JPWO2016117574A1 - 分離材 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] モノマ単位としてスチレン系モノマを含む多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層と、を備える分離材であって、上記分離材は、5%圧縮変形弾性率が100〜1000MPaであり、かつ細孔径分布におけるモードが0.1〜0.5μmである分離材。
[2] 吸湿度が1〜30質量%である、[1]に記載の分離材。
[3] 多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える分離材であって、上記被覆層が、水酸基を有する高分子を含み、湿潤状態において上記分離材を50mNで圧縮した際の圧縮変形率が粒径の30%未満であり、上記分離材を50mNで圧縮した際における乾燥状態の圧縮回復率に対する湿潤状態の圧縮回復率の比が0.8以上である、分離材。
[4] 多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える分離材であって、上記被覆層が、水酸基を有する高分子を含み、湿潤状態における上記分離材の5%圧縮変形弾性率が100MPa以上であり、上記分離材の湿潤状態の5%圧縮変形弾性率に対する乾燥状態の5%圧縮変形弾性率の比が1.85以上である、分離材。
[5] 細孔径分布におけるモード径が0.05〜0.5μmである、[3]又は[4]に記載の分離材。
[6] 上記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が10〜500μmである、[1]〜[5]のいずれかに記載の分離材。
[7] 上記多孔質ポリマ粒子における粒径の変動係数が3〜15%である、[1]〜[6]のいずれかに記載の分離材。
[8] 分離材の平均粒径が10〜500μmである、[1]〜[7]のいずれかに記載の分離材。
[9] 分離材の細孔容積が30体積%以上である、[1]〜[8]のいずれかに記載の分離材。
[10] 多孔質ポリマ粒子の比表面積が30m2/g以上である、[1]〜[9]のいずれかに記載の分離材。
[11] 分離材の比表面積が30m2/g以上である、[1]〜[10]のいずれかに記載の分離材。
[12] 上記多孔質ポリマ粒子が、モノマ単位として、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で50質量%以上含む、[1]〜[11]のいずれかに記載の分離材。
[13] 上記水酸基を有する高分子が多糖類又はその変性体である、[1]〜[12]のいずれかに記載の分離材。
[14] 上記水酸基を有する高分子がアガロース又はその変性体である、[1]〜[12]のいずれかに記載の分離材。
[15] 上記水酸基を有する高分子が架橋されている、[1]〜[14]のいずれかに記載の分離材。
[16] 上記多孔質ポリマ粒子1g当たり30〜500mgの上記被覆層を備える、[1]〜[15]のいずれかに記載の分離材。
[17] カラムに充填した場合、カラム圧が0.3MPaのときに通液速度が800cm/h以上である、[1]〜[16]のいずれかに記載の分離材。
[18] カラムと、該カラムに充填された[1]〜[18]のいずれかに記載の分離材とを備える、分離用カラム。
<分離材>
以下に、第1実施形態に係る分離材について説明する。本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える。本実施形態によれば、タンパク質の非特異吸着を低減し、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れる分離材、及びこれを用いた分離用カラムを提供することができる。なお、本実施形態において、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、多孔質化剤を含むモノマを硬化させた粒子であり、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、スチレン系モノマを使用することができる。具体的なモノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。
1)超音波分散装置を使用して粒子を水(界面活性剤等の分散剤を含む)に分散させ、1質量%の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
2)粒度分布計(シスメックスフロー、シスメックス株式会社製)を用いて、上記分散液中の粒子約1万個の画像により平均粒径及び粒径のC.V.(変動係数)を測定する。
