JP5897228B2 - 腎細胞癌の予後判定方法 - Google Patents

Description

本発明は、メチル化ＤＮＡの検出を利用した腎細胞癌の予後判定方法に関する。

近年、ＤＮＡの異常なメチル化ががん化に深く関与することが明らかになり、注目を集めている。癌細胞における特徴的なエピジェネティック異常として、一部の遺伝子プロモーター領域におけるＣｐＧアイランドの異常なＤＮＡメチル化が知られている。ＣｐＧアイランドは、ホスホジエステル結合（ｐ）を介したシトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）の２塩基配列が高頻度で出現する領域のことであり、遺伝子上流のプロモーター領域に存在することが多い。ＣｐＧアイランドの異常なＤＮＡメチル化は、がん抑制遺伝子の不活化などを通じて発がんに関与する。大腸癌、胃癌等において、臨床病理学的因子と相関したＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化亢進が報告されており（非特許文献１〜４）、このようなタイプの癌は、ＣｐＧアイランドメチル化形質（ＣＩＭＰ）陽性癌と呼ばれる。

既に確立されたメチル化ＤＮＡの解析方法として、亜硫酸水素塩（重亜硫酸塩、バイサルファイト、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）反応を利用した方法がある。この方法は、メチル化ＤＮＡの解析に最も汎用されている方法である。一本鎖ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理すると、シトシンはスルホン化、加水脱アミノ化、脱スルホン化を経て、ウラシルに変換される。一方、メチル化されたシトシンは、最初に起こるスルホン化の反応速度が極めて遅いため、実際に行われる亜硫酸水素塩処理の反応時間の中ではメチル化シトシンのままである。従って、亜硫酸水素塩処理をしたＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うと、メチル化シトシンはシトシンのままであるが、非メチル化シトシンは、ウラシルからチミンに置き換わって増幅される。このＰＣＲ増幅産物の配列中に生じるシトシンとチミンという塩基の違いを利用してメチル化状態を解析する。これを基本原理として汎用されている方法が、特許文献１、非特許文献５に記載のＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ（ＭＳＰ）法、および非特許文献６、７に記載のＣｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）法である。

ＭＳＰ法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理後にメチル化配列特異的プライマーと非メチル化配列特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅と、アガロースゲル電気泳動とを順に行い、両プライマーによる増幅産物の有無により対象領域のＤＮＡメチル化状態を判定する方法である。ＣＯＢＲＡ法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理後にメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡに共通のプライマーを用いたＰＣＲ増幅と、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡで配列が異なる箇所を認識する制限酵素を用いた処理と、アガロースゲル電気泳動とを順に行い、制限酵素処理断片の有無により対象領域のＤＮＡメチル化状態を判定する方法である。両方法ともに、特別な装置なしにメチル化ＤＮＡの定量的な解析ができるという点で、現在でも広く使用されるメチル化ＤＮＡ解析方法であるが、解析に電気泳動法を利用する点で手間と時間がかかるという課題があった。

一方、生化学や医学等の分野における核酸、タンパク質、多糖類といった生体高分子の分離分析には、簡便かつ短時間に精度良く検出できる方法としてイオン交換クロマトグラフィーが汎用されている。核酸のＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離する場合、一般的には、核酸分子中に含まれるリン酸のマイナス電荷を利用して分離するアニオン交換クロマトグラフィーが用いられる。カチオン性の官能基をイオン交換基として有するカラム充填剤が充填されたアニオン交換クロマトグラフィー用カラムは既に市販され、各種研究分野で使用されている。

さらに、カチオン性の官能基として強カチオン性基および弱カチオン性基の両方を有するカラム充填剤を充填したカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、２０ｍｅｒの非メチル化合成オリゴヌクレオチド間における一塩基の相違を分離分析できることが報告されている（特許文献２）。

腎細胞癌（Ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＲＣＣ）は、労働人口に属する壮年期にもしばしば発生し、腎摘除術で根治する症例群が大勢をなす反面、急速に遠隔転移を来す症例群も明らかに存在し、両者の臨床経過には大きな差違がある。さらに、転移しても免疫療法・分子標的治療薬等が奏功する症例が知られている。再発の可能性が高い症例は密に経過観察して再発を早期に診断し、後療法を追加すれば予後が改善できる可能性がある。しかし、病理組織学的に低異型度で最もありふれた組織型である淡明細胞型ＲＣＣに属しながら急速に遠隔転移を来す症例が経験され、既存の臨床病理学的因子等による予後予測は困難である。

ＭＳＰ法、ＣＯＢＲＡ法、及び細菌人工染色体（ＢＡＣ）アレイに基づくメチル化ＣｐＧアイランド増幅法（ＢＡＭＣＡ法）による解析によって、ＲＣＣ患者から得た非癌腎皮質組織が、ＤＮＡメチル化状態の変化に関連した前癌段階に既にあることが示されている（特許文献３及び非特許文献８〜１１）。さらに、ＢＡＭＣＡ法によるゲノムワイドな解析によって、前癌段階にある非癌腎皮質組織のＤＮＡメチル化の変化は、同一患者の対応するＲＣＣに受け継がれていることも明らかにし、ＲＣＣ症例の予後を予測する方法を開発することに成功している（特許文献３及び非特許文献１０）。

最近、悪性度の高いＲＣＣがＣＩＭＰ陽性形質を示すこと、さらにＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２の１７遺伝子のＣｐＧサイトにおけるメチル化がＲＣＣのＣＩＭＰの特徴であることが明らかにされた（特許文献４）。特許文献４では、ビーズアレイ法、質量分析（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法）、パイロシークエンシング、メチル化感受性高解像能融解曲線分析、定量ＰＣＲ、バイサルファイト処理物の直接シークエンシング、ＣＯＢＲＡ法などにより、上記１７遺伝子のＣｐＧサイトにおけるメチル化レベルを検出することによって、ＲＣＣの予後不良リスクを検出する方法が提案されている。従来から用いられているＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、パイロシークエンシング等の方法で得られるＤＮＡメチル化率の値は、測定に供した試料全体の平均値としてのＤＮＡメチル化率が得られる。そのため、試料中にＤＮＡメチル化率の低い細胞が多い場合に、高度にメチル化されたＤＮＡを有する細胞が混在していたとしても、得られるＤＮＡメチル化率の値は低くなる。結果として、高度にメチル化されたＤＮＡを有する細胞の有無を判定することができない、さらにはＤＮＡメチル化率を低く見積もるリスクが避けられない、という問題点があった。

米国特許第５７８６１４６号公報 国際公開公報第２０１２／１０８５１６号 特開２０１０−６３４１３号公報 国際公開公報第２０１３／０６２６５０号

Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，４，９８８−９９３（２００４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，８６８１−８６８６（１９９９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４，１８６５４−１８６５９（２００７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９，５４３８−５４４２（１９９９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，９８２１−９８２６（１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，５０５８−５０５９（１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，２５３２−２５３４（１９９７） Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１４，５５３１−５５３９（２００８） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１９，２８８−２９６（２００６） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，３０，２１４−２２１（２００９） Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，７８，１−９（２０１１）

癌の再発を防ぐためには、ゲノムＤＮＡのメチル化状態の情報を得ることにより、特異性高く再発リスクを判定して治療を開始することが望ましい。癌の転移・再発を予測し早期に発見できれば、それらに対して免疫療法や分子標的治療薬等の奏功が期待できることから、より正確な癌予後診断を行うことができる方法が求められている。さらに、正確な癌予後診断のための、迅速かつ簡便な方法が求められている。

本発明者らは、亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡをＰＣＲで増幅して得たＰＣＲ増幅産物を、イオン交換クロマトグラフィーによって分離することで、迅速かつ簡便にメチル化ＤＮＡを検出できることを見出した。さらに本発明者らは、イオン交換クロマトグラフィーで得られたシグナルのパターンが、ＣＩＭＰ陽性癌から得られたＤＮＡとＣＩＭＰ陰性癌から得られたＤＮＡとで異なること、当該パターンの違いを解析することで予後不良な癌を判定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明は、以下を提供する。
〔１〕腎細胞癌を含む組織の判定方法であって：
（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合に、該組織を、予後不良の腎細胞癌患者から得られた腎細胞癌を含む組織であると判定する工程、
を含む方法。

