例１と同様に処理することによって分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

＜比較例１＞
粒子洗浄法としてソックスレー抽出の代わりに５００ｍＬのアセトン中で１０ｍｉｎ撹拌洗浄を２回行って多孔質ポリマ粒子１０を合成した以外は、実施例１と同様に処理することによって分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

＜比較例２＞
粒子洗浄法としてソックスレー抽出の代わりに５００ｍＬのアセトン中で１０ｍｉｎ撹拌洗浄を１回行って多孔質ポリマ粒子１１を合成した以外は、実施例１と同様に処理することによって分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

＜比較例３＞
多孔質化剤として、トルエン１４．４ｇ及びドデカノール２１．６ｇに代えて、ソルビタンモノオレエート８ｇを使用した以外は実施例１と同様にして粒子を合成後、粒子洗浄法としてソックスレー抽出の代わりに５００ｍＬのアセトン中で１０ｍｉｎ撹拌洗浄を２回行って多孔質ポリマ粒子１２を合成した以外は、実施例１と同様に処理することによって分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

＜比較例４＞
市販のアガロース粒子（Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ、ＧＥヘルスケア製）を多孔質ポリマ粒子１３として用いて、この多孔質ポリマ粒子１３について実施例１と同様の評価を行った。

表３の結果から分かる通り、本願実施例１〜９は、比較例１〜４に比べて、タンパク質の非特異吸着を低減しつつ、タンパク質回収率が高く、且つ、カラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れることが判明した。

Claims (10)

1. 多孔質ポリマ粒子と、
   該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える分離材であって、
   前記被覆層が、水酸基を有する高分子を含み、
   前記分離材が、ドデカノール及びＨＬＢ値１〜９の油溶性界面活性剤の少なくとも一方の成分Ａを含有し、
   アセトニトリルを含む洗浄液に前記分離材を２４時間浸漬する前後において、前記洗浄液における前記成分Ａの含有量の変化量が、前記分離材１ｇ当たり５０００ｐｐｍ以下である、分離材。
2. 前記多孔質ポリマ粒子が、ジビニルベンゼンを５０質量％以上含むモノマを重合することにより得られる重合体を含む、請求項１に記載の分離材。
3. 比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上である、請求項１又は２に記載の分離材。
4. 細孔径分布のモード径が０．０５〜０．６μｍである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離材。
5. 前記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜３００μｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材。
6. 前記水酸基を有する高分子が多糖類又はその変性体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離材。
7. 前記水酸基を有する高分子がアガロース又はその変性体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離材。
8. 前記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜４００ｍｇの前記被覆層を備える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分離材。
9. カラムに充填した場合、カラム圧が０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離材。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離材を備える、カラム。