本実施形態の被覆層は、水酸基を有する高分子を含む。水酸基を有する高分子で多孔質ポリマ粒子を被覆することによりカラム圧の上昇を抑制することができるとともに、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量が良好となる傾向にある。さらに、水酸基を有する高分子が架橋されていると、カラム圧の上昇をより抑制することが可能となる。
水酸基を有する高分子は、1分子中に2個以上の水酸基を有することが好ましく、親水性高分子であることがより好ましい。水酸基を有する高分子としては、例えば、多糖類、ポリビニルアルコール等が挙げられる。多糖類としては、好ましくはアガロース、デキストラン、セルロース、キトサン等が挙げられる。水酸基を有する高分子としては、例えば重量平均分子量1万〜20万程度のものが使用できる。
水酸基を有する高分子を含む被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。
まず、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させる。水酸基を有する高分子の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、5〜20(mg/mL)が好ましい。
次いで、架橋剤を加えて多孔質ポリマ粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成する。このとき、架橋体は、水酸基を有する3次元架橋網目構造を有する。
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド(プロテインA)等を表面上の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
(吸湿後分離材質量−1)g/1g×100=吸湿度(%)
微小圧縮試験機(Fisher社製)を用いて、室温(25℃)条件にて荷重負荷速度1mN/秒で、四角柱の平滑な端面(50μm×50μm)により粒子を50mNまで圧縮したときの荷重及び圧縮変位を測定する。得られた測定値から、粒子が5%圧縮変形したときの圧縮弾性率(5%K値)を下記式により求めることができる。また、上記測定中の変位量が最も大きく変化する点の荷重を破壊強度(mN)とする。
5%K値(MPa)=(3/21/2)・F・S−3/2・R−1/2
F:架橋ポリマ粒子が40%圧縮変形したときの荷重(mN)
S:架橋ポリマ粒子が40%圧縮変形したときの圧縮変位(mm)
R:架橋ポリマ粒子の半径(mm)
以下に、第2実施形態及び第3実施形態に係る分離材について説明する。本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、前記被覆層が、水酸基を有する高分子を含む。なお、本実施形態において、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。例えば、多孔質ポリマ粒子の外側の表面、及び/又は、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面に、水酸基を有する高分子がコーティングされていてもよい。
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、例えば、モノマを重合することにより得られる重合体を含み、モノマ由来の構造単位を有することができる。多孔質ポリマ粒子は、粒子の全質量基準で50質量%以上のポリマを含んでいてもよく、ポリマからなる粒子であってもよい。また、多孔質ポリマ粒子は、モノマと多孔質化剤とを含む組成物を重合させた後、多孔質化剤を除去することによって得ることができる。多孔質ポリマ粒子は、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、(メタ)アクリル系モノマ、スチレン系モノマ等のビニルモノマを使用することができる。具体的なモノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。
本実施形態の被覆層は、水酸基を有する高分子(例えば水溶性高分子)を含む。水酸基を有する高分子で多孔質ポリマ粒子を被覆することによりカラム圧の上昇を抑制することができると共に、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量を、天然高分子を用いた場合と同等又はそれ以上とすることができる。さらに、水酸基を有する高分子が架橋されていると、カラム圧の上昇をさらに抑制することが可能となる。
水酸基を有する高分子を含む被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。被覆層は、水酸基を有する高分子を多孔質ポリマ粒子にコーティングさせることで形成することができる。被覆層の形成方法としては、例えば、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させ、未吸着分を除去後、架橋剤により架橋反応させて、細孔内に担持させる方法が挙げられる。水酸基を有する高分子の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、5〜20mg/mLが好ましい。