〔２〕腎細胞癌を含む組織を判定するためのデータを得る方法であって：
（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早いか否かを、該組織が予後不良の腎細胞癌患者から得られた腎細胞癌を含む組織であるか否かを判定するためのデータとして取得する工程、
を含む方法。

〔３〕腎細胞癌患者の予後判定方法であって：
（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合に、該被験体の腎細胞癌を予後不良と判定する工程、
を含む方法。

〔４〕前記工程（２）において、ＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子におけるＣｐＧアイランドを含む、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。

〔５〕前記工程（２）においてＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーター領域を含む、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。

〔６〕前記工程（２）のＰＣＲにおいて、配列番号５１及び５２で示されるＰＣＲプライマーが使用される、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。

〔７〕前記工程（４）の前に、さらに以下の工程：
（１’）前記被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅領域に相当するメチル化していないＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２’）工程（１’）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３’）工程（２’）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（３ａ）工程（３）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルから、工程（３’）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルを差し引いて差分データを得る工程、
を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項記載の方法。

本発明は、迅速、簡便、かつ高精度な癌予後判定方法を提供する。本発明によれば、より迅速、簡便、かつ高精度な癌患者の再発リスクを判定することができるので、治療が必要な癌患者に対する早期の治療再開が可能になる。したがって本発明は、癌患者の生存率の向上に貢献する。

ＤＮＡメチル化率によるクロマトグラフィー溶出時間の変動。Ａ：ＤＮＡメチル化率の異なるＤＮＡ（０％、２５％、５０％、７５％、１００％）のクロマトグラムＢ：ＤＮＡメチル化位置の異なる５０％メチル化ＤＮＡ（ランダム、５'側寄り、３'側寄り、中央）のクロマトグラム。 ＤＮＡメチル化率とクロマトグラフィー保持時間との相関。 ＣＩＭＰ陽性および陰性試料のクロマトグラム。Ａ，Ｂ：ＣＩＭＰ陽性試料、Ｃ，Ｄ：ＣＩＭＰ陰性試料。 ＣＩＭＰ陽性および陰性試料のクロマトグラフィー保持時間。 ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法と本発明とで得られたＤＮＡメチル化率の比較。 ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法と本発明とで得られたＤＮＡメチル化率の比較。

本明細書において、「腎細胞癌」とは、腎臓の尿細管上皮細胞が癌化したものであり、その病理学的特徴から、淡明細胞型、顆粒細胞型、色素嫌性型、紡錘型、嚢胞随伴型、嚢胞由来型、嚢胞性型、乳頭状型に分類される癌である。また、本明細書において、「被験体」としては、例えば、腎細胞癌に罹患した患者又はその疑いのある患者、外科手術等によって腎細胞癌の治療が施された患者が挙げられる。

本明細書において、癌の「予後不良」とは、例えば、被験体の予後（治療後）の生存率が低いことが挙げられ、より具体的には、術後５００日経過後の無再発生存率（無癌生存率）が５０％以下であることが挙げられ、あるいは、術後１５００日経過後の全生存率（全体的な生存率）が７０％以下となることが挙げられる。

本明細書において、「ＤＮＡメチル化」とは、ＤＮＡにおいて、シトシンの５位の炭素がメチル化されている状態のことを意味する。また本明細書において、ＤＮＡの「メチル化を検出する」とは、当該ＤＮＡにおけるメチル化ＤＮＡの存在の有無もしくは存在量、存在量の比、または当該ＤＮＡのメチル化率を測定することを意味する。本明細書において、「ＤＮＡメチル化率」とは、検出の対象とする特定のＤＮＡにおいてＣｐＧアイランドのシトシンがメチル化されている割合を意味し、例えば、検出の対象とする特定のＤＮＡのＣｐＧアイランドにおける、全シトシン数（メチル化シトシン及び非メチル化シトシン）に対するメチル化シトシン数の比率にて表すことができる。

本明細書において、「ＣｐＧサイト」とは、ＤＮＡ中でシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との間がホスホジエステル結合（ｐ）している部位のことを意味する。また本明細書において、ＣｐＧアイランドは、ホスホジエステル結合（ｐ）を介したシトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）の２塩基配列が高頻度で出現する領域をいう。ＣｐＧアイランドは、遺伝子上流のプロモーター領域に存在することが多い。本明細書において、「（ある）遺伝子のＣｐＧサイトまたはＣｐＧアイランド」とは、当該遺伝子のコード領域に近い位置に存在するＣｐＧアイランド、または該ＣｐＧアイランドに含まれるＣｐＧサイトを意味し、好ましくは当該遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧサイトまたはＣｐＧアイランドを意味する。特定の遺伝子のＣｐＧサイトまたはＣｐＧアイランドは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、パイロシークエンシング等の方法に基づいて同定することができる。

本明細書において、「基準となる保持時間」（以下、基準保持時間ともいう）とは、ＣＩＭＰ陽性群とＣＩＭＰ陰性群とを分けることができるＨＰＬＣの保持時間、あるいは、腎細胞癌から調製されたゲノムＤＮＡに由来する検出シグナルについて、高度にメチル化されたＤＮＡに由来するシグナル群と、メチル化の程度の低いＤＮＡに由来するシグナル群とを分けることができるＨＰＬＣの保持時間を示す。すなわち、基準となる保持時間（基準保持時間）より早い保持時間には、高度にメチル化されたＤＮＡに由来するシグナルが検出されるので、基準保持時間より早い保持時間に検出シグナルを有する検体は予後不良であると判定され得る。前述の基準保持時間は、ＨＰＬＣの分析条件、ゲノムＤＮＡの領域、あるいは遺伝子マーカーの種類等によってクロマトグラムが変化するので、それらの条件等に応じて適切な基準保持時間を設定すればよい。また、必要とされる臨床感度も考慮し、基準保持時間を設定するのが好ましい。

一実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、腎細胞癌を含む組織の判定方法を提供する。
（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合に、該組織を、予後不良の腎細胞癌患者から得られた腎細胞癌を含む組織であると判定する工程。

別の一実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、腎細胞癌を含む組織を判定するためのデータを得る方法を提供する。
（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合か否かを、該組織が予後不良の腎細胞癌患者から得られた腎細胞癌を含む組織であるか否かを判定するためのデータとして取得する工程。

別の一実施形態において、本発明は、以下の工程を含む腎細胞癌患者の予後判定方法を提供する。
（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合に、該被験体の腎細胞癌を予後不良と判定する工程。

別の一実施形態において、本発明は、上記工程（４）の前にさらに以下の工程が行われる、腎細胞癌を含む組織または腎細胞癌患者の判定方法を提供する。
（１’）上記被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅領域に相当するメチル化していないＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２’）工程（１’）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３’）工程（２’）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（３ａ）工程（３）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルから、工程（３’）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルを差し引いて差分データを得る工程。

被験体の腎臓組織としては、ＤＮＡを含む腎臓組織またはその細胞であればよく、例えば、生検や外科手術等において採取した組織、およびその凍結物や固定化標本が挙げられる。ゲノムＤＮＡの分解等を抑制し、より効率よくＤＮＡメチル化検出を行えるという観点からは、凍結した腎臓組織を用いることが望ましい。

上記腎臓組織または細胞からサンプルＤＮＡを調製する方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。ＤＮＡを調製する公知の方法としては、フェノールクロロホルム法、または市販のＤＮＡ抽出キット、例えば後述するＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、Ｃｌｅａｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、ＺＲ Ｐｌａｎｔ／Ｓｅｅｄ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（ＴｒｉｍＧｅｎ社製）を用いるＤＮＡ抽出方法等が挙げられる。

次いで、抽出したサンプルＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する。ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理の方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。亜硫酸水素塩処理のための公知の方法としては、例えば、後述するＥｐｉＴｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｋｉｔ（４８）（Ｑｉａｇｅｎ社製）や、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ社製）、Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣｐＧ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＣｐＧｅｎｏｍｅ Ｔｕｒｂｏ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＥＲＣＫ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）などの市販のキットを用いる方法が挙げられる。

次いで、亜硫酸水素塩によって処理されたサンプルＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲ増幅の方法としては特に制限はなく、増幅対象のＤＮＡの配列、長さ、量などに応じて、公知の手法を適宜選択して用いることができる。

