JP2015199868A - 多孔性架橋セルロースゲル、その製造方法及びその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】クロマトグラフィー用充填剤として有用な、精製対象物質の吸着量及び機械的強度の高い多孔性架橋セルロースゲルの製造方法、及び前述の製造方法により得られたクロマトグラフィー用充填剤を提供すること。【解決手段】セルロースをアルカリ水溶液に溶解してセルロース溶液を得る工程、セルロース溶液を有機溶媒と混合してセルロース分散液を得る工程、分散液を−３０℃以下に冷却した溶媒に添加して多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程及び異なる２種類の架橋剤を使用した２段階からなる架橋工程により得られる本発明の多孔性架橋セルロースゲルは、２５℃の水をカラム内に線速度１７５５ｃｍ／時で通液した条件でのカラム圧力損失が０．４ＭＰａ以下であることを特徴としている。さらに本発明の多孔性架橋セルロースゲルは精製対象物質の吸着量が高いことから、タンパク質などの生体高分子の精製工程における生産性を著しく向上させることができる。【選択図】 なし

Description

本発明は、クロマトグラフィー用充填剤として有用な、機械的強度に優れる多孔性架橋セルロースゲル、その製造方法及びその用途に関する。より正確には、本発明は低温での造粒及び新規架橋方法による多孔性架橋セルロースゲルの製造方法及びその方法により得られる多孔性架橋セルロースゲルに関する。

近年、タンパク質やワクチンなどのバイオ医薬品製剤の需要が急激に増加している。一般的に、バイオ医薬品製造の精製工程には多孔質充填剤を充填したカラムクロマトグラフィーが使用されており、生産性向上を目的として、精製対象物質の吸着量が高く、高流速処理が可能な機械的強度に優れたクロマトグラフィー用充填剤が必要とされている。バイオ医薬品精製用のクロマトグラフィー用充填剤としては、精製対象物質の分離能や吸着量が高い点でアガロース、セルロースなどの多孔性多糖系ゲルが多用されてきたが、従来の多孔性多糖系ゲルは機械的強度が不足しており、高流速処理が困難であるという欠点があった。

一般的に、クロマトグラフィー用充填剤としての多孔性多糖系ゲルは、原料となる多糖から多孔性未架橋多糖系ゲルを製造したのち、機械的強度を増加させることを目的とした架橋処理を行うことにより多孔性架橋多糖系ゲルとして製造される。通常の架橋処理において、多孔性架橋多糖系ゲルの機械的強度を高くする方法としては、例えば、架橋処理に使用する架橋剤の使用量を増加する方法や繰返し架橋処理を行なう方法などが挙げられる。

しかしながらこの場合、得られた多孔性架橋多糖系ゲルの含水率が低下するために精製対象物質の吸着量が低くなり、従って、クロマトグラフィー用充填剤としての性能が不十分となる場合がある。また、多孔性架橋多糖系ゲルの機械的強度は前述の架橋処理方法だけでなく多孔性未架橋多糖系ゲルの製造方法によっても異なることが知られており、従って、多孔性未架橋多糖系ゲルの製造方法が異なれば、同じ架橋処理を行なっても、得られる多孔性架橋多糖系ゲルの機械的強度は異なる場合がある。

多孔性未架橋セルロースゲルの製造法は数多くの方法が公知であり、例えば、特許文献１にはビスコース懸濁液から球状セルロース粒子を得る方法が、特許文献２には水酸化ナトリウム水溶液に溶解したパルプ水溶液を−１５から−４０℃に冷却した溶媒に投入することにより多孔性セルロース粒子を得る方法が開示されている。また特許文献３には、結晶性セルロースをチオシアン酸カルシウム水溶液に溶解させた溶液を１３０℃に加熱した分散溶液に滴下後、冷却することにより球状セルロース粒子を得る方法が開示されている。さらに非特許文献１には、コットン由来セルロースを、水酸化ナトリウムと尿素の混合水溶液に溶解させた溶液を分散溶液に滴下し、５℃で希塩酸を添加することで球状セルロース粒子を得る方法が開示されている。

多孔性未架橋多糖系ゲルの架橋処理には架橋剤との反応性や化学的安定性の点で、多孔性多糖系ゲルとエーテル結合を形成する架橋剤を使用することが一般的である。従来から多孔性未架橋セルロースゲルの架橋処理にはエピクロロヒドリンが多用されており、例えば、特許文献４にはマーセル化セルロースをエピクロロヒドリンで架橋処理を行なう方法が、特許文献５にはビスコース粒子から得られたセルロース粒子をエピクロロヒドリンで架橋処理する方法が開示されている。

また、特許文献６には、特許文献３に記載の方法で製造した多孔性球状セルロース粒子を、段階的にエピクロロヒドリンを添加して架橋処理する方法が開示されている。さらに特許文献７には、木材パルプ由来セルロースを水酸化ナトリウムと尿素あるいはチオ尿素の混合水溶液に溶解させた溶液から得た多孔性セルロースを、特許文献６に開示の方法で架橋処理を行なうことにより多孔性架橋セルロースを得る方法が開示されている。

一方、エピクロロヒドリン以外の架橋剤の使用例として、特許文献８にはセルロースを含有する多孔質担体をグリシジルエーテル系化合物で架橋する方法が開示されている。また、多種類の架橋剤により架橋する方法として、非特許文献２にはビスコース懸濁液から得られたセルロースゲルをエチレングリコールジグリシジルエーテルとエピクロロヒドリンで架橋することにより、含水率が７０％以下の多孔性架橋セルロースゲルを得る方法が開示されている。

しかしながら、前述の多孔性未架橋セルロースゲル及び多孔性未架橋セルロースゲルを架橋処理することで得られた多孔性架橋セルロースゲルについて、含水率が８０％以上で且つ十分な機械的強度を持つ多孔性セルロースゲル及びその製造方法は、これまでに知られていなかった。

従って特許文献４から８に記載のエピクロロヒドリンあるいはグリシジルエーテル系化合物を用いて架橋処理を行なう方法では、得られた架橋セルロースゲルのカラム圧力損失が高くなるため、高流速処理が可能なクロマトグラフィー用充填剤として使用するには機械的強度に課題があった。また、非特許文献２に開示の製造法では、機械的強度に優れた架橋セルロースゲルを得ることができるが、含水率が低く、また分離対象物質の吸着量が低いことから、クロマトグラフィー用充填剤として使用するには性能に課題があった。

特公昭５７−４５２５４号公報 特開昭６４−４３５３０号公報 特開平１０−１９５１０３号公報 特開昭４３−１００５９号公報 特開平６−８２４３５号公報 特開２００９−２４２７７０号公報 特開２０１１−２３１１５２号公報 特開２０１１−２５２９２９号公報

Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，１２１７，（２０１０）ｐ．５９２２−５９２９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，１１４６，（２００７）ｐ．３２−４０

本発明の目的は、機械的強度が高く、高流速処理が可能なクロマトグラフィー用充填剤として有用な多孔性架橋セルロースゲルとその製造方法及びタンパク質の精製方法を提供することにある。

本発明者等は上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、セルロースのアルカリ水溶液を有機溶媒で乳化したセルロース分散液中のセルロース溶液を凍結させることにより得られた多孔性未架橋セルロースゲルに、官能基間の原子数が異なる２種類の架橋剤を使用した架橋処理を行なうことにより、含水率が高く機械的強度に優れた多孔性架橋セルロースゲルが得られることを見いだした。さらに本発明の多孔性架橋セルロースゲルはタンパク質などの精製対象物質の吸着量が高く、クロマトグラフィー用充填剤として利用可能であることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下の（１）から（４）に記載した発明を提供するものである。

（１）平均粒子径が２０μｍ以上３００μｍ以下であり、内径６．６ｍｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ２２０ｍｍ±５ｍｍとなるように充填し、２５℃の水をカラム内に線速度１７５５ｃｍ／時で通液した条件でのカラム圧力損失が０．４ＭＰａ以下であることを特徴とする、多孔性架橋セルロースゲル。

（２）以下の工程を含むことを特徴とする、（１）記載の多孔性架橋セルロースゲルの製造方法：
（ａ）セルロースをアルカリ水溶液に溶解することにより、セルロース溶液を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたセルロース溶液と有機溶媒を混合することにより、セルロース分散液を得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られたセルロース分散液中のセルロース溶液を凍結させることにより、多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルを、グリシジルエーテル類と反応させることにより、多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲルを、セルロースの水酸基と反応し得る活性部位を２つ以上有する架橋剤と反応させることにより、多孔性架橋セルロースゲルを得る工程。

（３）（１）記載の多孔性架橋セルロースゲルを含む、クロマトグラフィー用充填剤。

（４）（３）記載のクロマトグラフィー用充填剤を用いることを特徴とする、タンパク質の精製方法。

以下に本発明をさらに詳細に説明する。

本発明における多孔性架橋セルロースゲルは、粒子径が２０μｍ以上３００μｍ以下であり、内径６．６ｍｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ２２０ｍｍ±５ｍｍとなるように充填し、２５℃の水をカラム内に線速度１７５５ｃｍ／時で通液した場合のカラム圧力損失が０．４ＭＰａ以下、好ましくは０．３ＭＰａ以下、さらに好ましくは０．２５ＭＰａであることを特徴とする。

前述のとおり、バイオ医薬品の精製工程では、生産性の向上を目的として精製対象物質の高流速処理が可能な機械的強度の高いクロマトグラフィー用充填剤が必要とされている。機械的強度の低いクロマトグラフィー用充填剤をカラムに充填して通液した場合、流速をカラム断面積で除した値である線速度が増加するに従って圧密化が生じ、カラム圧力損失が増加するために流速を上げることができなくなる。一方、機械的強度の高いクロマトグラフィー用充填剤の場合、線速度が増加しても圧密化が生じず、カラム圧力損失が増加しないため、精製対象物質の高流速処理が可能となる。

カラム圧力損失は、移動相の線速度とカラムの長さに比例して増加し、また、充填剤の粒子径の二乗に比例して低下するが、粒子径が大きくなるほど精製対象物質の吸着量は低下することが知られている。従って本発明における多孔性架橋セルロースゲルの平均粒子径は、クロマトグラフィー用充填剤としてカラムに充填して使用する場合に高流速処理が可能である点及び精製対象物質の吸着量を高める点で２０μｍ以上３００μｍ以下であり、好ましくは３０μｍ以上２００μｍ、さらに好ましくは４５μｍ以上１５０μｍ以下である。なお、この平均粒子径は、光学顕微鏡を用いて１００μｍの目盛り付きスライドグラスの画像を撮影したのち、同じ倍率で測定対象の粒子の画像を撮影し、物差しを用いて撮影した粒子の粒子径を測定することで求めることができる。

また、多孔性架橋セルロースゲルの粒子径はステンレス製ＪＩＳ標準ふるいなどを使用した湿式分級法により所望の範囲に調整することが可能であり、例えば、目開き４５μｍのふるいと目開き１５０μｍのふるいを使用した湿式分級により、４５μｍ以上１５０μｍ以下の多孔性架橋セルロースゲルを得ることができる。