次いで、架橋剤を加えて、多孔質ポリマ粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成する。例えば、架橋剤を加えて、多孔質ポリマ粒子の表面に吸着した水酸基を有する高分子を架橋反応させて、高分子の架橋ゲルを形成させる。このとき、架橋体において、例えば、水酸基を有する高分子が3次元架橋網目構造を有するようになる。
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド(プロテインA)等を粒子表面の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法としては、例えば、ハロゲン化アルキル化合物(ハロゲン化アルキル基含有化合物)を用いる方法が挙げられる。
1)超音波分散装置を使用して粒子を水(界面活性剤等の分散剤を含む)に分散させ、1質量%の粒子を含む分散液を調製する。
2)粒度分布計(シスメックスフローFPIA−3000、シスメックス株式会社製)を用いて、上記分散液中の粒子約1万個の画像により平均粒径と粒径のC.V.(変動係数)を測定する。
第2実施形態において、湿潤状態において本実施形態の分離材を50mNで圧縮した際の圧縮変形率は、粒径の30%未満である。また、本実施形態の分離材を50mNで圧縮した際における乾燥状態の圧縮回復率に対する湿潤状態の圧縮回復率の比(圧縮回復率比。湿潤状態/乾燥状態)は0.8以上である。第2実施形態によれば、通液性に優れると共に、タンパク質の非特異吸着を低減し、かつ、タンパク質吸着量に優れる分離材、及びこれを用いた分離用カラムを提供することができる。ここで、「湿潤状態」とは、水分により飽和した状態を指す。「乾燥状態」とは、水分を含まない状態(例えば、真空、加熱乾燥等により水分が除かれた状態)を指す。湿潤状態を維持するには、測定する直前に水中から分離材を取り出して使用することが好ましい。
圧縮変形率(%)=(50mN圧縮時の粒径の変形量)/平均粒径×100・・(1)
圧縮回復率(%)=(50mNから0mNまで除荷した際の変位量)/(50mN圧縮時の粒径の変形量)・・(2)
圧縮回復率比=(湿潤状態の圧縮回復率)/(乾燥状態の圧縮回復率)・・(3)
第3実施形態において、湿潤状態における分離材の5%圧縮変形弾性率は、100MPa以上である。また、本実施形態の分離材の湿潤状態の5%圧縮変形弾性率に対する乾燥状態の5%圧縮変形弾性率の比(5%圧縮変形弾性率比、乾燥状態/湿潤状態)は1.85以上である。第3実施形態によれば、タンパク質の非特異吸着を低減し、かつ、タンパク質吸着量に優れる分離材、及び、これを用いた分離用カラムを提供することができる。ここで、「湿潤状態」とは、水分により飽和した状態を指す。「乾燥状態」とは、水分を含まない状態(例えば、真空、加熱乾燥等により水分が除かれた状態)を指す。湿潤状態を維持するには、測定する直前に水中から分離材を取り出して使用することが好ましい。
微小圧縮試験機(Fisher社製)を用いて、室温(25℃)にて荷重負荷速度1mN/秒で四角柱の平滑な端面(50μm×50μm)により分離材を0mNから50mNまで圧縮したときの荷重及び圧縮変位を測定する。得られた測定値から、分離材が5%圧縮変形したときの圧縮変形弾性率(5%K値)を下記式により求めることができる。
5%K値(MPa)=(3/21/2)×F×S−3/2×R−1/2
F:分離材が5%圧縮変形したときの荷重(mN)
S:分離材が5%圧縮変形したときの圧縮変位(μm)
R:分離材の半径(μm)
5%圧縮変形弾性率比=(乾燥状態の5%圧縮変形弾性率)/(湿潤状態の5%圧縮変形弾性率)
(実施例1)
<多孔質ポリマ粒子1の合成>
500mLの三口フラスコに、純度96%のジビニルベンゼン(新日鉄住金化学株式会社製、商品名:DVB960)を16g、スパン80を6g、過酸化ベンゾイルを0.64g加え、ポリビニルアルコール(0.5質量%)水溶液を調製した。マイクロプロセスサーバーを使用してこの水溶液を乳化後、得られた乳化液をフラスコに移し、80℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約8時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、アセトン洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子1を得た。得られた多孔質ポリマ粒子1の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、上述の方法で平均粒径及び粒径のC.V.(変動係数)を算出した。結果を表1に示す。