腎細胞癌については、１７遺伝子（ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２）におけるＤＮＡメチル化が、腎細胞癌の予後不良（ＣＩＭＰ陽性）と関連していることが報告されている（特許文献４）。したがって、本発明の方法においてＰＣＲ増幅される標的ＤＮＡは、好ましくは、上記１７遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子におけるＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化を検出できるように選択され、より好ましくは、上記１７遺伝子のＣｐＧサイトのメチル化を検出できるように選択される。例えば、標的ＤＮＡは、上記１７遺伝子のいずれかのコード領域および／またはプロモーター領域の一部または全部をコードするＤＮＡである。好ましくは、上記１７遺伝子のいずれかのプロモーター領域の一部又は全部をコードするＤＮＡである。より好ましくは、上記１７遺伝子のいずれかのＣｐＧアイランドの一部又は全部をコードするＤＮＡである。

ＦＡＭ１５０ＡはＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿９９７２９６で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＧＲＭ６はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０００８３４で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＺＮＦ５４０はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿６８９８１９で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＺＦＰ４２はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿７７７５６０で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＺＮＦ１５４はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００１０７８８５３で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＲＩＭＳ４はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿８９２０１５で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＰＣＤＨＡＣ１はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０６１７２１で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＫＨＤＲＢＳ２はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿６８９９０１で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＡＳＣＬ２はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００５１６１で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＫＣＮＱ１はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０００２０９で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＰＲＡＣはＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿１１５７６７で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＷＮＴ３ＡはＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿１４９１２２で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＴＲＨはＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００９０４８で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＦＡＭ７８ＡはＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿２０３７４５で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＺＮＦ６７１はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０７９１０９で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＳＬＣ１３Ａ５はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿８０８２１８で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＮＫＸ６−２はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿７９６３７４で特定されるタンパク質をコードする遺伝子である。

上記１７遺伝子のＣｐＧサイトは、基準ヒトゲノム配列である、ＮＣＢＩデータベース Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｕｉｌｄ ３７上の位置を基準にして、表１〜４に記載の染色体上の位置に存在する。

特許文献４に記載のＣＩＭＰ判定において、ＤＮＡメチル化の検出対象として好ましいＣｐＧサイトとしては、基準ヒトゲノム配列であるＮＣＢＩデータベース Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｕｉｌｄ ３７上の位置が、第８染色体５３，４７８，４５４位、第５染色体１７８，４２２，２４４位、第１９染色体３８，０４２，４７２位、第４染色体１８８，９１６，８６７位、第１９染色体５８，２２０，６６２位、第２０染色体４３，４３８，８６５位、第５染色体１４０，３０６，４５８位、第６染色体６２，９９５，９６３位、第１１染色体２，２９２，００４位、第１１染色体２，４６６，４０９位、第１７染色体４６，７９９，６４０位、第１９染色体５８，２２０，４９４位、第１染色体２２８，１９４，４４８位、第３染色体１２９，６９３，６１３位、第９染色体１３４，１５２，５３１位、第１９染色体５８，２３８，９２８位、第１７染色体６，６１７，０３０位及び第１０染色体１３４，５９９，８６０位からなる群から選択される少なくとも１のＣｐＧサイトである。

ＰＣＲ増幅産物の鎖長は、ＰＣＲの増幅時間の短縮、ならびにイオン交換クロマトグラフィーでの分析時間の短縮や分離性能の維持等の要素を勘案して適宜選択することができる。例えば、ＣｐＧアイランドが多いサンプルＤＮＡを用いる場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長は、１０００ｂｐ以下が好ましく、７００ｂｐ以下がより好ましく、５００ｂｐ以下がさらに好ましい。一方、ＣｐＧアイランドが少ないサンプルＤＮＡを用いる場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長は、ＰＣＲにおける非特異的ハイブリダイズを避けられる１５ｍｅｒ付近のプライマーを使用する場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長である３０〜４０ｂｐが下限となる。一方で、ＣｐＧアイランドの含有率がリッチになるようにプライマーを設計するのが好ましい。例えば、ＣｐＧサイトのシトシンが、ＰＣＲ増幅産物の鎖長に対して２％以上含まれるのが好ましく、５％以上含まれるのがより好ましい。

続いて、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける。本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーが好適である。本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーに用いるカラムの充填剤としては、表面に強カチオン性基を有する基材粒子であれば特に限定されないが、特許文献２に示される充填剤表面に強カチオン性基と弱カチオン性基の両方を有する基材粒子が好ましい。

本明細書において、上記強カチオン性基とは、ｐＨが１から１４の広い範囲で解離するカチオン性基を意味する。すなわち、上記強カチオン性基は、水溶液のｐＨに影響を受けず解離した（カチオン化した）状態を保つことが可能である。

上記強カチオン性基としては、４級アンモニウム基が挙げられる。具体的には例えば、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルエチルアンモニウム基等のトリアルキルアンモニウム基等が挙げられる。また、上記強カチオン性基のカウンターイオンとしては、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲン化物イオンが挙げられる。

上記基材粒子の表面に導入される上記強カチオン性基量は、特に限定されないが、充填剤の乾燥重量あたりの好ましい下限は１μｅｑ／ｇ、好ましい上限は５００μｅｑ／ｇである。上記強カチオン性基量が１μｅｑ／ｇ未満であると、保持力が弱く分離性能が悪くなることがある。上記強カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、保持力が強くなり過ぎてＰＣＲ増幅産物を容易に溶出させることができず、分析時間が長くなりすぎる等の問題が生じることがある。

本明細書において、上記弱カチオン性基とは、ｐｋａが８以上のカチオン性基を意味する。すなわち、上記弱カチオン性基は、水溶液のｐＨによる影響を受け、解離状態が変化する。すなわち、ｐＨが８より高くなると、上記弱カチオン性基のプロトンは解離し、プラスの電荷を持たない割合が増える。逆にｐＨが８より低くなると、上記弱カチオン性基はプロトン化し、プラスの電荷を持つ割合が増える。

上記弱カチオン性基としては、例えば、３級アミノ基、２級アミノ基、１級アミノ基等が挙げられる。なかでも、３級アミノ基であることが望ましい。

上記基材粒子の表面に導入される上記弱カチオン性基量は、特に限定されないが、充填剤の乾燥重量あたりの好ましい下限は０．５μｅｑ／ｇ、好ましい上限は５００μｅｑ／ｇである。上記弱カチオン性基量が０．５μｅｑ／ｇ未満であると、少なすぎて分離性能が向上しないことがある。上記弱カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、強カチオン性基と同様保持力が強くなり過ぎてＰＣＲ増幅産物を容易に溶出させることができず、分析時間が長くなりすぎる等の問題が生じることがある。

上記基材粒子表面の強カチオン性基または弱カチオン性基量は、アミノ基に含まれる窒素原子を定量することにより測定することができる。窒素を定量する方法として、例えばケルダール法が挙げられる。本発明（実施例）記載の充填剤の場合には、まず、重合後に強カチオン性基に含まれる窒素を定量し、次いで、弱カチオン性基を導入した後の強カチオン性基と弱カチオン性基に含まれる窒素を定量することにより、後から導入した弱カチオン性基量を算出することができる。このように定量することにより、充填剤を調製する際に、強カチオン性基量および弱カチオン性基量を上記範囲内に調整することができる。

上記基材粒子としては、例えば、重合性単量体等を用いて得られる合成高分子微粒子、シリカ系等の無機微粒子等を用いることができるが、合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子であることが望ましい。

上記疎水性架橋重合体は、少なくとも１種の疎水性架橋単量体と少なくとも１種の反応性官能基を有する単量体を共重合して得られる疎水性架橋重合体、少なくとも１種の疎水性架橋単量体と少なくとも１種の反応性官能基を有する単量体と少なくとも１種の疎水性架橋単量体とを共重合して得られる疎水性架橋重合体のいずれであってもよい。

上記疎水性架橋性単量体としては、単量体１分子中にビニル基を２個以上有するものであれば特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリル酸エステル、トリメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリル酸エステル若しくはテトラ（メタ）アクリル酸エステル、またはジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等の芳香族系化合物が挙げられる。なお、本明細書において上記（メタ）アクリレートとは、アクリレートまたはメタクリレートを意味し、（メタ）アクリルとは、アクリルまたはメタクリルを意味する。