本発明における多孔性架橋セルロースゲルが示すカラム圧力損失は、バイオ医薬品の精製工程で一般的に使用される長さを持つクロマトグラフィー用カラムで測定されたものであり、市販の多孔性架橋多糖系ゲルであるＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、架橋アガロースゲル）や、セルファインＧＣＬ−２０００（ＪＮＣ社製、架橋セルロースゲル）を同一条件で測定した場合のカラム圧力損失よりも低いため、精製対象物質の高流速処理が可能な機械的強度の高いクロマトグラフィー用充填剤として有用性が高いものである。なお、本発明における多孔性架橋セルロースゲルのカラムへの充填方法及びカラム圧力損失の具体的な測定方法は、実施例に示したとおりである。

多孔性架橋セルロースゲルの機械的強度は、多孔性架橋セルロースゲル中のセルロース含有量や架橋処理に使用する架橋剤の使用量を増加させることで達成されるが、この場合、多孔性架橋セルロースゲルの含水率が低下するために精製対象物質の多孔性架橋セルロースゲル中に存在可能な量が低下し、精製対象物質の吸着量が低下する可能性がある。従って、高い機械的強度と高い吸着量の双方を達成するためには、本発明において採用した官能基間の原子数が異なる２種類の架橋剤を使用して架橋処理を行なうことにより含水率が高く、機械的強度に優れた多孔性架橋セルロースゲルを得ることができる。本発明における多孔性架橋セルロースゲルの含水率は８０％以上が好ましく、より好ましくは８５％以上である。

セルロースゲルの含水率は、水に懸濁したセルロースゲルをメスシリンダー内で沈降させ、時々タッピングを行なって容積が一定になるまで放置したのち容積を測定し、メスシリンダー内のゲル全量を乾燥させて乾燥重量を測定することにより、以下に示した計算式から算出することができる。

ゲルの乾燥方法は特に限定されないが、８０から１００℃に加熱した乾燥機中で１日〜２日乾燥させる方法や、凍結乾燥法によりゲルを乾燥させればよい。

含水率（％）＝（１−（ゲルの乾燥重量（ｇ）÷ゲルの容積（ｍＬ）））×１００
また、本発明における多孔性架橋セルロースゲルの水に対する再膨潤率は９０から１００％であることが好ましく、より好ましくは９５から１００％である。セルロースゲルの再膨潤率は、含水率測定に使用した乾燥ゲルを水で再膨潤させたのち、含水率測定と同様の方法で容積を測定することにより、以下に示した計算式から算出することができる。

再膨潤率（％）＝（再膨潤させたゲルの容積（ｍＬ）÷乾燥前のゲルの容積（ｍＬ））×１００
本発明における多孔性架橋セルロースゲルの製法は、
（ａ）セルロースをアルカリ水溶液に溶解することにより、セルロース溶液を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたセルロース溶液と有機溶媒を混合することにより、セルロース分散液を得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られたセルロース分散液を中のセルロース溶液を凍結させることにより、多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルを、グリシジルエーテル類と反応させることにより、多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲルを、セルロースの水酸基と反応し得る活性部位を２つ以上有する架橋剤と反応させることにより、多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
の５工程を含む。

以下に各工程の詳細を説明する。

（ａ）セルロースをアルカリ水溶液に溶解することにより、セルロース溶液を得る工程
工程（ａ）で使用するセルロースはセルロース溶液を得ることができれば特に制限はなく、木材パルプやコットンなどの植物セルロース、アセトバクター・キシリナムなどの酢酸菌やシュードモナス属細菌などの微生物が産生する微生物セルロース、セルロース溶液を不溶性溶媒に添加することによって得られる再生セルロースなどを使用することができる。本発明における原料セルロースとしては、入手の容易さ及び前述の重合度調整の容易さの点で植物セルロース、微生物セルロースが好ましく、また、これらの混合物を使用することもできる。

一般的に、機械的強度の高い多孔性架橋セルロースゲルは、高濃度のセルロース溶液を使用することにより達成されるが、原料として平均重合度の高いセルロースを使用すると溶解性が悪くなるため、高濃度のセルロース溶液を得ることができない。一方、平均重合度の低いセルロースを使用すると高濃度のセルロース溶液を得ることはできるが、得られる多孔性セルロースゲルの機械的強度が低下する。従って、本発明に用いるセルロースの平均重合度としては、セルロースの溶解性やセルロースゲルの機械的強度の点で１００以上１０００以下であることが好ましく、より好ましくは１００以上５００以下である。

前述のセルロースの平均重合度は、塩酸や硫酸などを使用した化学的処理や、セルラーゼなどを使用した生物学的処理により適宜調整することができる。具体的には、１から１０％の塩酸にセルロースを懸濁させたのち、８０から１１０℃で加熱する化学的処理法を例示することができる。セルロースの平均重合度は、日本電機工業会規格ＪＥＭ１４５５：変圧器用絶縁紙の平均重合度測定方法に記載の方法、すなわち、セルロースを銅・エチレンジアミン溶液に溶解したのちオストワルド粘度測定計を使用した粘度測定法により求めることができる。

溶液中のセルロース濃度は、得られる多孔性セルロースゲルの含水率を高める点で０．５重量％以上１０重量％以下であることが好ましい。セルロース濃度が低くなると得られる多孔性セルロースゲルの機械的強度が低下する一方、セルロース濃度が高くなるとセルロース溶液の粘度が高くなり溶解後の操作性が悪くなることから、１重量％以上８重量％以下であることがより好ましい。

前述の平均重合度が１００以上１０００以下のセルロースには市販品を使用してもよく、例えばコットン由来のセルロースとしてはＡＤＶＡＮＴＥＣ社製濾紙粉末シリーズ、パルプ由来のセルロースとしては旭化成社製セオラスシリーズを使用することができる。セルロース溶液調製の容易さや重合度の点で、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製濾紙粉末シリーズではＣタイプ、旭化成社製セオラスシリーズではＰＨ−１０１が好ましい。

また、前述の微生物セルロースの調製法としては、セルロース産生微生物を培養することにより得られたセルロースを精製する方法を例示することができる。セルロース産生微生物の培養は一般的な微生物培養方法に従えばよく、例えば炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミンなどの有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地でセルロース産生微生物を培養し、２５から３５℃で１週間から１ヶ月間、静置培養することにより微生物セルロースを得ることができる。

得られた微生物セルロースには菌体と培地成分が含まれるため、破砕処理とアルカリ処理を組み合わせた洗浄処理後、凍結乾燥することにより精製することができる。具体的には、培養により得られた微生物セルロースをミキサーで破砕し、水酸化ナトリウム水溶液に懸濁して加熱処理を行い、ｐＨが中性になるまで水で繰返し洗浄したのち、凍結乾燥する方法を例示することができる。

精製した微生物セルロースは、前述の化学的処理で重合度を調整することにより、本発明における原料として使用することができる。塩酸を使用した化学的処理では塩酸濃度により重合度を容易に調整することができる。例えば、１％微生物セルロース懸濁液をオートクレーブ中、１０５℃で３０分、処理する場合には、懸濁液中の塩酸濃度を１から６％にすることにより、平均重合度が１５０から４１０の微生物セルロースを得ることができる。

工程（ａ）で使用できるアルカリ水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウムと尿素の混合水溶液を例示することができる。工程（ａ）で使用するアルカリ水溶液が水酸化ナトリウム水溶液である場合、水酸化ナトリウム濃度が低いとセルロースを溶解することができず、また濃度が高いとセルロースの分解や変性が起こることから、水酸化ナトリウムの濃度は４重量％以上１２重量％以下が好ましく、より好ましくは６重量％以上１０重量％以下である。

また、アルカリ水溶液が水酸化ナトリウムと尿素の混合水溶液である場合、水酸化ナトリウム濃度は前述の理由により４重量％以上１２重量％以下が好ましく、より好ましくは６重量％以上１０重量％以下である。尿素濃度は１０から４０℃において６重量％以上１０重量％以下の水酸化ナトリウム水溶液中で尿素が溶解できれば特に制限はなく、セルロースの溶解が容易である点で０．１重量％以上３５重量％以下が好ましく、１０重量％以上３２重量％がより好ましい。

前述のアルカリ水溶液にセルロースを溶解させる方法はアルカリ水溶液の組成によって異なる。アルカリ水溶液が水酸化ナトリウム水溶液の場合、１０から３０℃でセルロースを水酸化ナトリウム水溶液に懸濁させ、−８０から−２０℃で凍結させたのち、１０から３０℃で溶解させる操作を１から２回繰り返すことにより均質なセルロース溶液を得ることができる。

また、前述のアルカリ水溶液が水酸化ナトリウムと尿素の混合水溶液の場合、前述の凍結して溶解させる方法の他に、１０から３０℃でアルカリ水溶液にセルロースを添加したのち、適切な温度で撹拌することでセルロース溶液を得ることができる。さらに水酸化ナトリウムと尿素の混合水溶液中の尿素濃度を高くすることで、常温に近い温度でセルロース溶液を得ることができる。例えば、水酸化ナトリウム濃度が８重量％の場合、尿素濃度が０．１重量％以上２０重量％未満の場合はセルロースを添加したアルカリ水溶液を−５℃から１５℃で撹拌することにより均質なセルロース溶液を得ることができる。同様に尿素濃度が２０重量％以上３５重量％以下の場合は１０℃から２５℃で撹拌することにより均質なセルロース溶液を得ることができる。

（ｂ）工程（ａ）で得られたセルロース溶液と有機溶媒を混合することにより、セルロース分散液を得る工程
工程（ｂ）で使用する有機溶媒は、セルロース分散液中のセルロース溶液の分散安定性の点で２０℃における比重が０．８から１．１であり、且つ水への溶解度が０．１から５ｇ／Ｌの有機溶媒が好ましい。さらに工程（ｂ）で得られるセルロース分散液は、工程（ｂ）の次の工程（ｃ）でセルロース溶液を凍結させることから、工程（ｂ）で使用する有機溶媒の融点は−２０度以下であれば良いが、−３０℃以下であることが好ましい。

具体的には、ペンタン、ヘキサン、オクタンなどの炭素数が５から８の脂肪族炭化水素類、トルエン、エチルベンゼン、３−エチルトルエンなどの炭素数６から１０の芳香族炭化水素類、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、アニソールなどのエーテル類、酢酸ベンジル、酢酸シクロヘキシル、ヘキサン酸エチルなどのエステル類を例示することができる。中でも、セルロース溶液の乳化の容易さの点で酢酸ベンジル、酢酸シクロヘキシル、ヘキサン酸エチルなどのエステル類が好ましく、酢酸ベンジルや酢酸シクロヘキシルがより好ましい。また、有機溶媒の使用量に特に制限はないが、セルロース分散液の安定性の点でセルロース溶液に対して４から２０倍容積使用することが好ましい。

工程（ａ）で得られたセルロース溶液と前述の有機溶媒を混合する方法は、セルロース分散液が得られれば特に制限はないが、工程（ｃ）で得られる多孔性未架橋セルロースゲルの粒径分布が狭くなる点で撹拌による方法が好ましい。撹拌方法も特に制限はないが、操作が容易な点で撹拌翼を使用した方法やホモジナイザーを使用する方法が好ましい。