アガロース水溶液(2質量%)100mLに水酸化ナトリウム4g及びグリシジルフェニルエーテル0.14gを投入して70℃で12時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで再沈殿させ、洗浄した。
20mg/mLの変性アガロース水溶液に多孔質ポリマ粒子1を、水溶液70mLに対して多孔質ポリマ粒子1を1gの割合で投入し、55℃で24時間撹拌して、多孔質ポリマ粒子1に変性アガロースを吸着させた。吸着後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。粒子への変性アガロースの吸着量は乾燥させた粒子の熱重量減少を測定し、算出した。
変性アガロースは次のようにして架橋した。エチレングリコールジグリシジルエーテル及び水酸化ナトリウムの濃度がそれぞれ0.64M、0.4Mである水溶液に、水溶液35mLに対して変性アガロースが吸着した多孔質ポリマ粒子1を1gの割合で投入し、24時間30℃にて撹拌した。その後、2質量%の熱したドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で洗浄し、分離材を得た。得られた分離材を乾燥後、熱重量分析により多孔質粒子1g当たりの被覆層の質量を測定した。
得られた分離材0.5gをBSA(Bovine Serum Albumin)濃度20mg/mLのリン酸緩衝液(pH7.4)50mLに投入し、24時間室温で撹拌を行った。その後、遠心分離で上澄みをとり、分光光度計でろ液のBSA濃度を測定することにより、分離材に吸着したBSA量を非特異吸着量として算出した。BSAの濃度は分光光度計により280nmの吸光度から確認した。結果を表2に示す。
得られた分離材を、遠心分離することにより水を除去した後、5Mの水酸化ナトリウム水に投入し、室温で1時間放置した。ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩を所定量溶解させた16mLの水に分散させ、さらにイソプロピルアルコール128mLと混合して、水酸化ナトリウム含浸状態の複合体に加えた。温度を70℃まで上げ、撹拌しながら5時間反応させた。反応終了後、ろ過、水洗し、ジエチルアミノエチル(DEAE)基をイオン交換基として有するDEAE変性分離材を得た。得られたDEAE変性分離材の平均細孔径及び比表面積を水銀圧入法にて測定した。結果を表2に示す。
得られたDEAE変性分離材を濃度30質量%のスラリー(溶媒:メタノール)としてφ7.8×300mmのステンレスカラムに15分かけて充填した。その後、カラムに流速を変えながら水を流し、流速とカラム圧との関係を測定し、0.3MPa時の通液速度(線流速)を測定した。結果を表2に示す。
q10=cfF(t10−t0)/VB
q10:10%breakthroughにおける動的吸着量(mg/mL wet resin)
cf:注入しているBSA濃度(mg/mL)
F:流速(mL/min)
VB:ベッド体積(mL)
t10:10%breakthroughにおける時間(min)
t0:BSA注入開始時間(min)
得られたDEAE変性分離材を0.5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で24時間撹拌し、リン酸緩衝液で洗浄後、カラム特性評価と同様の条件にて充填した。BSAの10%breakthrough動的吸着量を測定し、アルカリ処理前の動的吸着量と比較した。動的吸着量の減少率が3%以下であるものを「A」、3%超20%以下であるものを「B」、20%超であるものを「C」とした。結果を表2に示す。
吸湿度、5%圧縮変形弾性率は、上述の方法で測定した。結果を表2に示す。
スパン80の使用量を8gに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子2を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子2を、多孔質ポリマ粒子1と同様の方法で処理することによって、分離材及びDEAE変性分離材を得た。分離材及びDEAE変性分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
ジビニルベンゼン(16g)を、ジビニルベンゼン12g及びオクタノール4gに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子3を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子3を多孔質ポリマ粒子1と同様の方法で処理することによって、分離材及びDEAE変性分離材を得た。分離材及びDEAE変性分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