上記反応性官能基を有する単量体としては、グリシジル（メタ）アクリレート、イソシアネートエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

上記疎水性非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架橋性の重合性有機単量体であれば特に限定されず、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルや、スチレン、メチルスチレン等のスチレン系単量体が挙げられる。

上記疎水性架橋重合体が、上記疎水性架橋性単量体と上記反応性官能基を有する単量体とを共重合して得られるものである場合、上記疎水性架橋重合体における上記疎水性架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合の好ましい下限は１０重量％、より好ましい下限は２０重量％である。

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、上記基材粒子の表面に、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とを有する重合体層を有するものであることが好ましい。また、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とを有する重合体において、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とはそれぞれ独立した単量体に由来するものであることが好ましい。具体的には、本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、上記疎水性架橋重合体粒子と、上記疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合された強カチオン性基を有する親水性重合体の層とからなる被覆重合体粒子の表面に、弱カチオン性基が導入されたものであることが好適である。

上記強カチオン性基を有する親水性重合体は、強カチオン性基を有する親水性単量体から構成されるものであり、１種以上の強カチオン性基を有する親水性単量体に由来するセグメントを含有すればよい。すなわち、上記強カチオン性基を有する親水性重合体を製造する方法としては、強カチオン性基を有する親水性単量体を単独で重合させる方法、２種以上の強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合させる方法、強カチオン性基を有する親水性単量体と強カチオン性基を有しない親水性単量体を共重合させる方法等が挙げられる。

上記強カチオン性基を有する親水性単量体としては、４級アンモニウム基を有するものであることが好ましい。具体的には例えば、メタクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルジメチルエチルアンモニウムクロリド等が挙げられる。

上記被覆重合体粒子の表面に上記弱カチオン性基を導入する方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には例えば、上記弱カチオン性基として３級アミノ基を導入する方法としては、グリシジル基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いでグリシジル基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法；イソシアネート基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、イソシアネート基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法；上記疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体と３級アミノ基を有する単量体とを共重合する方法；３級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて上記強カチオン性基を有する親水性重合体の層を有する被覆重合体粒子の表面に３級アミノ基を導入する方法；カルボキシ基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、カルボキシ基と３級アミノ基を有する試薬とを、カルボジイミドを用いて縮合させる方法；エステル結合を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、エステル結合部を加水分解した後、次いで、加水分解によって生成したカルボキシ基と３級アミノ基を有する試薬とを、カルボジイミドを用いて縮合させる方法等が挙げられる。なかでも、グリシジル基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、グリシジル基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法や、イソシアネート基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、イソシアネート基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法が好ましい。

グリシジル基やイソシアネート基等の反応性官能基に反応させる上記３級アミノ基を有する試薬としては、３級アミノ基と反応性官能基に反応可能な官能基を有する試薬であれば、特に限定されない。上記３級アミノ基と反応性官能基に反応可能な官能基としては、例えば、１級アミノ基、水酸基等が挙げられる。なかでも、末端に１級アミノ基を有している基が好ましい。当該官能基を有する具体的な試薬としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノペンチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジブチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。

上記強カチオン性基、好ましくは４級アンモニウム塩と、上記弱カチオン性基、好ましくは３級アミノ基との相対的な位置関係は、上記強カチオン性基が上記弱カチオン性基よりも基材粒子の表面から遠い位置、即ち外側にあることが好ましい。例えば、上記弱カチオン性基は基材粒子表面から３０Å以内にあり、上記強カチオン性基は基材粒子表面から３００Å以内で、かつ、弱カチオン性基よりも外側にあることが好ましい。

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤に用いられる上記基材粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。上記平均粒子径が０．１μｍ未満であると、カラム内が高圧になりすぎて分離不良を起こすことがある。上記平均粒子径が２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎて分離不良を起こすことがある。なお、本明細書において上記平均粒子径は体積平均粒子径を示し、粒度分布測定装置（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製など）を用いて測定することができる。

本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーに用いる溶離液の組成としては、公知の条件を用いることができる。

上記溶離液に用いる緩衝液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましく、具体的には例えば、トリス塩酸緩衝液、トリスとＥＤＴＡからなるＴＥ緩衝液、トリスとホウ酸とＥＤＴＡからなるＴＢＡ緩衝液等が挙げられる。

上記溶離液のｐＨは特に限定されないが、好ましい下限は５、好ましい上限は１０である。この範囲に設定することで、上記弱カチオン性基も効果的にイオン交換基（アニオン交換基）として働くと考えられる。上記溶離液のｐＨのより好ましい下限は６、より好ましい上限は９である。

上記溶離液に含まれる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム等のハロゲン化物とアルカリ金属とからなる塩；塩化カルシウム、臭化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム等のハロゲン化物とアルカリ土類金属とからなる塩；過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機酸塩、等を用いることができる。また、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム等の有機酸塩を用いることもできる。上記塩は、いずれか単独または組み合わせて使用され得る。

上記溶離液の塩濃度としては、分析条件に合わせ適宜調整すればよいが、好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は２０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましい下限は１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は１５００ｍｍｏｌ／Ｌである。

さらに、本発明のイオン交換クロマトグラフィーに用いる溶離液には、分離性能をさらに高めるためにアンチカオトロピックイオンが含まれている。アンチカオトロピックイオンは、カオロトピックイオンとは逆の性質を有し、水和構造を安定化させる働きがある。そのため、充填剤と核酸分子との間の疎水性相互作用を強める効果がある。本発明のイオン交換クロマトグラフィーの主たる相互作用は静電的相互作用であるが、加えて、疎水性相互作用の働きも利用することにより分離性能が高まる。

上記溶離液に含まれるアンチカオトロピックイオンとしては、リン酸イオン（ＰＯ_４ ^３−）、硫酸イオン（ＳＯ_４ ^２−）、アンモニウムイオン（ＮＨ_４ ^＋）、カリウムイオン（Ｋ^＋）、ナトリウムイオン（Ｎａ^＋）などが挙げられる。これらのイオンの組合せの中でも、硫酸イオンおよびアンモニウムイオンが好適に用いられる。上記アンチカオトロピックイオンは、いずれか単独または組み合わせて使用され得る。なお、上述のアンチカオトロピックイオンの一部には、上記溶離液に含まれる塩や緩衝液の成分が含まれる。このような成分を使用する場合、溶離液に含まれる塩としての性質または緩衝能と、アンチカオトロピックイオンとしての性質の両方を具備するので、本発明には好適である。

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液におけるアンチカオトロピックイオンの分析時の濃度は、分析対象物に合わせて適宜調整すればよいが、アンチカオトロピック塩として２０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが望ましい。具体的には、アンチカオトロピック塩の濃度を０〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲でグラジエント溶出させる方法を挙げることができる。従って、分析開始時のアンチカオトロピック塩の濃度は０ｍｍｏｌ／Ｌである必要はなく、また、分析終了時のアンチカオトロピック塩の濃度も２０００ｍｍｏｌ／Ｌである必要はない。上記グラジエント溶出の方法は、低圧グラジエント法であっても高圧グラジエント法であってもよいが、高圧グラジエント法による精密な濃度調整を行いながら溶出させる方法が好ましい。

上記アンチカオトロピックイオンは、溶出に用いる溶離液のうちの１種のみに添加してもよいが、複数種の溶離液に添加してもよい。また上記アンチカオトロピックイオンは、充填剤とＰＣＲ増幅産物との間の疎水性相互作用を強める効果または緩衝能と、ＰＣＲ増幅産物をカラムから溶出させる効果の両方の役割を備えていても良い。

本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーでＰＣＲ増幅産物を分析する際のカラム温度は、好ましくは３０℃以上であり、より好ましくは４０℃以上であり、さらに好ましくは４５℃以上である。イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が３０℃未満であると充填剤とＰＣＲ増幅産物との間の疎水性相互作用が弱くなり、所望の分離効果を得ることが難しくなる。イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が４５℃未満である場合、メチル化ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（メチル化ＤＮＡサンプル）と非メチル化ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（非メチル化ＤＮＡサンプル）との保持時間の差が小さい。さらに、カラム温度が６０℃以上では、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルの間の保持時間の差がさらに広がり、かつそれぞれのピークもより明瞭になるので、より精度のよいＤＮＡのメチル化の検出が可能になる。