撹拌速度は、使用する容器及び撹拌翼やホモジナイザーなどの装置の形状や大きさによって適切な撹拌速度を選択すればよいが、粒径分布が狭いセルロース分散液が得られる点で、撹拌翼を使用した方法では毎分１００から１０００回転、ホモジナイザーを使用した方法では毎分１０００から１５０００回転が好ましい。乳化温度は前述の有機溶媒の沸点以下であれば特に制限はないが、操作が容易である点で１０から４０℃であることが好ましく、２０から３０℃であることがより好ましい。

また、前述の有機溶媒に少量の乳化剤を添加することにより、工程（ｃ）で得られる多孔性未架橋セルロースゲルの粒径分布を狭くすることができる。乳化剤は前述の有機溶媒に溶解する乳化剤であれば特に制限はないが、安全性が高い点でソルビタンモノオレエートなどの脂肪酸エステル類が好ましい。また、乳化剤濃度が高いほどセルロース分散液の安定性は高くなるが、工程（ｃ）で得られる多孔性未架橋セルロースゲルの形状に悪影響を及ぼすことから、有機溶媒に対して乳化剤を０．００１から１重量％添加することが好ましく、より好ましくは０．００１から０．１重量％である。

（ｃ）工程（ｂ）で得られたセルロース分散液を中のセルロース溶液を凍結させることにより、多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られたセルロース分散液を−３０℃以下に冷却することにより、セルロース分散液中のセルロース溶液を凍結させることで得られたセルロース粒子を、洗浄用溶媒及び水を用いて洗浄することにより、多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程を含む工程である。

セルロース分散液中のセルロース溶液を凍結させる方法としては、セルロース分散液が入った容器を冷却することにより凍結させる方法、あらかじめ冷却した管などの容器にセルロース分散液を通液して冷却することにより凍結させる方法、あらかじめ冷却した冷却用溶媒にセルロース分散液を添加して冷却することにより凍結させる方法を例示することができる。

これらの中では、短時間でセルロース分散液中のセルロース溶液を凍結できる点で、あらかじめ冷却した冷却用溶媒にセルロース分散液を添加して冷却することにより、セルロース分散液中のセルロース溶液を凍結する方法が好ましい。

セルロース溶液を凍結させるには−２０℃以下の温度が必要であることから、セルロース分散液は−２０℃以下に冷却すれば良いが、−３０℃以下に冷却することが好ましく、セルロース分散液中のセルロース溶液を短時間で凍結できる点で−４０℃以下に冷却することがより好ましい。

工程（ｃ）で使用することができる冷却用溶媒としては、融点が−４０℃であり且つ水への溶解度が０．１から５ｇ／Ｌの有機溶媒であることが好ましく、具体的にはペンタン、ヘキサン、オクタンなどの炭素数が５から８の脂肪族炭化水素類、トルエン、エチルベンゼン、３−エチルトルエンなどの炭素数６から１０の芳香族炭化水素類、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテルなどのエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類を例示することができる。

中でも、後述する洗浄処理を容易に行なえる点でペンタン、ヘキサンなどの脂肪族炭化水素類、トルエン、エチルベンゼンなどの炭素数６から１０の芳香族炭化水素類、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテルなどのエーテル類が好ましく、ヘキサンなどの脂肪族炭化水素やトルエンなどの芳香族炭化水素がより好ましい。また、冷却用溶媒の使用量に特に制限はないが、セルロース溶液を短時間で凍結できる点でセルロース分散液に対して５から２０倍容積使用することが好ましい。

冷却用溶媒の撹拌方法に特に制限はないが、セルロース分散液中で凍結したセルロース溶液の破壊を抑制する点で、撹拌翼を使用する方法が好ましい。また、撹拌速度についてはセルロース溶液が短時間で凍結できれば特に制限はない。

撹拌はセルロース溶液が十分に凍結するまで継続することが好ましく、セルロース分散液を冷却用溶媒に添加したのち、−３０℃以下の温度で３０から６０分撹拌を継続することにより、セルロース溶液が凍結したセルロース粒子を得ることができる。撹拌を中止することにより、セルロース粒子は冷却用溶媒中に沈降した状態となる。

得られたセルロース粒子を洗浄用溶媒及び水を用いて洗浄することによりセルロース粒子中の水酸化ナトリウムや尿素などのアルカリ成分を除くことで、多孔性セルロースゲルを得ることができる。具体的には、セルロース粒子が沈降した溶媒からデカンテーションなどの操作により溶媒を除去したのち、あらかじめ−２０℃以下に冷却した洗浄用溶媒を添加して撹拌し、再度静置してセルロース粒子を沈降させる操作を２から５回繰り返したのち、１０から３０℃において水でさらに洗浄することにより、目的の多孔性未架橋セルロースゲルを得ることができる。

洗浄用溶媒による洗浄処理はセルロース粒子の結合を抑制する点で、−２０℃以下で行なうことが好ましい。また洗浄用溶媒を添加したあとの撹拌は、セルロース粒子の破壊を抑制する点で、撹拌翼を使用した撹拌方法が好ましく、撹拌速度と撹拌時間は洗浄溶媒とセルロース粒子が均一に混合することができれば特に制限はない。

工程（ｃ）で使用することができる洗浄用溶媒としては、アルカリ成分を溶解可能であり且つ融点が−２０℃以下である必要があり、具体的には、メタノール、エタノール、２−プロパノール、エチレングリコール、グリセロールなどのアルコール類のいずれか１種あるいはこれらの混合物を例示することができる。またこれらのアルコール類と水の混合溶媒を使用することもできる。

（ｄ）工程（ｃ）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルを、グリシジルエーテル類と反応させることにより、多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｄ）と工程（ｅ）は官能基間の原子数が異なる２種類の架橋剤で架橋する工程であり、工程（ｄ）は、工程（ｃ）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルに溶媒を添加した懸濁液に、架橋剤であるグリシジルエーテル類を添加して撹拌条件下で加熱したのち、反応を促進させる塩基を添加することにより、多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程を含む工程である。

工程（ｄ）で使用するグリシジルエーテル類としては、多孔性架橋セルロースゲルの機械的強度を高める点で多官能性のグリシジルエーテル類を使用することが好ましく、具体的にはエチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、テトラエチレングリコールジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテルなどのジグリシジルエーテル類、グリセロールトリグリシジルエーテル、エリスリトールトリグリシジルエーテル、ジグリセロールトリグリシジルエーテルなどのトリグリシジルエーテル類、エリスリトールテトラグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテルなどのテトラグリシジルエーテル類を例示することができる。

これらの中では、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルなどのジグリシジルエーテル類、グリセロールトリグリシジルエーテル、エリスリトールトリグリシジルエーテル、ソルビトールトリグリシジルエーテルなどのトリグリシジルエーテル類、エリスリトールテトラグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテル、ソルビトールテトラグリシジルエーテルなどのテトラグリシジルエーテル類など、少なくとも２つ以上のグリシジル基を有するポリグリシジルエーテル類が好ましく、グリセロールジグリシジルエーテル、グリセロールトリグリシジルエーテル、エリスリトールトリグリシジルエーテル、エリスリトールテトラグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテルがより好ましい。これらのポリグリシジルエーテル類は単独で使用することもできるが、数種の混合物を使用することもできる。

前述のポリグリシジルエーテル類は市販品を使用してもよく、例えばナガセケムテックス社製デナコールＥＸシリーズを使用することができる。デナコールＥＸシリーズの中では得られる多孔性架橋セルロースゲルの機械的強度の点で、デナコールＥＸ−３１３（グリセロールポリグリシジルエーテル）、デナコールＥＸ−６１４Ｂ（ソルビトールポリグリシジルエーテル）及びデナコールＥＸ−４１１（ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル）が好ましい。

工程（ｄ）で使用することができる溶媒としては、多孔性未架橋セルロースゲルの懸濁液が得られ且つ架橋剤と反応しないものであれば特に制限はなく、水、有機溶媒、及びこれらの混合物を利用することができる。

有機溶媒としてはペンタン、ヘキサン、オクタンなどの炭素数が５から８の脂肪族炭化水素類、トルエン、エチルベンゼン、キシレンなどの炭素数６から１０の芳香族炭化水素類、アセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテルなどのエーテル類、ジメチルホルムアミドなどの含窒素溶媒、ジメチルスルホキシドなどの含硫黄溶媒などを例示することができる。これらの溶媒の中ではセルロースゲルの分散性が高く、架橋剤の溶解性が高い点で、水と１，４−ジオキサン、水とジメチルホルムアミド、水とジメチルスルホキシドの混合溶媒が好ましい。

溶媒の使用量に特に制限はないが、多孔性未架橋セルロースゲルの分散性を高める点で、多孔性未架橋セルロースゲルの含水重量あるいは自然沈降容積に対して０．５から５倍量の溶媒を使用することが好ましい。水と前述の有機溶媒の混合比率にも特に制限はないが、反応溶液全体に対する前述の有機溶媒の比率が１０から５０重量％であることが好ましい。

架橋剤の使用量に特に制限はないが、使用量が少ない場合には多孔性架橋セルロースゲルの機械的強度は低下し、使用量が多い場合には架橋剤同士が反応することにより反応溶液全体が固化する場合があることから、架橋処理を行なう多孔性未架橋セルロースゲルの含水重量あるいは自然沈降容積に対して０．０１から０．５倍量の架橋剤を使用することが好ましく、より好ましくは０．１から０．３倍量である。

反応溶液の温度は３０から７０℃が好ましく、より好ましくは４０から６０℃である。反応溶液の撹拌方法はセルロースゲルの破壊を抑制する点で、撹拌翼を使用する方法が好ましい。また、撹拌速度についてはセルロースゲルが懸濁液中で良好に分散できれば特に制限はない。

前述の温度で３０から６０分加熱したのち、架橋反応を促進させるため、反応溶液に塩基を添加することが望ましい。塩基としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類やトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基類を例示することができる。これらの中では水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類が好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。塩基の添加量に特に制限はないが、反応溶液の全体重量に対して０．１から４重量％であることが好ましい。

塩基を添加後は反応溶液の温度を３０から７０℃、好ましくは４０から６０℃に維持したまま、さらに２から２４時間撹拌を継続し、架橋反応を行なうことが好ましく、８から２４時間撹拌を継続することがより好ましい。反応終了後は反応溶液の温度を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターなどを使用して水あるいは適当な有機溶媒で洗浄することにより、目的の多孔性部分架橋セルロースゲルを得ることができる。

（ｅ）工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲルを、セルロースの水酸基と反応し得る活性部位を２つ以上有する架橋剤と反応させることにより、多孔性架橋セルロースゲルを得る工程
工程（ｅ）は、工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲルに溶媒を添加した懸濁液に、セルロースの水酸基と反応しうる活性部位を２つ以上有する架橋剤を添加して撹拌条件下で加熱したのち、反応を促進させる塩基を添加することにより、多孔性架橋セルロースゲルを得る工程を含む工程である。