スパン80の使用量を4gに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子4を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子4を多孔質ポリマ粒子1と同様の方法で処理することによって、分離材及びDEAE変性分離材を得た。分離材及びDEAE変性分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
スパン80の使用量を3gに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子5を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子5を多孔質ポリマ粒子1と同様の方法で処理することによって、分離材及びDEAE変性分離材を得た。分離材及びDEAE変性分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
ジビニルベンゼン(16g)及びスパン80(6g)を、ジビニルベンゼン(4g)、ジヒドロキシプロピルメタクリレート(8g)及びスパン80(4g)に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子6を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子6を、水酸基を有する高分子(アガロース)による被覆層の形成及び架橋を行わずにDEAE変性することによって、分離材を得た。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
市販のアガロース粒子(Capto DEAE:GEヘルスケア)を、多孔質ポリマ粒子7として使用した。また、多孔質ポリマ粒子7をそのまま分離材として用いた。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
ジビニルベンゼン(16g)及びスパン80(6g)を、2,3−ジヒドロキシプロピルメタクリレート(11.2g)、エチレングリコールジメタクリレート(4.8g)及びスパン80(5g)に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子8を合成した。洗浄後の多孔質ポリマ粒子8(4g)を、デキストラン(分子量15万)1g、水酸化ナトリウム0.6g及び水素化ホウ素ナトリウム0.15gを蒸留水に溶解させた溶液6gに加えて、多孔質ポリマ粒子8の細孔内に含浸させた。得られたデキストラン溶液含浸重合体を、1質量%エチルセルローストルエン溶液1Lに加えて撹拌し、分散、懸濁せしめた。得られた懸濁液中に、エピクロルヒドリン5mLを加えて50℃に昇温し、この温度で6時間撹拌して、多孔質ポリマ粒子8の細孔内に含浸されているデキストランを架橋反応させた。反応終了後、懸濁液をろ過して生成ゲル状物を分離し、トルエン、エタノール、蒸留水で順次洗浄することによって、分離材を得た。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
ジビニルベンゼン(16g)を、ジビニルベンゼン(新日鉄住金株式会社製、商品名:DVB960)4g及びスチレン12gに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして多孔質ポリマ粒子9を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子9を、多孔質ポリマ粒子1と同様の方法で処理することによって、分離材を得た。分離材について、実施例1と同様の評価を行った。
<実施例6>
(多孔質ポリマ粒子10の合成)
500mLの三口フラスコに、モノマとして純度96質量%のジビニルベンゼン(DVB960、新日鉄住金化学株式会社)16g、多孔質化剤としてヘキサノール16g及びトルエン16g、並びに、開始剤として過酸化ベンゾイル0.64gを、分散安定剤であるポリビニルアルコール水溶液(0.5質量%)に加えた。次いで、マイクロプロセスサーバーを使用してこのポリビニルアルコール水溶液を乳化した。得られた乳化液をフラスコに移し、80℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約8時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子10を得た。得られた多孔質ポリマ粒子10の平均粒径をフロー型粒径測定装置(FPIA−3000、シスメックス株式会社製)で測定し、平均粒径及び粒径のC.V.値を算出した(表3)。