さらに、イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が高くなると、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルとが明瞭に分離されるので、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡの存在比率に従って両者の保持時間のピーク面積またはピーク高さに差異が生じやすくなる。したがって、カラム温度を高くすれば、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルの間の保持時間のピークの面積または高さに基づいて、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡそれぞれの存在量や存在比率を測定することがより容易になる。

一方、イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が９０℃以上になると、ＰＣＲ増幅産物中の核酸分子の二本鎖が乖離するため分析上好ましくない。さらに、カラム温度が１００℃以上になると、溶離液の沸騰が生じる恐れがあるため分析上好ましくない。したがって、本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーでＰＣＲ増幅産物を分析する際のカラム温度は、３０℃以上９０℃未満であればよく、好ましくは４０℃以上９０℃未満であり、より好ましくは４５℃以上９０℃未満であり、さらに好ましくは５５℃以上９０℃未満であり、さらにより好ましくは５５℃以上８５℃以下であり、なお好ましくは６０℃以上８５℃以下である。

上記イオン交換クロマトグラフィーカラムへの試料注入量は、特に限定されずカラムのイオン交換容量および試料濃度に応じて適宜調整すればよい。流速は０．１ｍＬ／ｍｉｎから３．０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、０．５ｍＬ／ｍｉｎから１．５ｍＬ／ｍｉｎがより好ましい。流速が遅くなると分離の向上が期待できるが、遅くなりすぎると分析に長時間を要したり、ピークのブロード化による分離性能の低下を招く恐れがある。逆に流速が早くなると分析時間の短縮という面においてはメリットがあるが、ピークが圧縮されるため分離性能の低下を招く。よって、カラムの性能によって適宜調整されるパラメータではあるが、上記流速の範囲に設定することが望ましい。各サンプルの保持時間は、各サンプルについて予備実験を行うことによって予め決定することができる。送液方法はリニアグラジエント溶出法やステップワイズ溶出法など公知の送液方法を用いることができるが、本発明における送液方法としてはリニアグラジエント溶出法が好ましい。グラジエント（勾配）の大きさは溶出に用いる溶離液を０％から１００％の範囲で、カラムの分離性能および分析対象物（ここではＰＣＲ増幅産物）の特性に合わせ適宜調整すればよい。

本発明においては、上述した手順で亜硫酸水素塩処理したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって、サンプルＤＮＡにおけるＤＮＡのメチル化を検出する。

ＤＮＡを亜硫酸水素塩処理した場合、当該ＤＮＡ中の非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンはシトシンのままである。亜硫酸水素塩処理したＤＮＡをＰＣＲ増幅すると、非メチル化シトシン由来のウラシルは、さらにチミンに置き換わるため、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの間で、シトシンとチミンの存在比率に差が生じる。したがって、ＰＣＲ増幅産物中のＤＮＡは、メチル化率に応じた異なる配列を有する。上記ＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけると、当該増幅産物中に含まれるＤＮＡの塩基配列に応じて、異なるシグナルを示すクロマトグラムが得られる。

例えば、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物からの検出シグナルを、サンプルＤＮＡと塩基配列は同じであるがメチル化していないＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（以下、陰性対照という）からの検出シグナル、またはサンプルＤＮＡと塩基配列は同じでかつメチル化率が既知（例えば、１００％）であるＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（以下、陽性対照という）からの検出シグナルと比較することにより、サンプルＤＮＡ中におけるメチル化ＤＮＡの存在の有無を測定することができる。

あるいは、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物からの検出シグナルを、陰性および陽性対照からの検出シグナルと比較することにより、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡの存在量、および非メチル化ＤＮＡとの存在量の比を測定することができる。またあるいは、サンプルＤＮＡと塩基配列は同じでかつメチル化率が既知である複数のＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物に由来する複数のＰＣＲ増幅産物（以下、標準という）からの検出シグナルを、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物からの検出シグナルと比較することにより、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡのメチル化率、存在量、および非メチル化ＤＮＡとの存在量の比を測定することができる。

本発明の方法においては、上記陰性対照、陽性対照または標準の代わりに、上記陰性対照、陽性対照または標準と同じ塩基配列からなる、化学的または遺伝子工学的に合成したＤＮＡを用いてもよい。さらに本発明の方法においては、陰性対照、陽性対照または標準の調製には市販品を用いることもでき、例えばＥｐｉＴｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡ Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用できる。

好ましい態様において、本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーにおいては、上記サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物を含む試料と、上記陰性対照もしくは陽性対照、または上記標準の試料とを、個別にイオン交換クロマトグラフィー分析に供する。カラムに吸着した試料を、複数の溶離液を用いてグラジエント溶出させることにより、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物と陰性対照もしくは陽性対照または標準とを、ＤＮＡメチル化率に応じて異なる保持時間で溶出することができる。

陰性対照からの検出シグナルは、サンプルＤＮＡの代わりに、サンプルＤＮＡと塩基配列は同じであるがメチル化していないＤＮＡを用いて上述した手順で亜硫酸水素塩処理およびＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって獲得することができる。陽性対照からの検出シグナルは、サンプルＤＮＡの代わりに、サンプルＤＮＡと塩基配列は同じでかつメチル化率が既知（例えば、１００％）であるＤＮＡを用いて上述した手順で亜硫酸水素塩処理およびＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって獲得することができる。あるいは、上述した合成ＤＮＡや市販のＤＮＡを陰性または陽性対照として、イオン交換クロマトグラフィーにかけることで、陰性または陽性対照からの検出シグナルを得てもよい。

標準からの検出シグナルは、サンプルＤＮＡの代わりに、サンプルＤＮＡと塩基配列は同じでかつメチル化率が既知である複数のＤＮＡを用いて上述した手順で亜硫酸水素塩処理およびＰＣＲを行い、得られた複数のＰＣＲ増幅産物をそれぞれイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって獲得することができる。さらに、得られた各々の検出シグナルから、検量線を作成してもよい。あるいは、上述した合成ＤＮＡや市販のＤＮＡを標準として、イオン交換クロマトグラフィーにかけることで、標準からの検出シグナルを得てもよい。

次いで、上記クロマトグラフィーで得られたサンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物からの検出シグナルと、陰性もしくは陽性対照、または標準からの検出シグナルとを比較する。両者の検出シグナルの違いに基づいて、サンプルＤＮＡのメチル化を検出することができる。

例えば、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークの保持時間が、陰性対照のピークの保持時間とずれていれば、サンプルＤＮＡがメチル化していると判定できる。さらにこのとき、保持時間のずれが大きいほど、メチル化率がより大きいと推定できる。逆に、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークの保持時間が、１００％メチル化陽性対照のピークの保持時間とずれているほど、サンプルＤＮＡのメチル化率はより小さいと推定できる。あるいは、メチル化率が既知の標準から得られた複数のピークの保持時間に基づいて検量線を作成し、この検量線に基づいてサンプルＤＮＡのメチル化率を決定することができる（図１および２参照）。

上記検量線により、ＤＮＡメチル化率と保持時間とを関連づけることができる。したがって、該検量線に基づいて、基準保持時間に対応するＤＮＡメチル化率（以下、基準ＤＮＡメチル化率ともいう）を求めることができる。基準ＤＮＡメチル化率を取得しておけば、ＨＰＬＣの機材や分析条件を変更した場合であっても、該変更された機材や条件下で新たに作成した検量線に該基準ＤＮＡメチル化率をあてはめることによって、新しい基準保持時間を容易に算出することができる。

また例えば、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークの高さまたはピーク面積を、メチル化ＤＮＡのメチル化率および混合比が既知のＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークの高さまたはピーク面積と比較することによって、サンプルＤＮＡにおけるメチル化ＤＮＡの存在比率（例えば非メチル化ＤＮＡの存在比率や、特定の割合でメチル化されたＤＮＡの存在比率など）を決定することができる。