工程（ｅ）で使用する架橋剤としては、セルロースの水酸基と反応し得る活性部位を２つ以上有する架橋剤を用いることができる。具体的には、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンなどのエピハロヒドリン類、１，２−ジクロロエタン、１，２−ジブロモエタン、１，２−ヨードエタン、１，２−ジクロロプロパン、１，３−ジクロロプロパン、１，２−ジブロモプロパン、１，３−ジブロモプロパン、１，３−ヨードプロパン、１−ブロモ−３−クロロプロパンなどのハロゲン化炭化水素類、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、２，３−ジクロロ−１−プロパノール、２，３−ジブロモ−１−プロパノールなどの含ハロゲンアルコール類、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、グリセロールトリグリシジルエーテルなどのグリシジルエーテル類を例示することができる。これらの中では反応性が高い点でエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンが好ましい。これら架橋剤は１種またはこれらの混合物として利用することもできるが、エピクロロヒドリンを単独で利用することがより好ましい。

工程（ｅ）で使用することができる溶媒としては、多孔性セルロースゲルの懸濁液が得られ且つ架橋剤と反応しないものであれば特に制限はなく、水、有機溶媒、及びこれらの混合物を利用することができる。有機溶媒としてはアセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテルなどのエーテル類、ジメチルホルムアミドなどの含窒素溶媒、ジメチルスルホキシドなどの含硫黄溶媒を例示することができる。これらの溶媒の中ではセルロースゲルの分散性が高く、架橋剤の溶解性が高い点で、水と１，４−ジオキサン、水とジメチルホルムアミド、水とジメチルスルホキシドの混合溶媒が好ましい。

溶媒の使用量に特に制限はないが、多孔性部分架橋セルロースゲルの分散性を高める点で、多孔性部分架橋セルロースゲルの含水重量あるいは自然沈降容積に対して０．５から５倍量の溶媒を使用することが好ましい。水と前述の有機溶媒の混合比率にも特に制限はないが、架橋剤の溶解性の点で反応溶液の全体重量に対する前述の有機溶媒の比率が２０から８０重量％であることが好ましい。

架橋剤の使用量に特に制限はないが、使用量が少ない場合には多孔性架橋セルロースゲルの機械的強度は低下することから、架橋処理を行なう多孔性部分架橋セルロースゲルの含水重量あるいは自然沈降容積に対して０．０５から１．５倍量の架橋剤を使用することが好ましく、より好ましくは０．１から１倍量である。

反応溶液の温度は３０から７０℃が好ましく、より好ましくは４０から６０℃である。反応溶液の撹拌方法は多孔性部分架橋セルロースゲルの破壊を抑制する点で、撹拌翼を使用する方法が好ましい。また、撹拌速度については多孔性部分架橋セルロースゲルが懸濁液中で良好に分散できれば特に制限はない。

前述の温度で３０から６０分加熱したのち、架橋反応を促進させるため、反応溶液に塩基を添加することが望ましい。塩基としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類やトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基類を例示することができる。これらの中では水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類が好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。

架橋剤がエピハロヒドリン類、ハロゲン化炭化水素類、及び含ハロゲンアルコール類である場合、反応の進行に伴って反応溶液がアルカリ性から中性に変化するため、塩基の添加量は添加した架橋剤のモル数に対して０．１から１．５倍量であることが好ましく、０．２５から１．１倍量であることがより好ましい。また、塩基の添加方法に特に制限はないが、得られる多孔性架橋セルロースゲルの機械的強度の点で、必要量を連続的あるいは段階的に添加する方法が好ましい。

塩基の添加後、反応溶液の温度を３０から７０℃、好ましくは４０から６０℃に維持したまま、さらに１から１２時間撹拌を継続し、架橋反応を行なうことが好ましい。反応終了後は反応溶液の温度を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターなどを使用して水あるいは適当な有機溶媒で洗浄することにより、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得ることができる。

後工程
一般的に、クロマトグラフィー用充填剤中にエポキシ基などの分離対象物質と反応しうる官能基が残存している場合、クロマトグラフィー操作中に分離対象物質が充填剤と反応し、目的の精製対象物質が充填剤に吸着する場合が想定される。本発明における多孔性架橋セルロースゲルは、工程（ｄ）及び場合によっては工程（ｅ）でエポキシ基を含む架橋剤で架橋処理を行なっており、工程（ｅ）で得られた多孔性架橋セルロースゲルにはエポキシ基が残存している可能性があるが、後工程として工程（ｅ）で得られた多孔性架橋セルロースゲルを、水酸基を有する有機化合物と反応させる工程を実施することにより、工程（ｅ）で得られた多孔性架橋セルロースゲルに残存するエポキシ基含量を低下させることができる。

工程（ｅ）で得られた多孔性架橋セルロースゲルと反応させる水酸基を有する有機化合物としては、効率良くエポキシ基含量を低下させる点で少なくとも２つ以上の水酸基を有する有機化合物が好ましく、具体的には、エチレングリコール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのジオール類、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコール類、アガロース、デキストラン、プルラン、可溶性デンプンなどの水溶性多糖類を例示することができる。これらの中ではグリセロール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコール類やデキストラン、プルランなどの水溶性多糖類が好ましい。これら水酸基を有する有機化合物は単独あるいは数種類の混合物として利用することもできるが、単独で利用することがより好ましい。

工程（ｅ）で得られた多孔性架橋セルロースゲルを、水酸基を有する有機化合物と反応させる工程で使用することができる溶媒は水酸基を有する有機化合物が溶解すれば特に制限はなく、水、有機溶媒、及びこれらの混合物を利用することができる。有機溶媒としてはアセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテルなどのエーテル類、ジメチルホルムアミドなどの含窒素溶媒、ジメチルスルホキシドなどの含硫黄溶媒などが上げられる。これらの溶媒の中では架橋剤の溶解性が高い点で水、水と１，４−ジオキサン、水とジメチルホルムアミドあるいは水とジメチルスルホキシドの混合溶媒が好ましい。

溶媒の使用量に特に制限はないが、セルロースゲルと水酸基を有する有機化合物との反応を促進させる点で、工程（ｅ）で得られた多孔性架橋セルロースゲルの含水重量あるいは自然沈降容積に対して０．５から３倍量の溶媒を使用することが好ましい。また、水酸基を有する有機化合物の使用量に特に制限はないが、工程（ｅ）で得られた多孔性架橋セルロースゲルの含水重量あるいは自然沈降容積に対して０．０５から１倍量を使用することが好ましく、より好ましくは０．１から０．８倍量である。

セルロースゲルと水酸基を有する有機化合物との反応を促進させるため、反応溶液に塩基を添加することが望ましい。塩基としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類やトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの有機塩基類を例示することができる。これらの中では水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類が好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。塩基の添加量に特に制限はないが、反応溶液の全体重量に対して０．１から４重量％であることが好ましい。

工程（ｅ）で得られた多孔性架橋セルロースゲルの懸濁液に水酸基を有する有機化合物と塩基を添加したのち、撹拌条件下で懸濁液を加熱し、３０から７０℃、好ましくは４０から６０℃に維持したまま、２から２４時間撹拌を継続し、架橋反応を行なうことが好ましい。反応終了後は反応溶液の温度を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターなどを使用して水あるいは適当な有機溶媒で洗浄することにより、エポキシ基の含有量を低下させた多孔性架橋セルロースゲルを得ることができる。

得られた多孔性架橋セルロースゲルに残存しているエポキシ基の定量は、分析化学便覧改定三版（丸善、１９８１年）に記載のハロヒドリン生成法に従って行なうことができる。具体的には、ゲル内の溶媒として１００％の１，４−ジオキサンを含む多孔性架橋セルロースゲルと、ＨＣｌ濃度が０．２Ｍになるように調整した濃塩酸と１，４−ジオキサンの混合溶媒をフラスコに秤量し、室温で３時間撹拌したのち、エタノールとフェノールフタレインを添加し、０．１ＭのＮａＯＨで滴定することにより求めることができる。また、ゲルに残存しているエポキシ基含量により、定量に使用するゲル量、塩酸濃度、ＮａＯＨ濃度を適宜調整してもよい。

工程（ｅ）の後、及び／又は後工程の後に必要に応じて分級を行うことにより平均粒子径が２０μｍ以上３０μｍ以下の本発明の多孔性架橋セルロースが得られる。本発明における多孔性架橋セルロースゲルは機械的強度が高く、高流速処理が可能なクロマトグラフィー用充填剤として有用であり、タンパク質などの精製対象物質の分離精製に利用可能な分離能及び粒径を有していることから、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィー、キレートクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー用充填剤として有用である。

さらに本発明の多孔性架橋セルロースゲルは精製対象物質の吸着量が高く、また精製対象物質の非特異的吸着が少ないことから、特にイオン交換クロマトグラフィー用充填剤、疎水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤として有用である。本発明における多孔性架橋セルロースゲルをクロマトグラフィー用充填剤として使用する精製方法は、一般的なクロマトグラフィー操作による精製方法であれば特に制限はないが、機械的強度が高く高流速処理が可能であることから、クロマトグラフィー用カラムに充填して使用する精製方法が好ましい。

本発明の多孔性架橋セルロースゲルをこれらのクロマトグラフィー用充填剤として使用する場合、他のクロマトグラフィー用充填剤において一般的な方法により、用途に応じた各種官能基を多孔性架橋セルロースゲルに導入することができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー用充填剤として、本発明の多孔性架橋セルロースゲルにカルボキシル基やスルホン基を導入することにより陽イオン交換クロマトグラフィー用充填剤を、アミノ基を導入することにより陰イオン交換クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。

本発明の多孔性架橋セルロースゲルにカルボキシル基を導入する方法は、一般的な多糖系充填剤にカルボキシル基を導入する方法であれば特に制限されない。例えば、本発明の多孔性架橋セルロースゲルとモノクロロ酢酸、モノブロモ酢酸などのハロ酢酸を塩基性条件下で反応させる方法の他に、多孔性架橋セルロースゲルとエピクロロヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテルなどのエポキシ基含有化合物を塩基性条件下で反応させることでエポキシ化したのち、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸類や、β−アラニン、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸などのアミノ基含有カルボン酸類及びチオグリコール酸やチオリンゴ酸などの含硫黄カルボン酸類と塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。

本発明の多孔性架橋セルロースゲルにスルホン基を導入する方法としては、例えば、本発明の多孔性架橋セルロースゲルと２−ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、３−ブロモプロパンスルホン酸ナトリウム、１，４−ブタンスルトンなどのスルホン化剤を塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。本発明の多孔性架橋セルロースゲルにアミノ基を導入する方法としては、例えば、本発明の多孔性架橋セルロースゲルとエチレンジアミン、２−（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリドなどのアミノ基含有化合物を塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。

また、本発明の多孔性架橋セルロースゲルにアルキル基やアリール基を導入することにより、疎水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。本発明の多孔性架橋セルロースゲルにアルキル基やフェニル基を導入する方法としては、例えば、アルキル基を導入する方法として、本発明の多孔性架橋セルロースゲルとブチルグリシジルエーテルをアルカリ性条件下で反応させる方法を、アリール基を導入する方法として、本発明の多孔性架橋セルロースゲルとフェニルグリシジルエーテルをアルカリ性条件下で反応させる方法を例示することができる。

本発明の多孔性架橋セルロースゲルに導入するアルキル基としては炭素数４以上１２以下のアルキル基が好ましく、より好ましくは炭素数４以上８以下のアルキル基であり、アリール基としては炭素数６以上１８以下のアリール基が好ましく、より好ましくは炭素数６以上１２以下のアリール基である。