アガロース水溶液(2質量%)100mLに、水酸化ナトリウム4gと、グリシジルフェニルエーテル0.14gとを加え、70℃で12時間反応させることにより、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで沈殿させ、洗浄した。
DEAE変性分離材をφ7.8×300mmのステンレスカラムにスラリー(溶媒:メタノール)濃度30質量%にて15分かけて充填した。その後、流速を変えて水をカラムに流し、流速とカラム圧との関係を測定し、カラム圧0.3MPa時の線流速(カラム流速)を測定した。結果を表5に示す。
q10=cfF(t10−t0)/VB
q10:10%breakthroughにおける動的吸着量(mg/mL wet resin)
cf:注入しているBSA濃度(mg/mL)
F:流速(mL/min)
VB:ベッド体積(mL)
t10:10%breakthroughにおける時間(min)
t0:BSA注入開始時間(min)
R=1.18×(TR2−TR1)/(W(1/2)1+W(1/2)2)
R:分離度
TR1、TR2:2成分の保持時間(TR1<TR2)
W(1/2)1、W(1/2)2:それぞれのピークの半値幅
多孔質化剤としてヘキサノール18g及びトルエン14gを使用した以外は多孔質ポリマ粒子10の合成と同様の方法で、多孔質ポリマ粒子11を合成し、平均粒径及び粒径C.V.を測定した。また、多孔質ポリマ粒子11を使用した以外は実施例6と同様にDEAE変性分離材の作製及び評価を行い、実施例7とした。結果を表3〜5に示す。
多孔質化剤としてヘキサノール20g及びトルエン15gを使用した以外は多孔質ポリマ粒子10の合成と同様の方法で、多孔質ポリマ粒子12を合成し、平均粒径及び粒径C.V.を測定した。また、多孔質ポリマ粒子12を使用した以外は実施例6と同様にDEAE変性分離材の作製及び評価を行い、実施例8とした。結果を表3〜5に示す。
多孔質化剤としてヘキサノール25g及びトルエン10gを使用した以外は多孔質ポリマ粒子10の合成と同様の方法で、多孔質ポリマ粒子13を合成し、平均粒径及び粒径C.V.を測定した。また、多孔質ポリマ粒子13を使用した以外は実施例6と同様にDEAE変性分離材の作製及び評価を行い、実施例9とした。結果を表3〜5に示す。
マイクロプロセスサーバー乳化条件を変更し、粒径を調整した以外は多孔質ポリマ粒子10の合成と同様の方法で、多孔質ポリマ粒子14を合成し、平均粒径及び粒径C.V.を測定した。また、多孔質ポリマ粒子14を使用した以外は実施例6と同様にDEAE変性分離材の作製及び評価を行い、実施例10とした。結果を表3〜5に示す。
モノマとしてジビニルベンゼン4g及びグリシジルメタクリレート12gを使用した以外は多孔質ポリマ粒子10の合成と同様の方法で、多孔質ポリマ粒子15を合成し、平均粒径及び粒径C.V.を測定した。得られた多孔質ポリマ粒子15を水及びアセトンにより洗浄を行った。乾燥後、5gの多孔質ポリマ粒子15を50vol%のジエチルアミン水溶液に30℃で24時間浸漬し、グリシジル基をDEAE変性させた。その後、DEAE変性させた多孔質ポリマ粒子15を50vol%のエタノールアミン/メタノール溶液に30℃で24時間浸漬し、残存グリシジル基をブロッキングした。得られた粒子を洗浄した後、実施例6と同様に評価を行い、比較例5とした。結果を表3〜5に示す。
市販されているアガロース粒子(CaptoDEAE、GEヘルスケア製)を多孔質ポリマ粒子16として用いて実施例6と同様に評価を行い、比較例6とした。
濃度160mg/mLのデキストラン水溶液2mLに多孔質ポリマ粒子15を1gの割合で投入し、25℃で15時間撹拌することによって、デキストランを多孔質ポリマ粒子15に含浸させた。ろ過を行った後、デキストランを含浸した多孔質ポリマ粒子15を、1質量%エチルセルローストルエン溶液1Lに加えて撹拌し、分散及び懸濁させた。得られた懸濁液中に、エピクロロヒドリン5mLを加えて50℃に昇温し、この温度で6時間撹拌して、多孔質ポリマ粒子15の細孔内に含浸されているデキストランを架橋反応させた。反応終了後、懸濁液をろ過して生成ゲル状物を分離し、トルエン、エタノール、蒸留水で順次洗浄することによって、分離材を得た。分離材について、実施例6と同様の評価を行った。結果を表4及び5に示す。
<実施例11>
(多孔質ポリマ粒子17の合成)
500mLの三口フラスコに、モノマとして純度96質量%のジビニルベンゼン(DVB960、新日鉄住金化学株式会社)16g、多孔質化剤としてヘキサノール16g及びジエチルベンゼン16g、並びに、開始剤として過酸化ベンゾイル0.64gを、分散安定剤であるポリビニルアルコール水溶液(0.5質量%)に加えた。次いで、マイクロプロセスサーバーを使用してこのポリビニルアルコール水溶液を乳化した。得られた乳化液をフラスコに移し、80℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約8時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子を得た。得られた多孔質ポリマ粒子の平均粒径をフロー型粒径測定装置(FPIA−3000、シスメックス株式会社製)で測定し、平均粒径及び粒径のC.V.値を算出した。平均粒径は89μmであり、粒径のC.V.値は10%であった。また、得られた多孔質ポリマ粒子の空隙率、細孔径(モード径)及び比表面積を水銀圧入法にて測定した。結果を表6に示す。