本発明の方法において、クロマトグラフィーによる検出シグナルのピークの有無を判定する方法としては、既存のデータ処理ソフトウェア、例えばＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ（島津製作所）、ＧＲＡＭＳ／ＡＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｉｇｏｒ Ｐｒｏ（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ社）などを用いたピーク検出が挙げられる。ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎを用いたピークの有無の判定方法を例示すると、具体的には、まずピークを検出させたい保持時間の区間を指定する。次に、ノイズなど不要なピークを除去するために、各種パラメータを設定する。例えば、パラメータ「ＷＩＤＴＨ」を不要なピークの半値幅よりも大きくする、パラメータ「ＳＬＯＰＥ」を不要なピークの立ち上り傾斜より大きくする、パラメータ「ＤＲＩＦＴ」の設定を変えることにより分離度の低いピークを垂直分割するかベースライン分割するか選択する、などが挙げられる。パラメータの値は、分析条件、選択した遺伝子マーカーの種類、検体の量などにより、異なるクロマトグラムが得られるため、クロマトグラムに応じて適切な値を設定すればよい。

保持時間、すなわちピークトップの時間は、上記のデータ処理ソフトウェアで自動的に計算することができる。例えば、クロマトグラムを一次微分し、微分係数が正から負へ変化する時間をピークトップの時間として取得することができる。

本発明の方法においては、クロマトグラフィーによる検出シグナルの保持時間について調べる。その結果が、基準保持時間より早い保持時間に検出シグナルが得られる場合に、当該試料を、予後不良の腎細胞癌患者から得られた試料であると判定する。図３Ａ、Ｂに示すように、高メチル化率ＤＮＡのピークと低メチル化率ＤＮＡのピークとの分離がよく、二峰化する場合には、ピークの分離によって非メチル化ＤＮＡの影響を除去でき、予後不良の腎細胞癌患者から得られた試料であることが精度よく判定できる。

さらに、本発明の方法においては、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルから、陰性対照から得られた検出シグナルを差し引いた差分データを求めることができる。差分データを求めることにより、サンプルＤＮＡ全体としての検出シグナルから非メチル化ＤＮＡからのシグナル（ノイズ）を除去し、メチル化ＤＮＡからのシグナルのみを抽出することができる。当該差分データは、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡによる検出シグナルに相当する。この差分データの保持時間を基準保持時間と比較する。その結果が、基準保持時間より早い場合、当該試料を、予後不良の腎細胞癌患者から得られた試料であると判定する。当該差分データを用いることによって、メチル化ＤＮＡからのシグナル成分が微弱にしか検出されないサンプル、例えば、メチル化ＤＮＡの存在比率の低いサンプルＤＮＡや、メチル化率の低いメチル化ＤＮＡを含むサンプルＤＮＡにおいても、メチル化ＤＮＡの検出や解析が可能になる。また、サンプルＤＮＡ中に様々なメチル化率のＤＮＡが含まれる場合には、肩のあるピークが得られる、複数のピークが重なる、など様々なパターンのクロマトグラムが得られる。そのような場合において、差分データを求めることによって高メチル化率のサンプルＤＮＡのシグナルのみを抽出できることから、高精度に癌予後判定ができる。

したがって、上記差分データを用いることにより、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡに関するより高精度な解析が可能になる。なお差分データを求める際には、サンプルＤＮＡと陰性対照に用いるＤＮＡとのＤＮＡ量を合わせておくことが望ましい。ＤＮＡ量の確認は、吸光度測定等の測定方法により確認すればよい。

上記差分データを利用する場合の本発明の癌予後判定方法の手順は、基本的には、上述した差分前のデータの場合と同じである。例えば、クロマトグラフィーによる検出シグナルの保持時間について調べ、結果が、基準となる保持時間より早い保持時間に検出シグナルが得られる場合に、当該試料を予後不良の腎細胞癌患者から得られた試料であると判定する。

本発明の予後判定方法において、上記差分データの利用は非常に有効である。臨床検査のために採取される検体は、ＤＮＡメチル化が進行していない非癌上皮細胞や間質細胞等の正常細胞を含む場合や、またはＤＮＡメチル化がそれほど進行していない前癌状態の細胞を多く含む場合、あるいは様々なＤＮＡメチル化率の癌細胞が様々な割合で存在する場合がある。上記差分データを用いることによって、検体中の正常細胞や前癌細胞中の正常ＤＮＡ、あるいは測定対象とする遺伝子領域がメチル化されていない癌細胞に由来する非メチル化ＤＮＡの影響を除去することができるので、より高精度なメチル化ＤＮＡの検出を行うことができ、さらに当該検出結果を利用すれば、より高精度な癌予後判定を行うことができる。

本発明の予後判定方法によれば、試料中のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを分離検出することができるので、試料が正常細胞を多く含んでいる場合であってもメチル化ＤＮＡの存在およびそのメチル化率を高精度に検出し、正確な予後判定を行うことができる。本発明の方法では、従来の検査では予後不良にもかかわらずＣＩＭＰ陽性と判定されていなかったような被験体についても、正確な予後判定が可能になる。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

〔患者及び組織サンプル〕
１０９の癌組織（Ｔ）サンプル及び対応する１０７の非癌腎皮質組織（Ｎ）サンプルは、原発性の淡明細胞型腎細胞癌を罹患している１１０人の患者から手術によって摘出された試料から得たものであり、Ｎサンプルには顕著な組織学的変化は認められていない。なお、これら患者は、術前の治療は受けておらず、国立がん研究センター病院にて腎摘出術を受けた患者である。７９名の男性と３１名の女性とからなり、平均年齢は６２．８±１０．３歳（平均±標準偏差、３６〜８５歳）である。

また、サンプルの組織学的診断は、ＷＨＯの分類に従って行った（Ｅｂｌｅ，Ｊ．Ｎ．ら、「腎細胞癌 腫瘍ＷＨＯ分類 病理学及び遺伝学 男性生殖器及び泌尿系の腫瘍」、２００４年、ＩＡＲＣ出版、Ｌｙｏｎ、１０〜４３ページ、図１ 参照）。

さらに、全ての腫瘍の組織学的異型度は「Ｆｕｈｒｍａｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９８２年、６巻、６５５〜６６３ページ」に記載の基準に従って評価し、ＴＮＭ分類は「Ｓｏｂｉｎ，Ｌ．Ｈ．ら、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）、ＴＮＭ悪性腫瘍の分類、第６版、２００２年、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９３〜１９５ページ」に従って分類した。

また、腎細胞癌の肉眼分類の基準として、肝細胞癌（ＨＣＣ）において確立された基準を採用した（非特許文献４〜６ 参照）。なお、タイプ３（多結節癒合型）ＨＣＣは、タイプ１（単結節型）及びタイプ２（単結節周囲増殖型）のＨＣＣよりも、組織学的分化度は低く、肝内転移の発生率は高い（Ｋａｎａｉ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ、１９８７年、６０巻、８１０〜８１９ページ参照）。

血管侵襲の有無は、へマトキシリン−エオジン及びエラスチカ・ワン・ギーソン染色を施したスライドを顕微鏡にて観察することによって調べた。腎静脈の本幹における腫瘍血栓の有無は肉眼的観察によって調べた。

今回の研究対象である全ての患者からは、書面によるインフォームドコンセントを得ている。また、本研究は、国立がん研究センターの倫理委員会の承認を受けて実施されたものである。

〔参考例１〕従来法によるＣＩＭＰ陰性／陽性判定
従来法によるＣＩＭＰ陰性／陽性判定は、特許文献４に記載のＭａｓｓＡＲＲＡＹ法（実施例５）に従って行った。メチル化ＤＮＡ検出方法の１つであるＭａｓｓＡＲＲＡＹ法にて、１７遺伝子（ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２）のＣｐＧサイト（表１〜４）についてのＤＮＡメチル化レベルを検出した。

ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法は、亜硫酸水素塩処理後のＤＮＡを増幅し、ＲＮＡに転写し、さらにＲＮＡａｓｅにより塩基特異的に切断した後、質量分析計によって、メチル化ＤＮＡ断片と非メチル化ＤＮＡ断片との分子量の差を検出する方法である。

先ず、前記ＣｐＧサイトを含むＣｐＧアイランドに対し、ＥｐｉＤｅｓｉｇｎｅｒ（ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ用プライマー設計ソフト）を用いてＭａｓｓＡＲＲＡＹのプライマー設計を行った。

また、ＰＣＲにおけるバイアスの影響を排除するため、１プライマーセット当たり、ＤＮＡポリメラーゼ３種とアニール温度４段階程度の条件との組み合わせを平均して試行し、定量性の良好な至適ＰＣＲ条件を決定した。そして、ＰＣＲ標的配列に含まれ解析対象となる全てのＣｐＧ部位について、採用したＰＣＲ条件で定量性が良好であることを確認し、１０９の腎細胞癌組織サンプルのうち腎細胞癌１０２検体において、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ解析を実施した。