さらに、本発明の多孔性架橋セルロースゲルにカルボキシル基、アミノ基、ホルミル基、スクシンイミドオキシカルボニル基、エポキシ基、トレシル基などのアフィニティーリガンド固定化用官能基を導入したのち、コンカナバリンＡやプロテインＡなどのアフィニティーリガンドを固定化することにより、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。

本発明の多孔性架橋セルロースゲルにホルミル基を導入する方法としては、例えば、本発明の多孔性架橋セルロースゲルとグルタルアルデヒドなどの２官能性アルデヒド類を反応させる方法や、本発明の多孔性架橋セルロースゲルを過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤と反応させる方法を例示することができる。

本発明の多孔性架橋セルロースゲルにスクシンイミドオキシカルボニル基を導入する方法としては、前述のカルボキシル基を導入した多孔性架橋セルロースゲルとＮ−ヒドロキシスクシンイミドを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の存在下で反応させる方法を例示することができる。

本発明の多孔性架橋セルロースゲルにエポキシ基を導入する方法としては、例えば、本発明の多孔性架橋セルロースゲルとエピクロロヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテルなどのエポキシ基含有化合物を塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。本発明の多孔性架橋セルロースゲルに２，２，２−トリフルオロエチルスルホニル基（トレシル基）を導入する方法としては、例えば、本発明の多孔性架橋セルロースゲルと２，２，２−トリフルオロエタンスルホニルクロリド（トレシルクロリド）を反応させる方法を例示することができる。

前述のアフィニティーリガンド固定化用官能基を導入した多孔性架橋セルロースゲルにアフィニティーリガンドを固定化する方法は、一般的なアフィニティーリガンドの固定化方法であれば特に制限されない。例えば、本発明の多孔性架橋セルロースゲルにカルボキシル基あるいはアミノ基を導入した多孔性架橋セルロースゲルとアフィニティーリガンドをＮ−ヒドロキシスクシンイミドと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の存在下で反応させる方法、本発明の多孔性架橋セルロースゲルにエポキシ基を導入した多孔性架橋セルロースゲルとアフィニティーリガンドを塩基性条件下で反応させる方法、本発明の多孔性架橋セルロースゲルにホルミル基を導入した多孔性架橋セルロースゲルとアフィニティーリガンドを反応させたのち水素化ホウ素ナトリウムやジメチルアミンボランなどの還元剤で処理する方法、本発明の多孔性架橋セルロースゲルにスクシンイミドオキシカルボニル基あるいはトレシル基を導入した多孔性架橋セルロースゲルとアフィニティーリガンドを反応させる方法を例示することができる。

前述のアフィニティーリガンド固定化用官能基を導入した多孔性架橋セルロースゲルとアフィニティーリガンドを反応させる方法の中では、反応収率が高い点及び穏和な条件で反応が可能である点で、カルボキシル基あるいはアミノ基を導入した多孔性架橋セルロースゲルとアフィニティーリガンドを反応させる方法が好ましく、保存安定性の点でカルボキシル基を導入した多孔性架橋セルロースゲルがより好ましい。

本発明のカルボキシル基を導入した多孔性架橋セルロースゲルへのアフィニティーリガンド導入量は、精製対象物質の吸着量を高める点及びアフィニティーリガンドを導入した多孔性架橋セルロースゲルの製造原価を低減させる点で、１ｍＬの多孔性架橋セルロースゲル当り、１ｍｇ以上１００ｍｇ以下であることが好ましく、より好ましくは５ｍｇ以上５０ｍｇ以下、さらに好ましくは５ｍｇ以上３０ｍｇ以下である。アフィニティーリガンドを導入した多孔性架橋セルロースゲルへのアフィニティーリガンド導入量は、反応後の洗浄液を回収し、アフィニティーリガンド由来の吸光度を測定することにより算出することができる。

本発明の多孔性架橋セルロースゲルへの前述の各種官能基及びアフィニティーリガンドの導入量はクロマトグラフィー用充填剤の用途に合わせて決定すればよく、各種官能基導入量は反応条件を変更することにより調整することができる。

本発明の方法により、機械的強度が高く、高流速処理が可能なクロマトグラフィー用充填剤として有用な多孔性架橋セルロースゲルを製造することができる。また、本発明の多孔性架橋セルロースゲルはタンパク質などの精製対象物質の吸着量が高く、平均粒子径が２０μｍ以上３００μｍ以下であることから、クロマトグラフィー用充填剤として使用した場合、タンパク質などの生体高分子の精製工程における生産性を著しく向上させることができる。

さらに本発明の多孔性架橋セルロースゲルが水に対する再膨潤率が９０から１００％の場合は、セルロースゲルを乾燥させて保存することや、セルロースゲルに各種官能基を導入する場合において無水状態が好ましい反応を有機溶媒中で行なうことが可能となる。

実施例１と２で製造した多孔性架橋セルロースゲル１と２及び比較例２で製造した多孔性架橋セルロースゲル４の、流速とカラム圧力損失を示したグラフである。 実施例１２から１４で製造した多孔性架橋セルロースゲル１４から１６と市販架橋アガロースゲル及び市販架橋セルロースゲルの、流速とカラム圧力損失を示したグラフである。

以下、実施例、参考例及び比較例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

なお、以下の実施例、参考例及び比較例において、セルロースゲルを「容積」で記載した場合は水に懸濁したゲルの「自然沈降容積」であり、セルロースゲルを「重量」で記載した場合は水に懸濁したゲルをグラスフィルターでろ過して秤量した「含水重量」である。

参考例１ 微生物セルロースの調製
微生物セルロースの調製は、特開２０１０−２３６９７５公報に記載された方法に従って、以下のように行なった。

ステンレスバットに、液体培地（砂糖４．０％、クエン酸１．４％、硫酸マグネシウム七水和物０．１％、ソイトン０．５％、酵母エキス０．５％、エタノール０．５％、ｐＨ５．６）を添加し、ＮＩＴＥから分譲されたＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ ＮＢＲＣ−１３６９３を植菌し、３０℃で１週間、静置培養を行った。

培養終了後、培地表面に生成したゲル状の微生物セルロースを取り出し、ミキサーで粉砕したのち、０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液に懸濁して８０℃で３時間加熱した。水酸化ナトリウム処理を行なった微生物セルロースを洗浄液のｐＨが中性になるまで水で繰返し洗浄したのち、凍結乾燥することにより微生物セルロースＡを得た。前述の日本電機工業会規格 ＪＥＭ１４５５：変圧器用絶縁紙の平均重合度測定方法に記載の方法により平均重合度を測定した結果、微生物セルロースＡの平均重合度は９２５であった。

次に、得られた微生物セルロースＡが１重量％となるよう２％塩酸に懸濁したのち、オートクレーブ中、１０５℃で３０分間加熱した。塩酸処理を行った微生物セルロースＡを洗浄液のｐＨが中性になるまで水で繰返し洗浄したのち、凍結乾燥するにより微生物セルロースＢを得た。前述の方法により平均重合度を測定した結果、微生物セルロースＢの平均重合度は３３１であった。

同様に微生物セルロースＡが１重量％となるよう６％塩酸に懸濁したのち、１０５℃で３０分間加熱し、洗浄、凍結乾燥することにより微生物セルロースＣを得た。前述の方法により平均重合度を測定した結果、微生物セルロースＣの平均重合度は１６５であった。

実施例１ 多孔性架橋セルロースゲル１の製造
実施例１と２及び比較例１から３は、微生物セルロースを水酸化ナトリウム水溶液に溶解した２％セルロース溶液からの多孔性架橋セルロースゲルの製造方法及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。

（１）多孔性未架橋セルロースゲルＡの製造
参考例１で得られた微生物セルロースＢ（０．２ｇ、平均重合度３３１）を、常温において８重量％水酸化ナトリウム水溶液（９．８ｍＬ）に懸濁し、−２０℃で凍結させたのち常温で溶解させる操作を２回繰り返すことにより均質なセルロース溶液を得た。得られたセルロース溶液を０．００２重量％のソルビタンモノオレエートを含む酢酸ベンジル（７４．０ｇ）に添加し、シャフトジェネレーター（アズワン社製、タイプＨＴ１０１８）を接続したホモジナイザードライブ（アズワン社製、タイプＡＨＧ−１６０Ａ）を使用して１４０００ｒｐｍで３０秒間撹拌することによりセルロース分散液を得た。次に得られたセルロース分散液を、撹拌条件下、あらかじめ−５０℃に冷却したｎ−ヘキサン（１００ｍＬ）に速やかに投入し、撹拌を３０分間継続したのち、静置することによりｎ−ヘキサン中に沈降したセルロース粒子を得た。ｎ−ヘキサンをデカンテーションにより除き、あらかじめ−２０℃に冷却したメタノール（１００ｍＬ）を添加し、撹拌後、静置することによりセルロース粒子を沈降させたのち、メタノールを除去することでセルロース粒子を洗浄した。メタノールによる一連の洗浄操作を３回繰り返したのち、洗浄液が中性になるまで常温において多量の水で洗浄した。

微生物セルロースのアルカリ水溶液への溶解から水を使用した洗浄までの一連の操作を繰り返すことにより、目的の多孔性未架橋セルロースゲルＡ（２５０ｍＬ）を得た。

（２）多孔性架橋セルロースゲル１の製造
（１）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルＡ（３０ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（３０．０ｇ）、水（３０．０ｇ）、ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３（６．０ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（２．０ｍＬ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

デナコールＥＸ−３１３で架橋したセルロースゲル（３０ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（３０．０ｇ）、水（３０．０ｇ）、エピクロロヒドリン（１５．０ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（１．１０ｍＬ）を３０分間隔で８回添加し、水酸化ナトリウム水溶液を添加後、さらに５０℃で６０分間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

次いで後工程として、デナコールＥＸ−３１３とエピクロロヒドリンで架橋したセルロースゲル（３０ｍＬ）、２５重量％グリセロール水溶液（６０．０ｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（１．８８ｍＬ）を反応容器に添加し、５０℃で１５時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄することにより、多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上１５０μｍ以下に分級することにより、本願発明の多孔性架橋セルロースゲル１を得て、以下の測定に使用した。

（３）多孔性架橋セルロースゲル１の含水率、再膨潤率、エポキシ基含有量測定
前述の方法により、多孔性架橋セルロースゲル１の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は９３％、再膨潤率は１００％であった。また、前述の方法により多孔性架橋セルロースゲル１のエポキシ基含有量を前述の方法に従って測定した結果、エポキシ基含有量は測定法の定量下限以下であった。

（４）多孔性架橋セルロースゲル１のタンパク質分離能測定
多孔性架橋セルロースゲル１のタンパク質分離能を測定するため、多孔性架橋セルロースゲル１を水に懸濁したのち、リザーバーカラム及びポンプを用いて水を通液することにより、オムニフィット社製ガラスカラム（内径６．６ｍｍ、長さ２２０ｍｍ、容量７．５ｍＬ）に最密充填となるように充填した。次に、多孔性架橋セルロースゲルを充填したカラムをＨＰＬＣシステム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １０Ｓ）に接続し、０．１Ｍの塩化カリウムを含む０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる溶出液を通液することにより、カラム内を溶出液で平衡化した。