アガロース水溶液(2質量%)100mLに、水酸化ナトリウム4gと、グリシジルフェニルエーテル0.14gとを加え、70℃で12時間反応させることにより、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで沈殿させ、洗浄した。
粒子表面及び細孔内部に吸着したアガロースを次のようにして架橋させた。エチレングリコールジグリシジルエーテル0.64M及び水酸化ナトリウム0.4Mを含む水溶液に、水溶液35mLに対して粒子1gの割合で粒子を投入し、室温で10時間撹拌した。その後、加熱した2質量%のドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で洗浄して分離材を得た。
分離材を含む分散液(水懸濁液)について、遠心分離を行って水を除去した。得られた分離材(乾燥質量20g)を、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩を所定量(30g)溶解させた水溶液100mLに分散させ、70℃で10分間撹拌した。その後、分離材が分散した当該水溶液に、70℃に加温した5MのNaOH水溶液100mLを添加し、撹拌しながら1時間反応させた。反応終了後、生成物をろ別し、水/エタノール(体積比8/2)で2回洗浄し、ジエチルアミノエチル(DEAE)基をイオン交換基として有するDEAE変性分離材を得た。
DEAE変性分離材の細孔容積(空隙率)、細孔径及び比表面積を水銀圧入法にて測定した。結果を表7に示す。
DEAE変性分離材のイオン交換容量を以下のように測定した。5mL容量のDEAE変性分離材を0.1N水酸化ナトリウム水溶液20mLに1時間浸漬し、室温で撹拌した。その後、溶液のpHが7以下となるように水で洗浄を行った。得られた粒子を0.1N塩酸20mLに浸漬し、1時間撹拌させた。粒子をろ過後、ろ液の塩酸水溶液を中和滴定することにより粒子の交換容量を測定した。結果を表7に示す。
微小圧縮試験機(Fisher製)を用いて、室温(25℃)にて荷重負荷速度1mN/秒で四角柱の平滑な端面(50μm×50μm)により湿潤状態及び乾燥状態のDEAE変性分離材を0mNから50mNまで圧縮し、DEAE変性分離材の5%圧縮変形弾性率と5%圧縮変形弾性率比とを測定した。結果を表8に示す。
DEAE変性分離材をφ7.8×300mmのステンレスカラムにスラリー(溶媒:メタノール)濃度30質量%にて15分かけて充填した。その後、流速を変えて水をカラムに流し、流速とカラム圧との関係を測定し、カラム圧0.3MPa時の線流速(カラム流速)を測定した。結果を表7に示す。
q10=cfF(t10−t0)/VB
q10:10%breakthroughにおける動的吸着量(mg/mL wet resin)
cf:注入しているBSA濃度(mg/mL)
F:流速(mL/min)
VB:ベッド体積(mL)
t10:10%breakthroughにおける時間(min)
t0:BSA注入開始時間(min)
DEAE変性分離材0.2gをBSA濃度24mg/mLのTris−塩酸緩衝液(pH8.0)20mLに投入し、24時間室温で撹拌を行った。その後、遠心分離で上澄みをとった後、分光光度計でろ液のBSA濃度を測定した。この測定値から分離材に吸着したBSA量を算出した。BSAの濃度は、分光光度計により280nmの吸光度から確認した。非特異吸着量は、1mg/粒子mL以下であれば「A」と評価し、1mg/粒子mLより大きく10mg/粒子mL未満であれば「B」と評価し、10mg/粒子mL以上であれば「C」と評価した。結果を表9に示す。
DEAE変性分離材を0.5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で24時間撹拌し、Tris−塩酸緩衝液で洗浄後、カラム特性評価と同様の条件にてカラムに充填した。BSAの10%breakthrough動的吸着量を測定し、アルカリ処理前の動的吸着量と比較した。動的吸着量の減少が3%以下であれば「A」と評価し、3%より大きく20%未満であれば「B」と評価し、20%以上であれば「C」と評価した。結果を表9に示す。
カラム特性評価と同様の条件にてカラムに充填した。800cm/hの流速で水をカラムに流し、カラム圧を測定後、3000cm/hに流速を上昇させ、1時間通液させた。再度800cm/hにカラム圧を下げた際に、カラム圧が初期値(3000cm/hに流速を上げる前)より10%以上上昇した場合を「B」、カラム圧の上昇量が10%未満である場合を「A」とした。結果を表9に示す。