まず、前記患者から得た新鮮凍結組織サンプルを、フェノール−クロロホルムにて処理し、次いで透析を施すことによって、高分子量ＤＮＡを抽出した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、モレキュラークローニング：実験マニュアル 第３版、コールドスプリングハーバー出版、ＮＹ、６．１４〜６．１５ページ 参照）。そして、ＤＮＡ５００ｎｇを、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ^ＴＭキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、亜硫酸水素塩処理に供した。亜硫酸水素塩処理ゲノムＤＮＡをＰＣＲにて増幅して、インビトロ転写反応を行った。次いで、得られたＲＮＡをＲＮＡａｓｅによりウラシルの部位で特異的に切断し、各サンプルのゲノムＤＮＡのメチル化の有無に応じた長さの異なる断片を生成した。そして、得られたＲＮＡ断片を、一塩基の質量の差異を検出できるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳ（ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ Ａｎａｌｙｚｅｒ ４）にかけ、質量分析を行った。得られた質量分析結果を、解析ソフトウェア（ＥｐｉＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製）を用いて、リファレンス配列にアラインメントし、メチル化ＤＮＡに由来するＲＮＡ断片と非メチル化ＤＮＡに由来するＲＮＡ断片との質量の比から、メチル化レベルを算出した。本解析に用いたプライマーの配列と該プライマーのセットを用いて増幅されたＰＣＲ産物の配列を、表５及び６ならびに配列表に示す。

ＭａｓｓＡＲＲＡＹの解析対象とした全ての領域に関し、前記ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出することによって、予後不良の腎細胞癌（ＣＩＭＰ陽性群：１４検体）と、予後が良好である腎細胞癌（ＣＩＭＰ陰性群：８８検体）とを判別した。

〔参考例２〕アニオン交換カラムの調製
攪拌機付き反応器中の３重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２０００ｍＬに、テトラエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ、トリエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ、グリシジルメタクリレート（和光純薬工業社製）１００ｇおよび過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃で１時間重合した。次に、強カチオン性基を有する親水性単量体として、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬工業社製）１００ｇをイオン交換水に溶解した。これを同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下にて８０℃で２時間重合した。得られた重合組成物を水およびアセトンで洗浄することにより、４級アンモニウム基を有する親水性重合体の層を表面に有する被覆重合体粒子を得た。得られた被覆重合体粒子について、粒度分布測定装置（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定したところ、平均粒子径は１０μｍであった。

得られた被覆重合体粒子１０ｇをイオン交換水１００ｍＬに分散させ、反応前スラリーを準備した。次いで、このスラリーを撹拌しながら、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン（和光純薬工業社製）を１０ｍＬ加え、７０℃で４時間反応させた。反応終了後、遠心分離機（日立製作所社製、「Ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｇ」）を用いて上澄みを除去し、イオン交換水で洗浄した。洗浄後、遠心分離機を用いて上澄みを除去した。このイオン交換水による洗浄を更に４回繰り返し、基材粒子の表面に４級アンモニウム基と３級アミノ基とを有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を得た。

上記イオン交換クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのステンレス製カラム（カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２０ｍｍ）に充填した。

〔参考例３〕イオン交換クロマトグラフィーによるメチル化ＤＮＡの検出
（１）ゲノムＤＮＡの抽出と亜硫酸水素塩処理
患者から得た新鮮凍結組織サンプルを、フェノール−クロロホルムにて処理し、次いで透析を施すことによって、高分子量ＤＮＡを抽出した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、モレキュラークローニング：実験マニュアル 第３版、コールドスプリングハーバー出版、ＮＹ、６．１４〜６．１５ページ 参照）。ＤＮＡ５００ｎｇを、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ^ＴＭキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、亜硫酸水素塩処理に供した。

（２）ＰＣＲ
（１）で得られた亜硫酸水素塩処理ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ １０ｎｇ、ＧｅｎｅＡｍｐ １×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌ ＧｅｎｅＡｍｐ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．７５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマーを含んだ２５μＬの反応液で行った。ＰＣＲでは、９５℃５分間初期熱変性を行った後、９４℃３０秒→５９℃（Ｆ３−Ｒ３プライマー使用時）３０秒→７２℃４０秒を１サイクルとして３５サイクル続け、さらに７２℃１０分の伸張反応を行った。ＰＣＲ終了後、予めｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅを添加した３％アガロースゲルに、反応液５μＬにｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １μＬを混ぜた後アプライして電気泳動し、ＰＣＲ増幅産物を観察して目的のＰＣＲ増幅産物が得られたことを確認した。各プライマーの配列は、表７に示した。

（３）ＨＰＬＣ分析
参考例２で準備したアニオン交換カラムを用いて、以下の条件でイオン交換クロマトグラフィーを行い、（２）で得られた各ＰＣＲ増幅産物を分離検出した。
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｂ ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）＋１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム
分析時間：分析時間は１５分
溶出法：以下のグラジエント条件により溶離液Ｂの混合比率を直線的に増加させた。
０分（溶離液Ｂ４０％）→１０分（溶離液Ｂ１００％）
検体：（２）で得られたＰＣＲ増幅産物
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２６０ｎｍ
試料注入量：５μＬ
カラム温度：７０℃

〔実施例１〕ＤＮＡメチル化率によるクロマトグラフィー保持時間の変動
ＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーターにおける、３９個のＣｐＧサイトを有する３８４ｂｐ領域のＤＮＡ配列に基づいて、３９個のＣｐＧサイト全てがメチル化されているＤＮＡ（１００％メチル化ＤＮＡ）から全くメチル化されていないＤＮＡ（０％メチル化ＤＮＡ）まで、メチル化率の異なる８つのＤＮＡを合成した。なお５０％メチル化ＤＮＡについては、メチル化位置を５'側寄り、３’側寄り、および中央寄りの３パターンのＤＮＡを合成した。各合成ＤＮＡのメチル化率およびＣｐＧアイランドのメチル化数を表８に示す。

上記８つの合成ＤＮＡを、参考例３の手順に従って亜硫酸水素塩処理、ＰＣＲ、およびＨＰＬＣにかけた。合成ＤＮＡ Ｎｏ．１（１００％メチル化）、Ｎｏ．２（０％メチル化）、Ｎｏ．３（２５％メチル化）、Ｎｏ．４（５０％メチル化）およびＮｏ．５（７５％メチル化）についてのＨＰＬＣのクロマトグラムを図１に示す。ＤＮＡメチル化率に従って保持時間の短縮が見られた。さらに、８つのＤＮＡについて、メチル化率に対してＨＰＬＣの保持時間をプロットしたデータを図２に示す。ＨＰＬＣの保持時間は、ＤＮＡメチル化率に対して極めて高い相関を示した。さらに、５０％メチル化ＤＮＡについては、メチル化位置に依らず、ほぼ同一の保持時間を示すことが確認された。このことから、ＤＮＡ中のメチル化位置に依らず、メチル化率に依存して保持時間が決定されることが示された。したがって、ＨＰＬＣの保持時間を測定することにより、サンプルＤＮＡに含まれるメチル化率を測定することができる。

〔実施例２〕腎細胞癌におけるＤＮＡメチル化解析と予後判定
参考例１でＣＩＭＰ判定された腎細胞癌のうち、患者１３人からのＣＩＭＰ陽性腎細胞癌と、５人からのＣＩＭＰ陰性腎細胞癌からゲノムＤＮＡを調製した。参考例３（１）〜（３）の手順に従って、該ＤＮＡを亜硫酸水素塩処理、ＰＣＲ、およびＨＰＬＣにかけた。ＰＣＲでは、ＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーターにおける、３８４ｂｐ領域を増幅した。
さらに、上記ＰＣＲ増幅領域におけるメチル化率が０％（陰性対照）および１００％（陽性対照）のＤＮＡについても、それぞれ同様の手順でＨＰＬＣ分析した。