次に、測定対象タンパク質として、チトクロムＣ（シグマ社製、分子量１２４００）、アポフェリチン（シグマ社製、分子量４４３０００）及びチログロブリン（シグマ社製、分子量６６９０００）を用い、０．３ｍＬ／分の流速で測定対象タンパク質を注入し、Ｖｅを測定対象タンパク質の溶出容積、Ｖｃをカラム容積として算出される各タンパク質のＶｅ／Ｖｃ値を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９６、アポフェリチンは０．９２、チログロブリンは０．８９であった。

（５）多孔性架橋セルロースゲル１のカラム圧力損失測定
カラム圧力損失の測定には、前述の（４）で充填したカラムとＨＰＬＣシステムを使用した。カラム圧力損失測定は、カラムに０．５ｍＬ／分（線速度８８ｃｍ／時）の流速で２５℃の水を通液し、１分後のＨＰＬＣシステムのポンプ圧力を読み取ったのち、ＨＰＬＣシステムの最大流速である１０ｍＬ／分（線速度１７５５ｃｍ／時）まで１分間隔で流速を０．５ｍＬ／分ずつ上昇させ、各流速における１分後のポンプ圧力を読みとることで行なった。

なお、カラム圧力損失は、カラムに充填剤を充填した状態でカラムに水を通液した場合の各流速におけるＨＰＬＣシステムのポンプ圧力から、カラムに水を満たした状態でカラムに水を通液した場合の各流速におけるＨＰＬＣシステムのポンプ圧力を差し引くことにより算出した。多孔性架橋セルロースゲル１のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．１７ＭＰａであった。

実施例２ 多孔性架橋セルロースゲル２の製造
実施例２では、実施例１の後工程におけるグリセロール水溶液をソルビトール溶液に変更して多孔性架橋セルロースゲルを製造した。

エピクロロヒドリンによるセルロースゲルの架橋までは、実施例１に記載した方法と同様の方法で行なった。

後工程として、デナコールＥＸ−３１３とエピクロロヒドリンで架橋したセルロースゲル（３０ｍＬ）、ジメチルスルホキシドと水の混合溶液（１：４、重量比）に２０重量％のソルビトールを含んだ溶液（６０．０ｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（１．８８ｍＬ）を反応容器に添加し、５０℃で１５時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄することにより、多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上１５０μｍ以下に分級することにより、本願発明の多孔性架橋セルロースゲル２を得て、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル２の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は９３％、再膨潤率は１００％であった。また多孔性架橋セルロースゲル２のエポキシ基含有量を測定した結果、エポキシ基含有量は定量下限以下であった。

また実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル２のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９５、アポフェリチンは０．９０、チログロブリンは０．８９であった。

さらに実施例１と同様に、多孔性架橋セルロースゲル２のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．２０ＭＰａであった。

比較例１ 多孔性架橋セルロースゲル３の製造
比較例１では、工程（ｄ）のグリシジルエーテル類による架橋のみを行なう方法で多孔性架橋セルロースゲルを製造した。

デナコールＥＸ−３１３によるセルロースゲルの架橋までを実施例１に記載した方法と同様の方法で行ない、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上１５０μｍ以下に分級することにより、多孔性架橋セルロースゲル３を得て、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル３の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は９６％、再膨潤率は９３％であった。

また実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル３のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９１、アポフェリチンは０．７８、チログロブリンは０．７７であった。

さらに実施例１と同様に、多孔性架橋セルロースゲル３のカラム圧力損失を測定した結果、線速度２６３ｃｍ／時（流速１．５ｍＬ／分）におけるカラム圧力損失が１．２１ＭＰａとなり、流速を２．０ｍＬ／分に上げるとポンプの圧力がＨＰＬＣシステムの限界に達し、通液できなくなった。

比較例２ 多孔性架橋セルロースゲル４の製造
比較例２では、特許文献６の実施例２−３に記載の方法に従って架橋処理を行うことにより、多孔性架橋セルロースゲルを製造した。

実施例１で得られた多孔性未架橋セルロースゲルＡ（３０ｍＬ）を、水（３９．６ｇ）に無水硫酸ナトリウム（１８．９ｇ）を溶解した溶液に添加し、５０℃で２時間撹拌した。次に、反応溶液に水素化ホウ素ナトリウム（０．１８ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（０．７０ｍＬ）を添加し、５０℃で撹拌を継続しながら、エピクロロヒドリン（１５．０ｇ）と４８％水酸化ナトリウム水溶液（９．６０ｍＬ）を２５等分した量を１５分間隔で６時間かけて添加したのち、さらに５０℃で１６時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄することにより、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上１５０μｍ以下に分級することにより、多孔性架橋セルロースゲル４を得て、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル４の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は９１％、再膨潤率は１００％であった。また多孔性架橋セルロースゲル４のエポキシ基含有量を測定した結果、エポキシ基含有量は７．１μｍｏｌ／ｍＬであった。

また実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル４のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９７、アポフェリチンは０．９３、チログロブリンは０．９２であった。

さらに実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル４のカラム圧力損失を測定した結果、線速度１２００ｃｍ／時までは流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示したが、それ以上の流速ではカラム圧力損失が徐々に上昇し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．５１ＭＰａであった。

実施例１と２で製造した多孔性架橋セルロースゲル１と２及び比較例２で製造した多孔性架橋セルロースゲル４の、流速とカラム圧力損失の関係を示したグラフを図１に示した。図１から明らかのように、実施例１と２で製造した多孔性架橋セルロースゲル１と２のカラム圧力損失は、比較例２で製造した多孔性架橋セルロースゲル４よりも低いものであった。

実施例３ 多孔性架橋セルロースゲル５の製造
実施例３では、実施例１の後工程を行なわない方法で多孔性架橋セルロースゲルを製造した。

エピクロロヒドリンによるセルロースゲルの架橋までは、実施例１に記載した方法と同様の方法で行い、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上１５０μｍ以下に分級することにより、本願発明の多孔性架橋セルロースゲル５を得たのち、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル５の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は９４％、再膨潤率は１００％であった。また多孔性架橋セルロースゲル５のエポキシ基含有量を測定した結果、エポキシ基含有量は２５．２μｍｏｌ／ｍＬであった。

また実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル５のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９３、アポフェリチンは０．８９、チログロブリンは０．８７であった。

さらに実施例１と同様に、多孔性架橋セルロースゲル５のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．１８ＭＰａであった。

実施例４ 多孔性架橋セルロースゲル６の製造
実施例４から５は、パルプ由来セルロースを水酸化ナトリウム水溶液に溶解した５％セルロース溶液からの多孔性架橋セルロースゲルの製造方法及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。
（１）多孔性未架橋セルロースゲルＢの製造
旭化成社製セオラスＰＨ−１０１（０．５ｇ、平均重合度１７３）を、常温において８重量％水酸化ナトリウム水溶液（９．５ｍＬ）に懸濁し、−２０℃で凍結させたのち常温で溶解させる操作を２回繰り返すことにより均質なセルロース溶液を得た。以降、実施例１の（１）に記載した方法と同様の方法を繰り返すことで目的の多孔性未架橋セルロースゲルＢ（１２０ｍＬ）を得た。
（２）多孔性架橋セルロースゲル６の製造
（１）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルＢ（２３ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（２３．０ｇ）、水（２３．０ｇ）、ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３（４．６ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（１．５３ｍＬ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

デナコールＥＸ−３１３で架橋したセルロースゲル（２３ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（２３．０ｇ）、水（２３．０ｇ）、エピクロロヒドリン（１１．５ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（０．８４ｍＬ）を３０分間隔で８回添加し、水酸化ナトリウム水溶液を添加後、さらに５０℃で６０分間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

次いで後工程として、デナコールＥＸ−３１３とエピクロロヒドリンで架橋したセルロースゲル（２３ｍＬ）、２５重量％グリセロール水溶液（４６．０ｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（１．４４ｍＬ）を反応容器に添加し、５０℃で１５時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄することにより、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上１５０μｍ以下に分級することにより、本願発明の多孔性架橋セルロースゲル６を得たのち、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル６の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は８９％、再膨潤率は１００％であった。

また実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル６のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９２、アポフェリチンは０．８６、チログロブリンは０．８４であった。

さらに実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル６のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．１７ＭＰａであった。

実施例５ 多孔性架橋セルロースゲル７の製造
デナコールＥＸ−３１３（グリセロールポリグリシジルエーテル）の代わりにデナコールＥＸ−６１４Ｂ（ナガセケムテックス社製、ソルビトールポリグリシジルエーテル）を使用した以外は、実施例４に記載した方法と同様の方法で目的の多孔性架橋セルロースゲル７を得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上１５０μｍ以下に分級することにより、本願発明の多孔性架橋ゲル７を得たのち、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル７の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は８８％、再膨潤率は１００％であった。

また実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル７のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９２、アポフェリチンは０．８７、チログロブリンは０．８５であった。

さらに実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル７のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．２１ＭＰａであった。

実施例６ 多孔性架橋セルロースゲル８の製造
デナコールＥＸ−３１３（グリセロールポリグリシジルエーテル）の代わりにデナコールＥＸ−４１１（ナガセケムテックス社製、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル）を使用した以外は、実施例４に記載した方法と同様の方法で目的の多孔性架橋セルロースゲル８を得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上１５０μｍ以下に分級することにより、本願発明の多孔性架橋セルロースゲル８を得たのち、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル８の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は８８％、再膨潤率は１００％であった。

また実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル８のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９２、アポフェリチンは０．８５、チログロブリンは０．８４であった。

さらに実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル８のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．２０ＭＰａであった。

実施例７ 多孔性架橋セルロースゲル９の製造
実施例７から１０は、微生物セルロースを水酸化ナトリウムと尿素の混合水溶液に溶解した５％セルロース溶液からの多孔性架橋セルロースゲルの製造方法及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。

実施例７から実施例９では、水酸化ナトリウムと尿素の混合水溶液中の尿素濃度を変えた溶液を使用して微生物セルロース溶液を調製し、多孔性架橋セルロースゲルを製造した。
（１）多孔性未架橋セルロースゲルＣの製造
参考例１で得られた微生物セルロースＣ（０．５ｇ、平均重合度１６５）を、８重量％水酸化ナトリウムと１１重量％尿素の混合水溶液（９．５ｍＬ）に常温で懸濁し、４℃で２時間撹拌することにより、均質なセルロース溶液を得た。以降、実施例１の（１）に記載した方法と同様の方法を繰り返すことで目的の多孔性未架橋セルロースゲルＣ（１４０ｍＬ）を得た。
（２）多孔性架橋セルロースゲル９の製造
（１）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルＣ（６９．５ｇ）、ジメチルスルホキシド（６９．５ｇ）、水（６９．５ｇ）、ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３（１３．９ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４５％水酸化ナトリウム水溶液（４．９４ｍＬ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

デナコールＥＸ−３１３で架橋したセルロースゲル（６９．５ｇ）、ジメチルスルホキシド（６９．５ｇ）、エピクロロヒドリン（６９．５ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４５％水酸化ナトリウム水溶液（１．８０ｍＬ）を３０分間隔で８回添加し、水酸化ナトリウム水溶液を添加後、さらに５０℃で６０分間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