アガロースの架橋においてエチレングリコールジグリシジルエーテルの濃度を0.32Mに変更した以外は実施例11と同様にしてDEAE変性分離材の作製及び評価を行った。
アガロースの架橋においてエチレングリコールジグリシジルエーテルの濃度を1.28Mに変更した以外は実施例11と同様にしてDEAE変性分離材の作製及び評価を行った。
被覆層の形成においてアガロース水溶液の濃度を0.5質量%に変更した以外は、実施例11と同様にしてDEAE変性分離材の作製及び評価を行った。
アガロースの架橋においてエチレングリコールジグリシジルエーテルの濃度を6.4Mに変更した以外は実施例11と同様にしてDEAE変性分離材の作製及び評価を行った。
Claims (18)
- モノマ単位としてスチレン系モノマを含む多孔質ポリマ粒子と、
該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層と、を備える分離材であって、
前記分離材は、5%圧縮変形弾性率が100〜1000MPaであり、かつ細孔径分布におけるモード径が0.1〜0.5μmである分離材。 - 吸湿度が1〜30質量%である、請求項1に記載の分離材。
- 多孔質ポリマ粒子と、
該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える分離材であって、
前記被覆層が、水酸基を有する高分子を含み、
湿潤状態において前記分離材を50mNで圧縮した際の圧縮変形率が粒径の30%未満であり、
前記分離材を50mNで圧縮した際における乾燥状態の圧縮回復率に対する湿潤状態の圧縮回復率の比が0.8以上である、分離材。 - 多孔質ポリマ粒子と、
該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備える分離材であって、
前記被覆層が、水酸基を有する高分子を含み、
湿潤状態における前記分離材の5%圧縮変形弾性率が100MPa以上であり、
前記分離材の湿潤状態の5%圧縮変形弾性率に対する乾燥状態の5%圧縮変形弾性率の比が1.85以上である、分離材。 - 細孔径分布におけるモード径が0.05〜0.5μmである、請求項3又は4に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が10〜500μmである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子における粒径の変動係数が3〜15%である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記分離材の平均粒径が10〜500μmである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記分離材の細孔容積が30体積%以上である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子の比表面積が30m2/g以上である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記分離材の比表面積が30m2/g以上である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子が、モノマ単位として、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で50質量%以上含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記水酸基を有する高分子が多糖類又はその変性体である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記水酸基を有する高分子がアガロース又はその変性体である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記水酸基を有する高分子が架橋されている、請求項1〜14のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子1g当たり30〜500mgの前記被覆層を備える、請求項1〜15のいずれか一項に記載の分離材。
- カラムに充填した場合、カラム圧が0.3MPaのときに通液速度が800cm/h以上である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の分離材。
- カラムと、該カラムに充填された請求項1〜17のいずれか一項に記載の分離材とを備える、分離用カラム。
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