ＣＩＭＰ陽性およびＣＩＭＰ陰性試料から得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図３に示す。図３には、非メチル化ＤＮＡ（陰性対照）および１００％メチル化ＤＮＡ（陽性対照）のクロマトグラムも表示されている。図３Ａ，ＢはＣＩＭＰ陽性試料のクロマトグラムであり、非メチル化ＤＮＡ（陰性対照）のピークと保持時間の異なるピークが明瞭に出現しており、メチル化ＤＮＡの存在を表している。図３ＣはＣＩＭＰ陰性試料のクロマトグラムであり、そのピークは非メチル化ＤＮＡ（陰性対照）のピークと保持時間においてほとんど区別できず、メチル化ＤＮＡがほぼ存在しないことを示している。図３Ｄは、ＣＩＭＰ陰性試料のクロマトグラムであるが、非メチル化ＤＮＡ（陰性対照）のピークと保持時間の異なるピークが明瞭に出現しており、メチル化ＤＮＡの存在を表している。すなわち、ＣＩＭＰ陰性と判定されていても予後不良の検体である可能性を示唆している。

図４は、本実施例で調べた１８個のＣＩＭＰ陰性／陽性試料全てについて、ＨＰＬＣクロマトグラムのピークの保持時間をプロットした図である。ＣＩＭＰ陰性試料と陽性試料は、保持時間の分布が明らかに異なっていることから、本発明の方法により、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法で判定された癌のＣＩＭＰを、本発明の方法によっても正確に判断できることが明らかにされた。

本実施例にて用いたＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーター３８４ｂｐ領域においては、図４に示されるように保持時間９．３ｍｉｎ付近でＣＩＭＰ陽性群とＣＩＭＰ陰性群とが分かれていることから、保持時間９．３ｍｉｎ付近を基準となる保持時間に設定できる。すなわち、基準となる保持時間（基準保持時間）より早い保持時間に検出シグナルを有する検体は、予後不良であると判定できる。前述の基準保持時間は、ＨＰＬＣの分析条件、ゲノムＤＮＡの領域、あるいは遺伝子マーカーの種類等によってクロマトグラムが変化するので、適切な基準保持時間を設定すればよい。また、必要とされる臨床感度も考慮し、基準保持時間を設定するのが好ましい。

本実施例においては、陽性対照（ＤＮＡメチル化率１００％）の保持時間が約９．０分および陰性対照（ＤＮＡメチル化率０％）の保持時間が約９．３５分であったことから、基準保持時間をもたらす基準ＤＮＡメチル化率は約１７％と計算された。したがって、本実施例にて用いたＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーター３８４ｂｐ領域において、上記基準ＤＮＡメチル化率（約１７％）より高いＤＮＡメチル化率を有する検体は、予後不良であることが示された。

ＭａｓｓＡＲＲＡＹで得られたＤＮＡメチル化率の平均値と、本発明で得られたＤＮＡメチル化率とを比較する。本発明で得られた検出シグナルが図３Ａ，Ｂのような二峰化したピークについて、保持時間（溶出が早いほうの保持時間をａ、遅いほうの保持時間をｂとする）から算出されるＤＮＡメチル化率をプロットし、ＭａｓｓＡＲＲＡＹで得られたＤＮＡメチル化率と比較したものを、図５Ａに示す。図５Ａにおいては、それぞれの方法により得られたＤＮＡメチル化率は相関しているように見えない。しかしながら、保持時間ａと保持時間ｂの平均より算出した合成ピークＣ（保持時間ｃ）から得られるＤＮＡメチル化率をプロットし、同様にＭａｓｓＡＲＲＡＹで得られたＤＮＡメチル化率と比較したものを、図５Ｂに示す。図５Ｂに示されるように、合成ピークＣから算出されるＤＮＡメチル化率は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法で得られたＤＮＡメチル化率の平均値と良好に相関する。

本発明によれば、例えば３０％メチル化ＤＮＡと７０％メチル化ＤＮＡが等量混合された試料と、すべて５０％メチル化ＤＮＡである試料とが、明確にクロマトグラム上で判別できる。それに対し、上記の例においては、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法ではいずれの試料も平均値として５０％メチル化ＤＮＡという情報しか得られない。本発明によれば、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法とは異なり、試料中に含まれる様々なＤＮＡメチル化率のシグナルを分離して検出できることから、平均化されていないＤＮＡメチル化率を得ることができる。

ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、パイロシークエンシング等の方法で得られるＤＮＡメチル化率の値は、測定に供した試料全体の平均値としてのＤＮＡメチル化率が得られるため、結果として、高度にメチル化されたＤＮＡを有する細胞の有無を判定することができないという問題点があった。本発明によれば、ＣＩＭＰ陰性と判定されていても、非メチル化ＤＮＡの影響を除去し、高メチル化ＤＮＡを含むか否かを検出できることから、ＤＮＡメチル化率を低く見積もるリスクが避けられる。さらには、予後不良の疑いのある検体を判定できる。

特許文献４に記載の方法によるＣＩＭＰ判定は、複数の遺伝子マーカーのＣｐＧアイランドを対象にＣｐＧサイトのメチル化を調べてＣＩＭＰ陽性またはＣＩＭＰ陰性を判定していた。本発明によれば、単独の遺伝子マーカーであっても、ＨＰＬＣより得られた検出シグナルを解析することによって、ＣＩＭＰ判定と同等の腎細胞癌の予後判定が容易にできる可能性が示唆された。さらに、複数の遺伝子マーカーについてＨＰＬＣによる検出シグナルを解析することによって、予後判定を高精度化できる可能性が示唆された。

Claims (15)

1. 腎細胞癌を含む組織の判定方法であって：
   （１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
   （２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
   （３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をアニオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
   （４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
   （５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合に、該組織を、予後不良の腎細胞癌患者から得られた腎細胞癌を含む組織であると判定する工程、
   を含む方法。
2. 前記工程（２）において、ＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子におけるＣｐＧアイランドを含む、請求項１記載の方法。
3. 前記工程（２）においてＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーター領域を含む、請求項１記載の方法。
4. 前記工程（２）のＰＣＲにおいて、配列番号５１及び５２で示されるＰＣＲプライマーが使用される、請求項１記載の方法。
5. 前記工程（４）の前に、さらに以下の工程：
   （１’）前記被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅領域に相当するメチル化していないＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
   （２’）工程（１’）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
   （３’）工程（２’）で得られたＰＣＲ増幅産物をアニオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
   （３ａ）工程（３）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルから、工程（３’）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルを差し引いて差分データを得る工程、
   を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 腎細胞癌患者の予後判定方法であって：
   （１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
   （２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
   （３）得られたＰＣＲ増幅産物をアニオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
   （４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
   （５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合に、該被験体の腎細胞癌を予後不良と判定する工程、
   を含む方法。
7. 前記工程（２）において、ＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子におけるＣｐＧアイランドを含む、請求項６記載の方法。
8. 前記工程（２）においてＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーター領域を含む、請求項６記載の方法。
9. 前記工程（２）のＰＣＲにおいて、配列番号５１及び５２で示されるＰＣＲプライマーが使用される、請求項６記載の方法。
10. 前記工程（４）の前に、さらに以下の工程：
    （１’）前記被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅領域に相当するメチル化していないＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
    （２’）工程（１’）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
    （３’）工程（２’）で得られたＰＣＲ増幅産物をアニオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
    （３ａ）工程（３）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルから、工程（３’）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルを差し引いて差分データを得る工程、
    を含む、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
11. 腎細胞癌を含む組織を判定するためのデータを得る方法であって：
    （１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
    （２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
    （３）得られたＰＣＲ増幅産物をアニオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
    （４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
    （５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早いか否かを、該組織が予後不良の腎細胞癌患者から得られた腎細胞癌を含む組織であるか否かを判定するためのデータとして取得する工程、
    を含む方法。
12. 前記工程（２）において、ＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子におけるＣｐＧアイランドを含む、請求項１１記載の方法。
13. 前記工程（２）においてＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーター領域を含む、請求項１１記載の方法。
14. 前記工程（２）のＰＣＲにおいて、配列番号５１及び５２で示されるＰＣＲプライマーが使用される、請求項１１記載の方法。
15. 前記工程（４）の前に、さらに以下の工程：
    （１’）前記被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅領域に相当するメチル化していないＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
    （２’）工程（１’）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
    （３’）工程（２’）で得られたＰＣＲ増幅産物をアニオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
    （３ａ）工程（３）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルから、工程（３’）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルを差し引いて差分データを得る工程、
    を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の方法。

Images