次いで後工程として、デナコールＥＸ−３１３とエピクロロヒドリンで架橋したセルロースゲル（６９．５ｇ）、２５重量％グリセロール水溶液（１３９．０ｇ）、４５％水酸化ナトリウム水溶液（４．６７ｍＬ）を反応容器に添加し、５０℃で１５時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄することにより、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上１５０μｍ以下に分級することにより、本願発明の多孔性架橋セルロースゲル９を得たのち、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル９の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は９２％、再膨潤率は１００％であった。

また実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル９のタンパク質分離能を測定した。測定対象タンパク質として、チトクロムＣ（シグマ社製、分子量１２４００）、アルブミン（シグマ社製、分子量６６０００）、アポフェリチン（シグマ社製、分子量４４３０００）及びチログロブリン（シグマ社製、分子量６６９０００）を用い、０．３ｍＬ／分の流速で測定対象タンパク質を注入し、各タンパク質のＶｅ／Ｖｃ値を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９２、アルブミンは０．８８、アポフェリチンは０．８６、チログロブリンは０．８５であった。

さらに実施例１と同様に、多孔性架橋セルロースゲル９のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．１２ＭＰａであった。

実施例８ 多孔性架橋セルロースゲル１０の製造
（１）多孔性未架橋セルロースゲルＤの製造
参考例１で得られた微生物セルロースＣ（０．５ｇ、平均重合度１６５）を、８重量％水酸化ナトリウムと２０重量％尿素の混合水溶液（９．５ｍＬ）に常温で懸濁し、１０℃で２時間撹拌することにより、均質なセルロース溶液を得た。以降、実施例１の（１）に記載した方法と同様の方法を繰り返すことで目的の多孔性未架橋セルロースゲルＤ（１２００ｍＬ）を得た。
（２）多孔性架橋セルロースゲル１０の製造
（１）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルＤ（４５０．０ｇ）、ジメチルスルホキシド（４５０．０ｇ）、水（４５０．０ｇ）、ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３（９０．０ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（３０．０ｍＬ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

デナコールＥＸ−３１３で架橋したセルロースゲル（４５０．０ｇ）、ジメチルスルホキシド（４５０．０ｇ）、エピクロロヒドリン（４５０．０ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（１０．５ｍＬ）を３０分間隔で８回添加し、水酸化ナトリウム水溶液を添加後、さらに５０℃で６０分間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

次いで後工程として、デナコールＥＸ−３１３とエピクロロヒドリンで架橋したセルロースゲル（４５０．０ｇ）、２５重量％グリセロール水溶液（９００．０ｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（２８．１ｍＬ）を反応容器に添加し、５０℃で１５時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄することにより、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上１５０μｍ以下に分級することにより、本願発明の多孔性架橋セルロースゲル１０を得たのち、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル１０の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は８９％、再膨潤率は１００％であった。

また実施例７と同様に多孔性架橋セルロースゲル１０のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．８９、アルブミンは０．８３、アポフェリチンは０．７８、チログロブリンは０．７３であった。

さらに実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル１０のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．１９ＭＰａであった。

実施例９ 多孔性架橋セルロースゲル１１の製造
（１）多孔性未架橋セルロースゲルＥの製造
参考例１で得られた微生物セルロースＣ（０．５ｇ、平均重合度１６５）を、８重量％水酸化ナトリウムと３２重量％尿素の混合水溶液（９．５ｍＬ）に常温で懸濁し、１０℃で２時間撹拌することにより、均質なセルロース溶液を得た。以降、実施例１の（１）に記載した方法と同様の方法を繰り返すことで目的の多孔性未架橋セルロースゲルＥ（１００ｍＬ）を得た。
（２）多孔性架橋セルロースゲル１１の製造
（１）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルＥ（２０ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（２０．０ｇ）、水（２０．０ｇ）、ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３（４．０ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（１．３３ｍＬ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

デナコールＥＸ−３１３で架橋したセルロースゲル（２０ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（２０．０ｇ）、エピクロロヒドリン（２０．０ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（０．４７ｍＬ）を３０分間隔で８回添加し、水酸化ナトリウム水溶液を添加後、さらに５０℃で６０分間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

次いで後工程として、デナコールＥＸ−３１３とエピクロロヒドリンで架橋したセルロースゲル（２０ｍＬ）、２５重量％グリセロール水溶液（４０．０ｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（１．２５ｍＬ）を反応容器に添加し、５０℃で１５時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄することにより、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上９０μｍ以下に分級することにより、本願発明の多孔性架橋セルロースゲル１１を得て、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル１１の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は９０％、再膨潤率は１００％であった。

また実施例７と同様に多孔性架橋セルロースゲル１１のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９１、アルブミンは０．８６、アポフェリチンは０．８０、チログロブリンは０．７６であった。

さらに実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル１１のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．２１ＭＰａであった
実施例１０ 多孔性架橋セルロースゲル１２の製造
実施例１０と実施例１１では、実施例９の後工程における水酸基を有する有機化合物の種類を変えて、多孔性架橋セルロースゲルを製造した。

エピクロロヒドリンによるセルロースゲルの架橋までは、実施例９に記載した方法と同様の方法で行なった。

次いで後工程として、デナコールＥＸ−３１３とエピクロロヒドリンで架橋したセルロースゲル（２０．０ｇ）、ジメチルスルホキシドと水の混合溶液（１：４、重量比）に２０重量％のソルビトールを含んだ溶液（４０．０ｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（１．２５ｍＬ）を反応容器に添加し、５０℃で１５時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄することにより、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上９０μｍ以下に分級することにより、本願発明の多孔性架橋セルロースゲル１２を得て、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル１２の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は９０％、再膨潤率は１００％であった。

また実施例７と同様に多孔性架橋セルロースゲル１２のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９３、アルブミンは０．８６、アポフェリチンは０．８１、チログロブリンは０．７７であった。

さらに実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル１２のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．２０ＭＰａであった。

実施例１１ 多孔性架橋セルロースゲル１３の製造
エピクロロヒドリンによるセルロースゲルの架橋までは、実施例９に記載した方法と同様の方法で行なった。

次いで後工程として、デナコールＥＸ−３１３とエピクロロヒドリンで架橋したセルロースゲル（３０．０ｇ）、デキストラン（シグマ社製、平均分子量４００００）の３０重量％水溶液（３０．０ｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（２．５ｍＬ）を反応容器に添加し、５０℃で１５時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄することにより、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上９０μｍ以下に分級することにより、本願発明の多孔性架橋セルロースゲル１３を得て、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル１３の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は９０％、再膨潤率は１００％であった。

また実施例７と同様に多孔性架橋セルロースゲル１３のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．８８、アルブミンは０．７９、アポフェリチンは０．７２、チログロブリンは０．６８であった。

さらに実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル１３のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．２１ＭＰａであった。

実施例１２ 多孔性架橋セルロースゲル１４の製造
実施例１２から１３は、微生物セルロース、コットン由来セルロース及びパルプ由来セルロースを水酸化ナトリウムと尿素の混合水溶液に溶解した６％セルロース溶液からの多孔性架橋セルロースゲルの製造方法及びクロマトグラフィー用充填剤としての特性評価に関するものである。

実施例１２では原料として微生物セルロースを使用した。
（１）多孔性未架橋セルロースゲルＦの製造
参考例１で得られた微生物セルロースＣ（０．４８ｇ、平均重合度１６５）を、８重量％水酸化ナトリウムと３２重量％尿素の混合水溶液（７．５２ｍＬ）に常温で懸濁し、１０℃で２時間撹拌することにより、均質なセルロース溶液を得た。以降、実施例１の（１）に記載した方法と同様の方法を繰り返すことで目的の多孔性未架橋セルロースゲルＦ（６０ｍＬ）を得た。
（２）多孔性架橋セルロースゲル１４の製造
（１）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルＦ（６０ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（６０．０ｇ）、水（６０．０ｇ）、ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３（１２．０ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（４．０ｍＬ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

デナコールＥＸ−３１３で架橋したセルロースゲル（６０ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（６０．０ｇ）、エピクロロヒドリン（１２．０ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（０．６９ｍＬ）を３０分間隔で８回添加し、水酸化ナトリウム水溶液を添加後、さらに５０℃で６０分間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

次いで後工程として、デナコールＥＸ−３１３とエピクロロヒドリンで架橋したセルロースゲル（６０ｍＬ）、２５重量％グリセロール水溶液（１２０．０ｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（３．７５ｍＬ）を反応容器に添加し、５０℃で１５時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄することにより、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上９０μｍ以下に分級することにより、本願発明の多孔性架橋セルロースゲル１４を得て、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル１４の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は９２％、再膨潤率は１００％であった。

また実施例７と同様に多孔性架橋セルロースゲル１４のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９４、アルブミンは０．８８、アポフェリチンは０．８４、チログロブリンは０．８０であった。

さらに実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル１４のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．２３ＭＰａであった。

実施例１３ 多孔性架橋セルロースゲル１５の製造
実施例１３では原料としてコットン由来セルロースを使用した。
（１）多孔性未架橋セルロースゲルＧの製造
ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製濾紙粉末Ｃタイプ（０．４８ｇ、平均重合度１７６）を、８重量％水酸化ナトリウムと３２重量％尿素の混合水溶液（７．５２ｍＬ）に常温で懸濁し、１０℃で２時間撹拌することにより、均質なセルロース溶液を得た。以降、実施例１の（１）に記載した方法と同様の方法を繰り返すことで目的の多孔性未架橋セルロースゲルＧ（５５ｍＬ）を得た。
（２）多孔性架橋セルロースゲル１５の製造
（１）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルＧ（５５ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（５５．０ｇ）、水（５５．０ｇ）、ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３（１１．０ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（３．６７ｍＬ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

デナコールＥＸ−３１３で架橋したセルロースゲル（５５ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（５５．０ｇ）、エピクロロヒドリン（１１．０ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（０．６３ｍＬ）を３０分間隔で８回添加し、水酸化ナトリウム水溶液を添加後、さらに５０℃で６０分間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

次いで後工程として、デナコールＥＸ−３１３とエピクロロヒドリンで架橋したセルロースゲル（５５ｍＬ）、２５重量％グリセロール水溶液（１１０．０ｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（３．４４ｍＬ）を反応容器に添加し、５０℃で１５時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄することにより、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上９０μｍ以下に分級することにより、本願発明の多孔性架橋セルロースゲル１５を得て、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル１５の含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は９１％、再膨潤率は１００％であった。

また実施例７と同様に多孔性架橋セルロースゲル１５のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９４、アルブミンは０．８９、アポフェリチンは０．８６、チログロブリンは０．８２であった。

さらに実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル１５のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．２３ＭＰａであった。

実施例１４ 多孔性架橋セルロースゲル１６の製造
実施例１４では原料としてパルプ由来セルロースを使用した。
（１）多孔性未架橋セルロースゲルＨの製造
旭化成社製セオラスＰＨ−１０１（０．３６ｇ、平均重合度１７３）を、８重量％水酸化ナトリウムと３２重量％尿素の混合水溶液（５．６４ｍＬ）に常温で懸濁し、１０℃で２時間撹拌することにより、均質なセルロース溶液を得た。以降、実施例１の（１）に記載した方法と同様の方法を繰り返すことで目的の多孔性未架橋セルロースゲルＨ（４０ｍＬ）を得た。
（２）多孔性架橋セルロースゲル１６の製造
（１）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルＨ（２７．０ｇ）、ジメチルスルホキシド（２７．０ｇ）、水（２７．０ｇ）、ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３（５．４ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（１．８０ｍＬ）を添加し、５０℃で１６時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

デナコールＥＸ−３１３で架橋したセルロースゲル（２７．０ｇ）、ジメチルスルホキシド（２７．０ｇ）、水（２７．０ｇ）、エピクロロヒドリン（５．４ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（３．６０ｍＬ）を一度に添加し、水酸化ナトリウム水溶液を添加後、さらに５０℃で４．５時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

次いで後工程として、デナコールＥＸ−３１３とエピクロロヒドリンで架橋したセルロースゲル（２７．０ｇ）、２５重量％グリセロール水溶液（２７．０ｇ）、４８％水酸化ナトリウム水溶液（１．１２ｍＬ）を反応容器に添加し、５０℃で１５時間撹拌した。撹拌終了後、反応溶液を４０℃以下に冷却したのち、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄することにより、目的の多孔性架橋セルロースゲルを得た。得られた多孔性架橋セルロースゲルはＪＩＳ標準篩いを使用した湿式分級法により４５μｍ以上９０μｍ以下に分級することにより、多孔性架橋セルロースゲル１６を得て、以下の測定に使用した。

実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲルの含水率と再膨潤率を測定した結果、含水率は９０％、再膨潤率は１００％であった。

また実施例７と同様に多孔性架橋セルロースゲル１６のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムｃに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．９３、アルブミンは０．８８、アポフェリチンは０．８５、チログロブリンは０．８１であった。

さらに実施例１と同様に多孔性架橋セルロースゲル１６のカラム圧力損失を測定した結果、ＨＰＬＣシステムの最大流速まで流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．３３ＭＰａであった。

比較例３ 市販多糖系充填剤の特性評価
比較例３では、市販の多糖系充填剤であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、架橋アガロースゲル、粒径４５−１６５μｍ）及びセルファインＧＣＬ−２０００（ＪＮＣ社製、架橋セルロースゲル、粒径４０−１３０μｍ）を用い、実施例１２から１４で製造したセルロース濃度が６％の多孔性架橋セルロースゲル１４から１６とのクロマトグラフィー用充填剤としての特性を比較した。

（１）含水率、再膨潤率測定
実施例１と同様の手法により、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ及びセルファインＧＣＬ−２０００の含水率と再膨潤率を測定した結果、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの含水率は９３％、再膨潤率は９８％であった。また、セルファインＧＣＬ−２０００の含水率は９２％、再膨潤率は９６％であった。

（２）タンパク質分離能測定
実施例７と同様の手法により、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムＣに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．８９、アルブミンは０．７６、アポフェリチンは０．６５、チログロブリンは０．５９であった。同様にセルファインＧＣＬ−２０００のタンパク質分離能を測定した結果、チトクロムＣに対するＶｅ／Ｖｃ値は０．７８、アルブミンは０．６２、アポフェリチンは０．５１、チログロブリンは０．４７であった。

（３）カラム圧力損失測定
実施例１と同様の手法によりＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのカラム圧力損失を測定した結果、線速度１２００ｃｍ／時までは流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示したが、それ以上の流速ではカラム圧力損失が徐々に上昇し、線速度１７５５ｃｍ／時でのカラム圧力損失は０．５５ＭＰａであった。同様に、セルファインＧＣＬ−２０００のカラム圧力損失を測定した結果、線速度６００ｃｍ／時までは流速とカラム圧力損失はほぼ直線関係を示したが、それ以上の流速ではカラム圧力損失が急激に上昇し、線速度７０２ｃｍ／時（流速４．０ｍＬ／分）におけるカラム圧力損失が０．２５ＭＰａとなり、流速を４．５ｍＬ／分に上げるとポンプの圧力がＨＰＬＣシステムの限界に達し、通液できなくなった。

実施例１２から１４で製造した多孔性架橋セルロースゲル１４から１６と、市販架橋アガロースゲル（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）及び市販架橋セルロースゲル（セルファイン ＧＣＬ−２０００）の、流速とカラムベッド高変化の関係を示したグラフを図２に示した。図２から明らかのように、実施例１２から１４で製造した多孔性架橋セルロースゲル１４から１６のカラム圧力損失は、市販架橋アガロースゲル及び市販架橋セルロースゲルよりも低いものであった。
以上の結果をまとめて表１〜４に示す。

実施例１５ プロテインＡの固定化と抗体吸着量の測定
（１）カルボキシル化多孔性架橋セルロースゲルの調製
実施例１２で製造した多孔性架橋セルロースゲル１４（１．０ｇ）、ジメチルスルホキシド（１．０ｇ）、エピクロロヒドリン（０．２ｇ）を反応容器に添加し、３０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（０．５５ｍＬ）を添加し、さらに３０℃で３時間撹拌することによりエポキシ化反応を行なった。反応終了後、グラスフィルターを使用して多量の水でろ過洗浄した。

次にエポキシ化した多孔性架橋セルロースゲル１４（１．０ｇ）と０．５Ｍのチオグリコール酸ナトリウム水溶液（３．０ｇ）を反応容器に添加し、５０℃で１５時間撹拌することによりカルボキシル化反応を行なった。反応終了後、グラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄したのち、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、水、０．０５Ｍの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（以下、ＭＥＳと表記）緩衝液（ｐＨ５．５）で順次ろ過洗浄することによりカルボキシル化多孔性架橋セルロースゲル１４Ｃ（１．０ｇ）を得た。

同様の手法により、実施例１３で製造した多孔性架橋セルロースゲル１５からカルボキシル化多孔性架橋セルロースゲル１５Ｃを、実施例１４で製造した多孔性架橋セルロースゲル１６からカルボキシル化多孔性架橋セルロースゲル１６Ｃを得た。

（２）カルボキシル化多孔性架橋セルロースゲルへのプロテインＡの導入
プロテインＡ固定化用ＮＨＳ溶液は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４８ｍｇ）を、０．０５ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５、１００ｍＬ）に溶解して調製した。また、プロテインＡ固定化用ＥＤＣ溶液は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２００ｍｇ）を、０．０５ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５、１００ｍＬ）に溶解して調製した。

０．０５ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したカルボキシル化多孔性架橋セルロースゲル１４Ｃ（１．０ｍＬ）、前述のＮＨＳ溶液（２．２ｍＬ）、プロテインＡ溶液（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製、１２．２ｍｇ）を反応容器に添加し、数分間撹拌したのち、反応溶液に前述のＥＤＣ溶液（０．４ｍＬ）を添加し、２５℃で３時間撹拌した。固定化反応終了後、０．０５ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）でろ過洗浄することによりプロテインＡを導入した多孔性架橋セルロースゲル１４Ｐを得た。

反応溶液及び洗浄液を回収し、２８０ｎｍの吸光度を測定することにより未反応のプロテインＡ量を求めたのち、反応に使用したプロテインＡ量から未反応のプロテインＡ量を差し引くことで多孔性架橋セルロースゲル１４ＰへのプロテインＡ導入量を算出した結果、多孔性架橋セルロースゲル１４Ｐに導入されたプロテインＡはゲル１ｍＬあたり１０．３ｍｇであった。

同様の手法により、カルボキシル化多孔性架橋セルロースゲル１５Ｃから多孔性架橋セルロースゲル１５Ｐを、カルボキシル化多孔性架橋セルロースゲル１６Ｃから多孔性架橋セルロースゲル１６Ｐを得た。また、前述の方法によりプロテインＡ導入量を算出した結果、多孔性架橋セルロースゲル１５Ｐに導入されたプロテインＡはゲル１ｍＬあたり１１．０ｍｇ、多孔性架橋セルロースゲル１６Ｐに導入されたプロテインＡはゲル１ｍＬあたり１１．１ｍｇであった。

（３）抗体吸着量の測定
抗体溶液の調製は、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、２．０ｍＬ）に濃度が１５０ｍｇ／ｍＬのガンマグロブリン製剤（一般財団法人化学及血清療法研究所製、１．０ｍＬ）を混合することで調製した。

０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したプロテインＡ固定化多孔性架橋セルロースゲル１４Ｐ（０．１ｍＬ）と前述の抗体溶液（０．４２ｍＬ）を容器に添加し、２０℃で６０分間撹拌することにより、セルロースゲルに抗体を吸着させた。

撹拌終了後、抗体を吸着させたゲルを０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、０．３ｍＬ）で４回洗浄したのち、回収した洗浄液の２８０ｎｍの吸光度測定により未吸着の抗体量を算出した。次に、抗体を吸着させたゲルを０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０、０．３ｍＬ）で４回洗浄することにより抗体を脱着した。回収した洗浄液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより抗体吸着量を算出した結果、多孔性架橋セルロースゲル１４Ｐの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり６０．５ｍｇであった。同様の手法により抗体吸着量を測定した結果、多孔性架橋セルロースゲル１５Ｐの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり７０．９ｍｇ、プロテインＡ固定化多孔性架橋セルロースゲル１６Ｐの抗体吸着量はゲル１ｍＬあたり６２．５ｍｇであった。

また、多孔性架橋セルロースゲル１５Ｐの抗体吸着量測定において、以下に示した式により抗体の回収率を算出した結果、回収率は９９％であった。従って、多孔性架橋セルロースゲル１５Ｐへの抗体の非特異的吸着はほとんどないことが明らかになった。

回収率（％）＝[（ゲルに未吸着の抗体量＋ゲルから脱着した抗体量）÷添加した抗体量]×１００

Claims (4)

1. 平均粒子径が２０μｍ以上３００μｍ以下であり、内径６．６ｍｍのクロマトグラフィー用カラムに高さ２２０ｍｍ±５ｍｍとなるように充填し、２５℃の水をカラム内に線速度１７５５ｃｍ／時で通液した条件でのカラム圧力損失が０．４ＭＰａ以下であることを特徴とする、多孔性架橋セルロースゲル。
2. 以下の工程を含むことを特徴とする、請求項１記載の多孔性架橋セルロースゲルの製造方法：
   （ａ）セルロースをアルカリ水溶液に溶解することにより、セルロース溶液を得る工程、
   （ｂ）工程（ａ）で得られたセルロース溶液と有機溶媒を混合することにより、セルロース分散液を得る工程、
   （ｃ）工程（ｂ）で得られたセルロース分散液中のセルロース溶液を凍結させることにより、多孔性未架橋セルロースゲルを得る工程、
   （ｄ）工程（ｃ）で得られた多孔性未架橋セルロースゲルを、グリシジルエーテル類と反応させることにより、多孔性部分架橋セルロースゲルを得る工程、
   （ｅ）工程（ｄ）で得られた多孔性部分架橋セルロースゲルを、セルロースの水酸基と反応し得る活性部位を２つ以上有する架橋剤と反応させることにより、多孔性架橋セルロースゲルを得る工程。
3. 請求項１記載の多孔性架橋セルロースゲルを含む、クロマトグラフィー用充填剤。
4. 請求項３記載のクロマトグラフィー用充填剤を用いることを特徴とする、タンパク質の精製方法。

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